Primer-Free Selezione aptamero utilizzando una libreria di DNA casuale

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli aberi da una libreria casuale, che si legano specificamente a una proteina bersaglio in questo caso, la proteina S 100 B. Ciò si ottiene digerendo prima la libreria con l'endonucleasi di restrizione per liberare sequenze casuali da sequenze di primer fisse fiancheggiate. Il secondo passo della procedura consiste nel legare le sequenze casuali della libreria alla proteina S 100 B purificata e recuperarle.

La terza fase della procedura consiste nel riunire le sequenze legate con sequenze di primer fisse mediante ibridazione e legatura. La fase finale della procedura consiste nel trascrivere i prodotti legati per consentire la riamplificazione R-T-P-C-R del pool legato di aber candidati, seguita da ulteriori cicli di questa procedura di selezione. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il legame specifico di abers selezionati alla proteina S 100 B.

Ad esempio, qui, i saggi di legame a sandwich vengono eseguiti utilizzando microarray e i saggi di secondo abers marcati in fluorescenza vengono eseguiti anche utilizzando nanofili funzionalizzati e secondi abers accoppiati a nanoparticelle d'oro a 15 nanometri. Oggi mostreremo una procedura per la selezione di ottimi, che si legano alla proteina S cento B da una libreria casuale di sequenze D. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per una varietà di scopi, tra cui lo sviluppo di una piattaforma di sensori per la diagnosi precoce del cancro.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, generare una libreria di DNA senza primer o PF come descritto in precedenza. La scissione della libreria di DNA a doppio filamento seguita dalla purificazione del gel con un gel di poliacrilammide denaturante al 10% risulterà in un frammento di 32 nucleotidi di cinque fosfato primario in 30 cc e un frammento di 30 nucleotidi di cinque fosfato primario in 30, designati rispettivamente come frammento 32 plus e 30 plus.

Il frammento 32 plus contiene il dominio casuale a 30 nucleotidi con la sequenza fiancheggiante minima CC alle tre estremità prime, mentre il frammento a 30 plus è costituito solo dalla sequenza del dominio casuale a 30 nucleotidi. Per preparare i frammenti di DNA della libreria PF per la selezione apr, sospendere ciascuno dei 32 e 30 frammenti in 40 microlitri di 20 milli tris, HCL pH 7,4. Quindi riscaldare i campioni per tre minuti a 85 gradi Celsius dopo l'incubazione.

Raffreddare, i campioni per tre minuti in un incubatore a bagnomaria a 37 gradi Celsius, quindi a 760 microlitri di selezione, tamponare e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, mantenere il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, passare la soluzione attraverso una colonna contenente perle di nichel NTA agro prelavate con tampone di selezione.

Per rimuovere il DNA aspecifico, raccogliere i frammenti di DNA della libreria PF che non si legano alla colonna e metterli da parte per dopo. Per preparare le perle legate S 100 B, centrifugare prima 400 microlitri di perle di nichel NDA per tre secondi in una microcentrifuga e scartare il surnatante. Quindi lavare le perle con 400 microlitri di tampone legante pipettando delicatamente cinque volte.

Quindi centrifugare le perline e scartare il surnatante. Ripeti l'operazione. Lavare due volte.

Successivamente, la proteina povera precedentemente purificata con istidina ha etichettato le perline. Qui, legame umano del calcio S 100. La proteina B viene utilizzata delicatamente pipettare la soluzione su e giù cinque volte ogni tre minuti per un totale di 15 minuti.

Dopo 15 minuti, girare le perline e scartare il surnatante. Infine, lavare la perlina rilegata S 100 B con 400 microlitri di tampone di selezione accarezzando delicatamente su e giù tre volte. Ancora una volta, gira le perline verso il basso e scarta il surnatante.

Ripetere questo passaggio due volte per un totale di tre lavaggi finali da selezionare per gli abers legati S 100 B. Recupera i 32 e 30 frammenti che sono stati precedentemente messi da parte. Aggiungere i frammenti alla perlina legata S 100 B.Quindi incubare il campione per 15 minuti.

Miscelare ogni tre minuti pipettando delicatamente su e giù dopo 15 minuti, centrifugare brevemente le perline, eliminare il surnatante, quindi lavare il complesso S 100 BDNA con 800 microlitri di tampone di selezione pipettando delicatamente. Quindi girare le perline verso il basso e scartare il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio due volte.

Per recuperare l'S 100, essere selezionato abers a 200 microlitri di tris da 20 millimolari, HCL pH 7,4 alle perle. Quindi scaldare l'impasto per tre minuti a 85 gradi Celsius. Dopo l'incubazione.

Agitare le perline per un minuto e farle girare verso il basso. Quindi trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Ripeti questo passaggio una volta e unisci i surnatanti.

Infine, purificare i frammenti di DNA selezionati. Estrarre due volte i prodotti della PCR con un volume equivalente di fenil cloroformio, alcol isopropilico. Precipitali con 250 millimolari di cloruro di sodio e 2,5 volte il volume di etanolo al 100% a meno 70 gradi Celsius per 15 minuti.

Gira verso il basso a 21.000 GS a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi scartare il surnatante. Sciacquare efficacemente il pellet con etanolo al 75%.

Girare a 21.000 GS a quattro gradi Celsius per cinque minuti e scartare il surnatante. Asciugare il pellet in tempo libero per tre minuti Dopo 10 giri di selezione. Clonare i frammenti di DNA amplificato con PCR risultanti nel vettore topografico PCR 2.1 ottenuto da un nucleo di vitrogeno.

Quindi sequenziare tra 40 e 50 colonie singole per ciascuno dei frammenti N 30 cc e N 30 selezionati con l'innesco M 13 in avanti. Allinea le sequenze selezionate utilizzando il software infomax vector NTI. Quindi determina le sequenze di consenso in base agli allineamenti.

Una volta identificate le sequenze di consenso, acquista il consenso come descritto nel protocollo scritto. Sospendere il primo aptamero sintetizzato con cinque prime Amin C sei porzioni in tampone di stampa ad una concentrazione finale di 15 micromolari. Quindi individuare la soluzione aptamero su vetrini attivati dal collegamento di codice utilizzando un array di microgriglie per scoperte apogene.

Di seguito sono riportati i protocolli consigliati per il collegamento al codice. Stampa ogni diapositiva con 12 matrici. Usa un formato due per otto.

Cassetta di ibridazione microarray per ibridazione. Diluire la proteina S 100 B alla concentrazione appropriata in 70 microlitri di PBS. Quindi applicare la soluzione ai pozzetti della cassetta del microarray.

Sigillare la cassetta del microarray utilizzando un foglio adesivo per controsoffitto privo di nucleasi per evitare l'evaporazione. Lasciare che la proteina si leghi agli abers stampati sul link del codice. Scivolare per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione individuale.

Lavare i pozzetti della cassetta tre volte con PBS cinque millimolari di cloruro di magnesio o PBSM. Successivamente, diluire il secondo abers marcato in fluorescenza a 0,125 micromolari in 70 microlitri di PBSM. Scaldare il composto per tre minuti a 85 gradi Celsius.

Quindi lasciare raffreddare l'ABERS etichettato con ghiaccio. Per tre minuti, applicare gli abers sui pozzetti della cassetta microarray. Anche in questo caso, sigillare la cassetta con la pellicola adesiva e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Di nuovo, individualmente. Lavare i pozzetti tre volte con PBSM dopo il lavaggio. Smontare la cassetta e sciacquare l'intera diapositiva con PBSM.

Quindi asciugare accuratamente il vetrino mediante centrifugazione. Infine, eseguire la scansione del vetrino utilizzando un array di scansione Packard Biosciences. Il legame di 4.000 XL è stato determinato per gamma P 32 A TP cinque aptameri marcati con estremità primaria alla proteina S 100 B e confrontato la concentrazione per la determinazione di KD.

I kds rappresentativi dopo circa sette cicli di selezione sono tipicamente nell'intervallo da 10 a sette molari negativi. Cinque aptameri dert first sono stati accoppiati a microarray di code link, la proteina S 100 B purificata è stata legata al primo optimer e LOR 5 46 marcata al secondo. Optimer è stato legato ai primi complessi optimer S 100 B.

La fluorescenza è stata quantificata utilizzando uno scanner a scansione. La riga centrale mostra l'apprese di legatura a sandwich caratterizzato da legante additivo nei saggi KD nelle righe sopra e sotto. Non esiste un legame a sandwich per gli aberi, cinque primi primi aberi derivati dal tiolo sono stati accoppiati a nanofili d'oro utilizzando la chimica standard del thile.

I secondi abre sono stati accoppiati a 50 NMO o nps d'oro allo stesso modo. La proteina S 100 B purificata è stata quindi legata prima ai nanofili derivati, il secondo aptamero 50 nanomolari d'oro, gli mps sono stati successivamente legati ai primi complessi di nanofili S 100 B. I complessi sandwich legati sono stati visualizzati utilizzando F FE SEM. Qui.

Un controllo negativo può essere visto per un saggio di legame eseguito con la proteina HTRA, una al posto della proteina S 100 B. Ok, quindi una delle cose più importanti della procedura è che stiamo utilizzando un approccio privo di primer in cui non abbiamo sequenze fisse che possono causare falsi positivi e falsi negativi in base al the, le sequenze stesse che sovrastano la regione casuale. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che il modello di DNA venga distrutto prima di ogni reazione di trascrizione inversa e fare attenzione a isolare il prodotto R-T-P-C-R specifico dopo ogni riamplificazione.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.