Isolamento delle cellule staminali del melanoma: un metodo per ottenere cellule di melanoma CD133 positive e negative utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

- Il melanoma ospita una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali che possiedono sia capacità di autorinnovamento che di iniziazione del tumore. CD133 o Prominin-1, una glicoproteina transmembrana pentaspan, è uno dei marcatori chiave espressi dalle cellule staminali tumorali del melanoma metastatico. Per isolare le cellule CD133-positive, iniziare con una sospensione di cellule primarie di melanoma in un tampone appropriato.

Incubare con un reagente bloccante contenente proteine che bloccano i siti di legame non specifici sulla superficie cellulare. Trattare le cellule con anticorpi primari CD133 biotinilati. Questi anticorpi si legano agli antigeni CD133 espressi sulle cellule CD133-positive. Ora, aggiungi microsfere magnetiche anti-biotina alla sospensione. Incubare per far sì che le microsfere si leghino alle cellule marcate con biotina.

Infine, far passare la sospensione incubata attraverso una colonna posta in un campo magnetico. Con l'influenza magnetica, tutte le cellule CD133-positive marcate con le microsfere si attaccano alla colonna, mentre le cellule non marcate vi passano attraverso. Raccogli queste cellule CD133-negative non marcate. Rimuovere la colonna dal campo magnetico. Lavare il contenuto utilizzando un tampone adatto per eluire e raccogliere le cellule CD133-positive.

Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento di cellule staminali tumorali CD133-positive e negative da una coltura di melanoma primario ottenuto da tessuto tumorale. Lavare l'80% delle celle confluenti con PBS preriscaldato. Aggiungere una quantità appropriata di Accutase e incubare fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie di coltura. Raccogliere le cellule nel terreno Quantum 263 e trasferirle in una provetta da 50 millilitri.

Enumera le celle. Quindi, centrifugare il numero richiesto di celle per 5 minuti a 300 x g e da 4 a 8 gradi Celsius. Aspirare completamente il surnatante e risospendere fino a 1 volte 10 all'ottava cella in un tampone MACS da 350 microlitri. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante FcR e 50 microlitri di CD133/1-biotina. Mescolare bene e incubare a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Lavare le celle con 10 millilitri di tampone MACS, seguito da centrifugazione per 5 minuti a 300 x g e da 4 a 8 gradi Celsius. Aspirare completamente il surnatante. Dopo un secondo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 400 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 100 microsfere anti-biotina da 100 microlitri e mescolare bene. Incubare a 4-8 gradi Celsius per 15 minuti.

Nel frattempo, per preparare il separatore MACS per la separazione magnetica, collegare il QuadroMACS al MACS Separator Multi Stand. Inserire il numero richiesto di colonne LS con le ali della colonna in avanti nel campo magnetico del QuadroMACS. Posizionare un filtro di pre-separazione in ciascuna colonna LS e una provetta di raccolta appropriata sotto ciascuna colonna.

Sciacquare il filtro e la colonna con 3 millilitri di tampone MACS ed eliminare il flusso. Dopo aver lavato le cellule nel tampone MACS come descritto in precedenza, risospendere le cellule in un tampone MACS da 500 microlitri e applicare la sospensione cellulare sulla colonna LS preparata. Lavare tre volte con 3 millilitri di tampone MACS per colonna. Raccogliere l'effluente totale della frazione cellulare CD133-negativa non marcata.

Quindi, gettare il filtro di pre-separazione, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo di raccolta adatto. Applicare 5 millilitri di tampone MACS. Eliminare immediatamente le cellule CD133-positive marcate spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare la sospensione cellulare su una nuova colonna LS bilanciata e raccogliere la frazione CD133-negativa dell'effluente.

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.