Isolamento dei cheratinociti della pelle umana: un metodo per coltivare i cheratinociti primari da campioni di pelle

- I cheratinociti sono le cellule più importanti presenti nell'epidermide, o lo strato più esterno della pelle. Si dispongono in più strati sopra il derma, associati a vari altri tipi di cellule come melanociti, cellule dendritiche e cellule di Merkel.

Per isolare i cheratinociti, inizia prelevando il tessuto epidermico dalla pelle umana. Successivamente, trattare con un tampone enzimatico per la digestione. Gli enzimi nel tampone degradano le proteine della matrice extracellulare presenti nel tessuto epidermico, avviando così la dissociazione cellulare. Ora, aggiungi un mezzo adatto e disgrega meccanicamente il tessuto.

Per rilasciare le cellule dissociate in sospensione, filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un colino per rimuovere eventuali grumi o detriti cellulari. Centrifuga per pellettizzare le cellule epidermiche e separarle dal surnatante contenente l'enzima. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule utilizzando un terreno di coltura per cheratinociti preferito. Coltivare le cellule per la durata desiderata.

Durante la coltura, i terreni ottimizzati arricchiscono l'espansione dei cheratinociti promuovendo la loro crescita selettiva rispetto agli altri tipi di cellule epidermiche. Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento dei cheratinociti dal tessuto cutaneo umano adulto.

- Raccogliere campioni di pelle di 10 centimetri per 15 centimetri da volontari adulti sani sottoposti a chirurgia plastica. Mantieni la pelle fresca trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, conservare il campione di pelle a 4 gradi Celsius durante la notte. Usando forbici, bisturi e pinze sterilizzati, rimuovi il grasso da sotto la sezione della pelle.

Quindi, usando gli aghi, allacciare la sezione cutanea su una copertura sterile sopra una piastra. Con una garza asciutta e sterilizzata, pulire la pelle. Quindi, seguire con etanolo al 70% su una garza sterilizzata. Successivamente, utilizzando una pialla per piedi, tagliare lo strato epidermico superiore della sezione cutanea e trasferirlo in una capsula di Petri di 9 centimetri.

Quindi, aggiungere immediatamente 25 millilitri della soluzione DPBS/tripsina/glucosio precedentemente preparata alla capsula di Petri. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione DPBS/tripsina/glucosio dalla capsula di Petri e aggiungere 10 millilitri di RPMI-1640 più il 2% di FBS per inattivare la tripsina.

Ora, con due pinze, rilasciare le cellule epidermiche nel mezzo raschiando delicatamente e agitando sia il compartimento epidermico che quello dermico delle sezioni cutanee. Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico e raccogliere il filtrato in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere le restanti sezioni di pelle in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di RPMI-1640 senza FBS e vorticare per 10 secondi.

Filtrare questa sospensione attraverso il filtro metallico in un tubo da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare epidermica. Quindi, aggiungere DPBS a un volume totale di 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 450 x g a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e, a seconda delle dimensioni del pellet cellulare, risospendere il pellet cellulare epidermico in circa 10 millilitri di 37 gradi Celsius KSFM.

Utilizzando il metodo di colorazione Trypan Blue, contare le cellule al microscopio. Quindi, in ogni pallone di coltura da 75 centimetri quadrati, trasferire 8 volte 10 alla sesta cellula insieme a 12 millilitri di KSFM a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente i palloni di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare i cheratinociti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 100% di umidità e il 5% di CO₂. Cambia il mezzo dopo due giorni, e poi, 3 volte a settimana.