Transgenesi vettoriale miniCoopR: una tecnica per lo screening dei geni che inducono il melanoma nel modello tumorale di zebrafish

- Nel pesce zebra, il melanoma deriva dalla trasformazione maligna dei melanociti, le cellule produttrici di melanina. Per studiare l'insorgenza del melanoma, utilizzare un modello di zebrafish transgenico con deficit di melanociti incline al melanoma. Questo modello manca di melanociti a causa di una mutazione con perdita di funzione nel suo promotore mitfa specifico per i melanociti.

Inizia prendendo un embrione unicellulare di questo modello transgenico su una piastra di agar. Co-iniettare nell'embrione una miscela contenente un vettore miniCoopR basato su trasposoni e trasporre l'mRNA dell'enzima. Il vettore contiene una cassetta genica, comprendente un minigene mitfa portatore di promotori accoppiato a un gene candidato inserito tra due elementi trasposoni.

Gli mRNA co-iniettati codificano per le proteine della trasposasi. Queste proteine agiscono sugli elementi del trasposone e catalizzano l'escissione della cassetta dal vettore miniCoopR, seguita dalla sua integrazione nel DNA genomico dell'embrione. Successivamente, il promotore della cassetta guida l'espressione sia del gene mitfa che del gene candidato di interesse.

Il gene mitfa supporta il salvataggio e lo sviluppo dei melanociti, mentre il gene candidato, se oncogeno, induce l'insorgenza del melanoma. Schermo il pesce zebra sviluppato. I pesci transgenici con melanociti salvati sviluppano pigmentazione di melanina, mentre quelli portatori di melanomi portano lesioni pigmentate in rilievo.

Nel seguente protocollo, mostreremo lo screening dei modificatori di insorgenza del melanoma utilizzando vettori miniCoopR in modelli tumorali transgenici di zebrafish.

- Per generare costrutti per l'iniezione, iniziare creando cloni di ingresso centrale Gateway mediante PCR, amplificando il frame di lettura aperto a lunghezza intera dei geni di interesse e ricombinandoli in pDONR221. Quindi, utilizzare la tecnologia Multisite Gateway per ricombinare il promotore mitfa specifico dei melanociti, il gene di interesse e il segnale di poliadenilazione nel vettore miniCoopR per porre i geni di interesse sotto il controllo del promotore mitfa.

Iniettare 25 picogrammi di ciascun clone insieme a 25 picogrammi di mRNA della trasposasi Tol2 in embrioni di zebrafish unicellulari, transgenici, triplo omozigote. Gli animali mutanti mitfa-BRAF-p53 sono carenti di melanociti e inclini alla trasformazione e alla formazione di melanoma. Insieme al gene di interesse, il vettore miniCoopR contiene un minigene mitfa di salvataggio. Quindi, gli animali iniettati con successo svilupperanno melanociti salvati, che esprimono il gene di interesse.

Incubare gli embrioni iniettati a 28,5 gradi Celsius. A 24 ore dalla fecondazione, o hpf, rimuovi tutti gli embrioni morti. A 72 ore dalla fecondazione, utilizzando un microscopio da dissezione in luce incidente su sfondo bianco, selezionare animali transgenici con melanociti salvati.

Quando gli animali raggiungono i 4 giorni dopo la fecondazione, trasferirli in vasche da 3 litri nella nursery della struttura per il pesce zebra. A 2 mesi di età, selezionare gli animali con almeno un'area di salvataggio dei melanociti superiore a 4 millimetri quadrati. Screening settimanale degli animali selezionati per la presenza di tumori. Isolare gli animali portatori di tumore per lo studio.

Disegna le curve di sopravvivenza libera da melanoma con l'età e le settimane sull'ascissa e la percentuale di sopravvivenza libera da melanoma sull'ordinata. Confrontare gli animali con i melanociti che esprimono un gene di interesse per controllare gli animali che esprimono EGFP nei melanociti. Utilizzare un test di rango logaritmico per determinare se le due curve sono statisticamente diverse.