Name: Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri il protocollo per la differenziazione in vivo di cellule staminali embrionali umane mediante impianto sotto la capsula renale di topo immunocompromesso. Questo metodo consente di analizzare la formazione del teratoma e il destino cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca completa del California Institute per la medicina rigenerativa (RC1-00104), un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL085377) da NHLBI, e un dono da parte della Fondazione Pollin di HSB

Il protocollo scritto che segue si basa su parametri pubblicati segnalati dagli autori, con alcune modifiche. Il protocollo è eseguita con l'approvazione del Istituzionali Animal Care UCSF e utilizzo (IACUC) e Cell Stem Oversight di ricerca (SCRO) Comitati. Cultura I. cellule staminali embrionali umane (hESC) <ol><li> HESC crescere in standard 6-bene (3,5 cm di diametro pozzi) piatti. </li><li> Almeno 12 ore prima passaging cellule, mouse fibroblasti semi embrionali (MEF; ottenuti da CF1 giorni e12.5 topi tempo-accoppiati, irradiato a 1000 Ci) alimentatore cellule su piastre rivestite con gelatina 1% (6,7). MEF dovrebbero essere placcato confluenza al 50-60%, o 4 x 10 5 cellule per 3,5 cm di diametro e (Figura 1). </li><li> Celle di passaggio, quando le colonie hanno raggiunto confluenza ~ 70% (Figura 2). </li><li> Per il passaggio, le cellule aspirare KSR terreno di coltura (6) dai pozzetti e sostituirlo con 0,5 ml di mezzo contenente Collagenasi IV KSR ad una concentrazione di 1 mg / ml. </li><li> Incubare le piastre con collagenasi IV a 37 ° C / 5% di CO 2 per 5 minuti o finché i bordi di colonie cominciano a sollevare dal piatto. </li><li> Rimuovere Collagenasi IV dal piatto, aggiungere 0,5 ml di KSR in ogni pozzetto, e manualmente raschiare le cellule per rimuovere completamente dalla piastra. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare da ogni pozzetto, posto in un tubo da 15 ml, e consentono alle cellule di regolare dalla forza di gravità per 5 minuti. </li><li> Eliminare il surnatante dal tubo, lasciando le cellule e medie in un volume totale di ~ 300μl. </li><li> Utilizzando un 200 ul micro-pipetta insieme a tutto volume, con delicatezza pipetta la sospensione cellulare 5-6 volte a rompere le colonie. </li><li> Portare la sospensione cellulare per un volume totale di 9 ml per pozzetto originale di celle usando KSR medio (cioè, se uno così è raccolto, il tubo deve contenere 9 ml). Integrare la media con fattore ricombinante umano fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) ad una concentrazione di 12,5 ng / ml. </li><li> Dopo aver lavato i nuovi pozzi che contiene cellule MEF (vedi punto 2) con fosfato di Dulbecco soluzione salina tamponata (DPBS) per rimuovere tutti i siero, aggiungere 3 ml di sospensione cellulare in ogni pozzetto e incubare le piastre a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Cambiamenti a medio KSR con bFGF 24 ore dopo il passaggio, e ogni 24-48 ore fino a quando le cellule sono pronte per essere diversi passaggi ancora. </li></ol> II. Preparazione di hESC pellet per l'innesto <ol><li> A 24 ore prima del trapianto, aggiungere inibitore ROCK al mezzo KSR ad una concentrazione finale di 10μM per aumentare la vitalità cellulare (8). Un pozzetto di cellule a confluenza ~ 70% (5 x 10 5 cellule) creerà due palline, con due palline inserito per capsula renale. </li><li> Per preparare pellet cellulari per l'innesto (9), incubare trattati con l'inibitore culture ROCK con collagenasi IV per 5 minuti a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il IV Collagenasi dal pozzo e sostituirlo con 1 DPBS ml con 10% di penicillina / streptomicina (pen / strep). </li><li> Raschiare manualmente le colonie dalla piastra, lavare il pozzo con un ulteriore 1 DPBS ml con la penna / strep, e trasferire ciascuna aliquota 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Spin tubi microcentrifuga brevemente a 8.000 x g, aspirare il supernatante e risospendere il pellet in DPBS 500μl con la penna / strep. </li><li> Per aiutare a legare insieme le cellule per il trapianto, aggiungere 100μl 1 mg / ml lectina Phaseolus vulgaris (PHA) in DPBS ad ogni provetta. </li><li> Incubare le cellule / sospensione PHA a temperatura ambiente per 5 minuti, poi girare per 2 minuti a 8.000 x g. Ruotare i tubi a 180 ° all'interno del loro pozzi rotore e ruotare ancora per 2 minuti a 8.000 x g. </li><li> Con attenzione aspirare il sopranatante lasciando intatto il pellet. </li><li> Sloggiare i pellet cellulari dai tubi pipettando gentilmente KSR 200μl accanto al bordo del pellet fino a che non solleva lentamente. </li><li> Una volta rimosso, trasferire immediatamente il pellet a 0.4μm inserti MILLICELL collocati in pozzi cm 3.5 di diametro contenente 3 KSR ml, e incubare per 2 ore per tutta la notte a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol> III. Capsula renale innesto <ol><li> Eseguire tutte le procedure animali in conformità con le linee guida istituzionali con le necessarie tecniche asettiche. </li><li> Anestetizzare topi SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid LYST bg / CRL), di età compresa tra 8-12 settimane, utilizzando una combinazione di O2: 3% per via inalatoria isoflurane/0.5% e tribromoethanol intraperitoneale (Avertin; 25 mg / kg, preparati al momento). Due pellet cellulari per il mouse sarà innestata mediante le tecniche descritte (10). </li><li> Dopo aver posizionato il mouse su una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia, radere l'area incisione, poi disinfettare con clorexidina. Fai da 2,5 centimetri un'incisione attraverso la pelle, appena fuori del centro, ma in parallelo alla colonna vertebrale. </li><li> Mantenere la zona umida con incisione sterile Salinposta, fare una piccola incisione attraverso il muscolo, appena sotto le costole e ~ 1 cm dalla colonna vertebrale. L'incisione dovrebbe essere appena sufficiente per tirare il rene attraverso, ma abbastanza piccolo che il rene non scivolare indietro nella cavità addominale senza forza. </li><li> Tirare delicatamente il rene attraverso l'incisione del muscolo utilizzando una pipetta Pasteur di vetro che è stato tirato in forma di un ottuso, gancio leggermente ricurva. </li><li> Bagnate il rene con DPBS sterile per evitare che la capsula si secchi. Questo può essere necessario ripetere tutta la procedura, in quanto la capsula è molto fragile. </li><li> Utilizzando Dumont pinze # 5, estrarre delicatamente la capsula fino dal rene e fare una incisione 2 millimetri con le forbici a molla Vännäs. </li><li> Con un'altra pipetta di vetro che è stato tirato in un finissimo, sonda smussata, fare una piccola tasca tra la capsula e il rene. </li><li> Utilizzando un grande orifizio puntale posizionato su una pipetta di trasferimento monouso, prendere una sola cella di pellet da inserire MILLICELL. Assicurati di prendere il meno mezzi di comunicazione più lungo possibile, come supporti in eccesso possono interferire con il trasferimento a pellet. </li><li> Tenendo premuto il bordo dell'incisione per creare la tasca, poggiate delicatamente il pellet accanto alla apertura e spingerlo nella tasca verso un polo del rene con la pipetta tirato. </li><li> Ripetere la procedura con un secondo pellet. Inserire questo sotto la capsula del rene stesso, ma verso il polo opposto. </li><li> Accuratamente posto la capsula posteriore verso il basso sulla pellet. Il pellet deve rimanere all'interno della tasca, e non sono necessari punti di sutura per chiudere la capsula. </li><li> Spingere delicatamente il rene indietro nella cavità addominale e chiudere la parete muscolare con punti di sutura in seta 4-0 (o inferiore) con annesso reverse-taglio ago. L'incisione dovrebbe essere abbastanza piccolo che solo una sutura singola è necessario. </li><li> Chiudere la pelle con una serie di 4-5 punti interrotta, utilizzando lo stesso materiale di sutura. </li><li> Prima di posizionare il mouse indietro nella sua gabbia, amministrare 0,05 mg / kg di buprenorfina (11,12) e 5 mg / kg di ketoprofene (12,13) ​​come analgesici a breve termine ea lungo termine, rispettivamente. Sostanze controllate dovrebbe essere utilizzato solo in conformità alle direttive istituzionali. </li><li> Trasferire l'animale alla sua gabbia e permettono di recuperare da anestesia su una piastra elettrica. Questo dovrebbe prendere circa 20-30 minuti. </li><li> Una volta che il mouse è completamente ambulatoriale, può essere restituito alla struttura stabulazione degli animali. </li></ol> IV. Teratoma raccolta, fissazione e sezionamento <ol><li> A 8-12 settimane post-intervento chirurgico, ci dovrebbe essere un teratoma appena palpabile in prossimità del rene. Grande, pieno di liquido cisti si sviluppano spesso pure, a partire da 6-8 settimane. Questi possono richiedere un raccolto prima se causano disagi all'animale. Dal teratomi crescere a ritmi più lenti rispetto cisti, però, si vuole aspettare più a lungo possibile per ottenere un teratoma di dimensioni sufficienti per l'analisi (cioè, almeno 8 settimane). </li><li> Rimuovere il rene, teratoma, e qualsiasi cisti che circonda come un blocco di tessuto dalla cavità addominale utilizzando lo stesso approccio chirurgico mediante il quale il rene è stato originariamente accessibile (cfr. Sezione III, i passaggi 1-4 sopra). </li><li> Posizionare l'intero blocco di tessuto asportato in una provetta contenente formalina tamponata al 10%. </li><li> Lasciare che il teratoma per fissare una notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, togliere il teratoma dal tubo. Sezionare via qualsiasi cisti renali e per quanto possibile, senza danneggiare il teratoma stesso (Figura 3). Grandi teratomi possono essere tagliati a metà per facilitare la dissezione e incorporamento. </li><li> Elaborare il teratoma utilizzando uno standard di paraffina fissazione tecnica. Unità automatiche sono disponibili (ad esempio, Hypercenter Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Flex 80% di alcol </td><td> 2 ore </td></tr><tr><td> II. </td><td> Flex 80% di alcol </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> III. </td><td> Flex 85% di alcol </td><td> 1,5 ore </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% di alcol Flex </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% Flex alcool </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% Flex alcool </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% Flex alcool </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffina (TissuePrep) </td><td> 2 ore </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffina (TissuePrep) </td><td> 2 ore </td></tr></tbody></table></li></ol> V. immunoistochimica e analisi <ol><li> Una volta inclusi in paraffina, sezione teratoma a 5 micron fette di serie con un microtomo rotativo, e le sezioni galleggiante su vetrini. </li><li> Prima della colorazione, cuocere le diapositive per almeno un'ora. </li><li> Macchiare le diapositive con ematossilina e eosina utilizzando metodi standard per identificare le strutture del tessuto rappresentante di ciascuno dei tre strati germinali embrionali (Figura 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavare Xilene </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xilene </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100% di alcol </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100% di alcol </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% di alcol </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% di alcol </td><td> 3-5 minuti </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Acqua di lavaggio (diverse modifiche) </td><td> 2 minuti </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Ematossilina di Gill # 3 </td><td> 2-5 minuti </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Acqua di lavaggio (diverse modifiche) </td><td> finché l'acqua non è pulita </td></tr><tr><td> X. </td><td> Acqua di Scott (per nuclei blu) </td><td> 3 minuti o più </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Acqua di lavaggio (diverse modifiche) </td><td> 1-2 minuti </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosina Y </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Acqua di lavaggio (diverse modifiche) </td><td> 30 secondi </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% di alcol </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% di alcol </td><td> 2 minuti </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% di alcol </td><td> 2 minuti </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100% di alcol </td><td> 3 minuti </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% di alcol (pulito) </td><td> 3 minuti </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xilene </td><td> 2 minuti o più </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xilene </td><td> 2 minuti o più </td></tr></tbody></table></li><li> Montare un coprioggetti su ogni diapositiva con Permount. </li></ol> VI. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Placcatura di fibroblasti di topo irradiati CF1 embrionale come strato alimentatore per hESC coltura indifferenziato. MEF sono placcati in confluenza ~ 50%, come mostrato qui, o 4 x 10 5 cellule per 3,5 cm di diametro e in un 6-ben piatto cultura. Bar, 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esempio di cultura subconfluent di hESC indifferenziata su uno strato di alimentatore MEF. HESC sono coltivate su livelli alimentatore MEF fino a ~ 70% confluenti, come mostrato qui, poi diversi passaggi come descritto. Bar, 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esempio di teratomi espiantati. Seguito espianto, il teratoma, il rene, e qualsiasi tessuto accessorio sono fissati come un blocco in formalina, poi il tessuto dei reni e accessori sono mondate accuratamente via prima inclusione in paraffina. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Teratomi derivati ​​da hESC indifferenziato contenere rappresentante tessuti di tutti i tre foglietti embrionali in vivo. Un teratoma, come quello illustrato nella Figura 3, è stato sezionato e colorati con ematossilina e eosina per identificare i tessuti embrionali. hESC dare origine a tessuti derivati ​​da tutti e tre i foglietti embrionali embrionali (ectoderma (A, B), mesoderma (C), endoderma (D). (A) nascente struttura del tubo neurale. (B) epitelio squamoso primitivo. (C) Cartilagine circondato da capsula del mesenchima condensato. (D) la struttura ghiandolare intestinale. Bar, 100 micron. Le immagini riprodotte con l'autorizzazione dell'autore. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Analisi teratoma può essere utilizzato per mappare il destino di tag, hESC indifferenziato. Come precedentemente pubblicato (9), una miscela di hESC specificamente taggati con hESC senza tag può essere utilizzato per mappare il destino delle cellule tag in un test di formazione teratoma. Come mostrato qui, hESC indifferenziato che esprime il marcatore di superficie, CD133, e contrassegnati con maggiore proteina verde fluorescente (eGFP), sono state mescolate con untagged, hESC indifferenziato. Questi sono stati usati per formare teratomi dalla capsula renale innesto. Analisi immunoistochimica di ematossilina e eosina-macchiate sezioni teratoma con anticorpi anti-eGFP dimostra il destino neuroectodermici del hESC CD133 +. Teratomi sono stati trattati come in Figura 4 e di contrasto con anticorpi anti-eGFP (marrone) per la localizzazione dei derivati ​​di cellule CD133 + GFP + all'interno dei tessuti. CD133 + derivate cellule (frecce) sono stati osservati nei tessuti derivanti da ectoderma embrionale, in particolare epitelio neurale (a sinistra) e la nascente tubo neurale-come le strutture (a destra). Bar, 100 micron. Le immagini riprodotte con l'autorizzazione dell'autore. Gelatina <ul><li> 0,1% di gelatina suina </li><li> 99,9% DPBS <ul><li> Aggiungere la gelatina alla DPBS, incubare a 37 ° C per un'ora o fino a quando tutti i gelatina va in soluzione e filtrare sterilizzare (0.22μm) prima dell'uso. </li></ul></li></ul> MEF media <ul><li> 10% di siero fetale bovino (qualificata) </li><li> 90% Dulbecco Modified Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutammina </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filtro sterilizzare prima dell'uso. </li></ul></li></ul> KSR (Sostituzione Knockout siero) di medie <ul><li> 20% KnockOut sostituzione siero </li><li> KnockOut 80% di D-MEM </li><li> 1x L-Glutammina </li><li> 1x Amino Acids non essenziali </li><li> 0.1 mM β-mercaptoetanolo / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filtro sterilizzare. </li><li> Conservare a 4 ° C, ma calda a 37 ° C prima di aggiungere alle cellule. </li><li> Aggiungi bFGF immediatamente prima dell'uso. </li></ul></li></ul> Collagenasi IV <ul><li> Sciogliere 1 mg / ml nel terreno di KSR mettendo a 37 ° C per 1-2 ore o fino a quando tutta la polvere entra in soluzione. </li><li> Filtro sterilizzare. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-tribromoethanol </li><li> 0,25 ml di 2-metil-2-butanolo <ul><li> Incubare a 37 ° C per una notte per formare una soluzione al 100%. </li><li> Diverse ore prima dell'intervento chirurgico, soluzione diluita al 2,5% di lavoro utilizzando DPBS e incubare a 37 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Filtro sterilizzare e aliquota. </li><li> Tribromoethanol è altamente sensibile alla luce, in modo da proteggere dalla luce in tutte le fasi di preparazione e di utilizzo. </li><li> Preparare non più di 12-24 ore prima dell'uso. </li></ul></li></ul> Buprenorfina <ul><li> 1 mg / ml di soluzione concentrata in metanolo <ul><li> Diluire a 0,015 mg / ml di soluzione sterile di lavoro con H 2 O. </li><li> Conservare a -20 ° C fino a 1 mese. </li></ul></li></ul> Ketoprofene <ul><li> 0,5 mg / ml di soluzione di lavoro nel DPBS <ul><li> Aggiungi DPBS, incubare una notte a 37 ° C per 1-2 ore o fino a quando tutta la polvere entra in soluzione. </li><li> Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo adattato un saggio altamente efficiente per la formazione teratoma ai fini della mappatura del destino di differenziare hESC in un ambiente nel vivo. Un piccolo numero di hESC appositamente selezionato viene mescolato con indifferenziato hESC wild-type e la lectina Phaseolus vulgaris a formare un pellet di cellule. Questo si innesta sotto la capsula del rene in un mouse immunodeficienti. Il destino del hESC selezionati in origine può essere determinata mediante immunoistochimica (Figura 5), come riportato in precedenza (9). Questo metodo fornisce un prezioso strumento per l&#39;individuazione e la generazione di tessuti specifici reagenti per la terapia cellulare.

<table><tbody><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>Suture di seta 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta Dupont n. 5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Capsula renale</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (qualificato)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Alcol flessibile</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s Ematossilina n. 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Emostato, dritto</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Chirurgia generale</td></tr><tr><td>Pinze per iride</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Chirurgia generale</td></tr><tr><td>Ketoprofene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>Inserti MILLICELL</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi operatori</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Chirurgia generale</td></tr><tr><td>Paraffina (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>inibitore della ROCK</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Topi SCID beige</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Lavaggio</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>forbici a molla di Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Capsula renale</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Cellule staminali embrionali umane (hESC) hanno una capacità illimitata di auto-rinnovamento, e la capacità di differenziarsi in cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrionali embrionali (1). Regia di hESC differenziazione in tipi cellulari specifici ha suscitato molto interesse nel campo della medicina rigenerativa (ad esempio, (2-5)) e metodi per la determinazione della<em&gt; In vivo</emDestino&gt; di hESC selezionati o manipolati sono essenziali per questa impresa. Abbiamo adattato un saggio altamente efficiente formazione teratoma per questo scopo. Un piccolo numero di hESC appositamente selezionato viene mescolato con indifferenziato hESC wild-type e la lectina Phaseolus vulgaris a formare un pellet di cellule. Questo si innesta sotto la capsula del rene in un mouse immunodeficienti. Da un minimo di 2,5 x 10<sup&gt; 5</supHESC&gt; sono necessari per formare un 16 centimetri<sup&gt; 3</supTeratoma&gt; entro 8-12 settimane. Il destino del hESC selezionati in origine può essere determinata mediante immunoistochimica. Questo metodo fornisce un prezioso strumento per la caratterizzazione di tessuto-specifici reagenti per la terapia cellulare.

Regia di hESC differenziazione in cellule specifiche, ha generato molto interesse nella medicina rigenerativa. Forniamo un conciso, passo-passo il protocollo per la determinazione della<em&gt; In vivo</emDestino&gt; di hESC selezionato che fornisce un valido strumento per la caratterizzazione di tessuto-specifici reagenti per la terapia cellulare.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) possiedono una capacità illimitata di autorinnovamento e la capacità di differenziarsi in cellule derivate da tutti e tre i...

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare in vivo le cellule staminali embrionali umane e determinare i loro destini specifici nei tessuti. Questo viene ottenuto innanzitutto creando un pellet a partire da cellule d'interesse geneticamente marcate. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'inserire chirurgicamente il pellet sotto la capsula renale di un topo immunocompromesso.Il terzo passaggio della procedura consiste nel permettere al pellet cellulare di differenziarsi per otto-dodici settimane sotto la capsula del rene del topo. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel raccogliere il teratoma risultante, fissarlo con formalina e analizzare il destino delle cellule marcate mediante immunoeistochimica. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano le cellule marcate in via di sviluppo in uno o più dei tre strati germinativi, attraverso l'analisi istologica e immunoeistochimica dei teratomi ottenuti.Ciao, sono Carissa Ritner del laboratorio del Dottor Harold Bernstein presso l'Istituto di Ricerca Cardiovascolare dell'Università della California a San Francisco. Oggi vi mostreremo un procedimento per sviluppare teratomi mediante innesto sotto la capsula renale. Utilizziamo questo metodo nel nostro laboratorio per studiare la differenziazione delle cellule staminali embrionali, sia per verificare che ogni linea con cui lavoriamo possa svilupparsi in ciascuno dei tre strati germinativi, sia per tracciare il destino di cellule staminali marcate geneticamente in vivo.Tutte le procedure che vi mostreremo vengono effettuate con l'approvazione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto UCSF. Inoltre, tutti i lavori con cellule staminali embrionali umane vengono eseguiti con l'approvazione del Comitato di Supervisione per la Ricerca sulle Cellule Staminali dell'UCSF. Cominciamo dunque.Per preparare colture di cellule staminali embrionali umane, fare riferimento alla sezione testuale del presente protocollo. Per le note in un capo a flusso laminare, trattare le colture di cellule staminali embrionali umane trattate con inibitore della rock con un milligrammo per millilitro di collagenasi quattro, incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aspirare la collagenasi quattro dal pozzetto. Sostituirla con un millilitro di DPBS a temperatura ambiente integrato con 10% di penicillina-streptomicina.Utilizzare un distaccatore cellulare a punta piatta per raschiare le colonie dalla piastra e trasferire 0,5 millilitri della sospensione cellulare in ciascuna di due provette da microcentrifuga. Risciacquare la pozzetta con un millilitro di DPBS e trasferire 0,5 millilitri del risciacquo in ciascuna provetta. Centrifugare le provette per 20 secondi a 8.000 ×g, aspirare il soprannatante e risospendere ogni pellet in 500 microlitri di DPBS fresco contenente 100 microlitri di una soluzione da un milligrammo per millilitro.Lettina di Fasi vulgaris in DPBS in ogni provetta per favorire l'aggregazione delle cellule prima del trapianto. Incubare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare le cellule a 8.000 ×g per due minuti per ottenere un pellet uniforme.Ruotare le provette di 180 gradi all'interno dei loro alloggiamenti nel rotore. Quindi centrifugare nuovamente a 8.000 volte la forza di gravità per due minuti.Aspirare con attenzione il SUP nasin, lasciando intatti i pellet per staccarli dal tubo. Pipettare delicatamente 200 microlitri di mezzo KSR lungo il bordo del pellet finché questo non si solleva lentamente. Una volta staccato il pellet, aspirare immediatamente il mezzo in una milli cell da 0,4 micrometri.Inserire in una pozzetta tre millilitri di KSR.Medium. Incubare da due ore a tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Posizionare un topo immunodeficiente anestetizzato su un tappetino riscaldante per prevenire l'ipotermia.Utilizzare forbici chirurgiche e pinze ad iris per praticare un'incisione di 2,5 centimetri attraverso la cute, parallela alla spina dorsale ma leggermente spostata rispetto al centro. Praticare un'incisione più piccola attraverso il muscolo appena sotto le costole e a circa un centimetro dalla spina dorsale.L'incisione deve essere abbastanza grande da permettere il passaggio del rene, ma sufficientemente piccola da impedire che il rene scivoli nuovamente nella cavità addominale senza l'applicazione di forza. Utilizzando una pipetta per pasta modellata a forma di gancio smussato, estrarre delicatamente il rene attraverso l'incisione muscolare. Bagnare periodicamente il rene con DPBS sterile per evitare che la capsula fragile si secchi, usando pinzette fini.Estrarre delicatamente la capsula dal rene. Utilizzare forbici a molla di Venezia per praticare un'incisione di due millimetri nella capsula. Al centro del rene, inserire una pipetta per pasta che è stata tirata fino a formare una sonda fine e smussata, posizionandola tra la capsula e il rene, quindi muoverla delicatamente per creare una piccola tasca; ripetere sull'altro lato del rene in modo da ottenere due tasche.Uno su ciascun polo del rene. Utilizzando una punta per pipetta a grande diametro su un dispositivo di trasferimento monouso, prelevare con la pipetta un singolo pellet dall'inserzione milli cell.Prelevare la minima quantità possibile di mezzo, poiché l'eccesso può interferire con il trasferimento del pellet. Utilizzare pinzette per sollevare il bordo della tasca sul rene. Posizionare delicatamente il pellet accanto all'apertura e utilizzare la punta della pipetta tirata per spingerlo all'interno della tasca verso uno dei poli del rene.Posizionare un secondo pellet nella tasca verso il polo opposto. Riposizionare con attenzione la capsula sui pellet. Non sono necessarie suture per chiudere la capsula.Utilizzare una pipetta ricurva per spingere delicatamente il rene all'interno della cavità addominale. L'incisione muscolare deve essere abbastanza piccola da poter essere chiusa con un singolo punto di sutura in seta. Chiudere la cute con una serie di quattro o cinque punti separati e permettere all'animale di riprendersi dall'intervento chirurgico prima di riportarlo al ricovero per animali otto-dodici settimane dopo l'intervento.Rimuovere il teratoma renale e eventuali cisti circostanti dalla cavità addominale come un blocco di tessuto. Posizionare l'intero blocco di tessuto escisso in un tubo in polipropilene da 50 millilitri contenente formula tamponata al 10%. Lasciare fissare il teratoma a quattro gradi Celsius durante la notte.Rimuovere il teratoma dal tubo e posizionarlo su un tappetino. Utilizzare un bisturi per dissezionare eventuali cisti e la maggior quantità possibile di tessuto renale senza danneggiare il teratoma stesso. I teratomi di maggiori dimensioni possono essere tagliati a metà per facilitare la dissezione e l'inclusione.Elaborare il teratoma utilizzando la tecnica standard di fissazione in paraffina e colorare le sezioni montate su vetrini per l'analisi e l'acquisizione delle immagini. Per ulteriori dettagli, consultare le note nella sezione testuale del protocollo. Qui mostreremo sezioni di tessuto provenienti da un teratoma tipico.Questo teratoma è stato colorato con ematossilina ed eosina per identificare i tessuti embrionali, rappresentativi di tutti e tre i foglietti germinativi, e mostra una struttura di tubo neurale iniziale rappresentativa dell'ectoderma. Questa sezione fornisce un altro esempio di ectoderma, in questo caso un epitelio squamoso primitivo. Qui, la cartilagine circondata da una capsula di mesenchima condensato rappresenta tessuti derivati dal mesoderma embrionale.Infine, questa sezione che mostra una struttura intestinale ghiandolare dimostra il tessuto dermico terminale all'interno del teratoma, utilizzato per tracciare il destino delle cellule staminali marcate geneticamente. I teratomi sono stati inoculati con una miscela di cellule staminali embrionali umane di tipo selvaggio e positive per CD133. Le cellule derivate positive per CD133, indicate dalle frecce, sono state osservate in tessuti derivati dall'endoderma embrionale, in particolare nell'epitelio neuroectodermico e in strutture simili al tubo neurale in fase iniziale. Sono il dottor Harold Bernstein.Carissa ti ha appena mostrato come formare teratomi da colture di cellule staminali embrionali umane per ottenere un saggio di sviluppo in vivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di trattare con cura le cellule e prestare attenzione alla tecnica asettica. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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