Metodo della goccia sospesa: una tecnica per generare sferoidi di melanoma 3D

- Gli sferoidi sono modelli tridimensionali in vitro di colture cellulari che imitano l'architettura tumorale in vivo e aiutano a studiare le interazioni intra-tumorali. Per impostare la coltura, in primo luogo, preparare una sospensione unicellulare di cellule di melanoma nel terreno appropriato. Quindi, individuare piccoli volumi di questa sospensione cellulare, sufficientemente distanti sulla superficie interna del coperchio di una piastra di coltura sterile e non adesiva. Capovolgere con cautela il coperchio e posizionarlo sulla base del piatto di coltura contenente PBS per creare una camera di idratazione. Incubare la piastra in condizioni appropriate.

L'umidità del PBS impedisce l'evaporazione dei fluidi dalle gocce pendenti. Rinfrescare le gocce sostituendo alcuni microlitri di supporto. A causa della tensione superficiale, le goccioline mantengono la loro forma sferica e rimangono sospese dalla superficie interna della piastra. Le forze gravitazionali facilitano le cellule a rimanere in sospensione senza diffondersi, ma si aggregano per formare sferoidi tridimensionali all'interno delle goccioline. Infine, sciacquare le goccioline con PBS per raccogliere gli sferoidi. Raccoglili in una capsula di coltura non adesiva.

Nel seguente protocollo, dimostreremo la generazione di sferoidi tridimensionali di cellule di melanoma 451-LU tramite il metodo della goccia sospesa.

- Per iniziare, coltivare cellule di melanoma 451-LU utilizzando un terreno RPMI contenente il 10% di FCS, secondo i protocolli generali di coltura cellulare. Per generare sferoidi di melanoma, lavare le cellule di melanoma in coltura in PBS. Quindi, aggiungere 5 millilitri di 1x Tripsina-EDTA in PBS. Incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 5 millilitri di RPMI contenenti il 10% di FCS per neutralizzare la tripsina. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti per raccogliere le cellule. Risospendere il pellet di cella in RPMI contenente il 10% di FCS.

Quindi, contare le cellule e diluire la sospensione cellulare fino a una concentrazione finale di 10.000 cellule per millilitro. Utilizzare una multipipetta elettronica per creare punti di sospensione cellulare da 40 x 25 microlitri sulla superficie interna del coperchio di una piastra per coltura cellulare sterile e non adesiva da 10 centimetri.

Quindi, capovolgere il coperchio con un movimento rapido e fluido e posizionarlo sul piatto di coltura cellulare contenente 5 millilitri di PBS. Coltiva i piatti a goccia appesi a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 10-14 giorni.

Cinque giorni dopo la prima smacchiatura delle gocce, utilizzare un dosatore elettronico per aggiungere 10 microlitri di RPMI contenente il 10% di FCS a ciascuna goccia. Dopo 10-15 giorni, raccogli gli sferoidi sciacquandoli delicatamente dal coperchio con PBS. Raccogli gli sferoidi in una piastra di coltura cellulare fresca e non adesiva.