Name: Misurazione dellattività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Scopri come misurare l'attività delle calpaiane in cellule fisse e vive mediante citometria a flusso con substrati fluorescenti. Questo metodo consente di studiare il ruolo delle proteasi in malattie come leucemie e linfomi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato da sovvenzioni da parte del Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada e la Fondazione Linfoma del Canada.

Preparare Reagenti Nota: Tutti i PBS contiene Ca 2 + e Mg 2 + <ol><li> Rilevazione dei reagenti Aggiungi 20μM 7-ammino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina ammide (BOC-LM-CMAC) PBS a temperatura ambiente. Ogni sospensione cellulare richiederà reagente 2 ml di rilevamento. </li><li> 1% paraformaldeide (Cellule fisso) Diluire soluzione al 4% paraformaldeide magazzino a temperatura ambiente PBS. Aliquota paraformaldeide 1 ml 1% a ciascuna provetta FACS. Tre tubi FACS sono necessari per ogni condizione sperimentale (es. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necessari 9 tubi FACS) </li><li> PD150606 (inibitore della calpaina) Ricostituire PD150606 in DMSO ad una concentrazione finale di 100 mm. Proteggere questo reagente e tutte le cellule trattate con il medicinale dalla luce per tutta la durata di questo esperimento. </li><li> PD98059 (MEK1 inibitore) Ricostituire PD98059 in DMSO ad una concentrazione finale di 50mM. </li></ol> Preparare Cellule <ol><li> Crescere le cellule 32Dkit a 5 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule per ml di Opti-MEM dei media integrato con 5% di siero fetale bovino, WEHI-3 surnatante come fonte di IL-3 (o qualsiasi altra fonte di IL-3 come come proteina ricombinante), 0,1% 2-mercaptoetanolo e antibiotici. </li><li> Colleziona 12 x 10 6 cellule 32Dkit in tre tubi Falcon 15 ml (4 x 10 6 cellule per tubo). </li><li> Agglomerare le cellule a 1000 giri per 5 minuti a 15 ° C. </li><li> Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 2 ml di PBS a temperatura ambiente. </li><li> Trattare un sospensione cellulare con 50 micron PD150606. Assicurarsi che il campione è al riparo dalla luce, coprendo il tubo Falcon con un foglio di alluminio. Vortex brevemente poi incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Trattare la seconda sospensione cella con 20μM PD98059. Piastra le cellule in una capsula di 35 millimetri coltura e incubare per 2 ore a 37 ° C. </li></ol> Saggio calpaina in cellule fissate <ol><li> Mentre i campioni sono incubazione con PD150606, iniziare il test calpaina sui campioni non trattati. Iniziare con l'aggiunta di reagente 2 ml di rilevamento per ogni sospensione cellulare. Immediatamente aggiungere 1 ml di sospensione cellulare / miscela dei reagenti di rilevamento per i tubi precedentemente preparato FACS con 1% paraformaldeide (0 minuti di tempo punto). </li><li> Incubare sospensioni cellulari con il reagente di rilevamento per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad un tubo FACS con 1 ml di paraformaldeide 1%. </li><li> Continua incubando le sospensioni delle cellule con la miscela di rilevamento per altri 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad un tubo FACS con 1 ml di paraformaldeide 1%. </li><li> Ripetere il test calpaina sulle cellule 32Dkit che sono stati trattati con inibitori. </li><li> Fissare le cellule durante la notte al buio a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo agglomerare le cellule a 1800 giri per 5 minuti a 15 ° C. </li><li> Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 750uL PBS. Luogo cellule su ghiaccio e tenere al buio. </li></ol> Acquisire dati per celle fisse <ol><li> Analizzare le cellule utilizzando un II LSR (BD Bioscience). I filtri sono impostati per la Xcyte Lightwave (UV) laser, eccitazione 355nm linea e laser di potenza 25mW, emissione di 405 e 450 nm per il substrato e di prodotto, rispettivamente. Filtri passa banda per il substrato e di prodotto sono 405/20 e 450/50. Filtri passa lungo per il substrato e di prodotto sono 405 e 450. La tensione PMT è stato impostato sul 350-375 e 325-350 per il supporto per il prodotto. </li><li> Set-up un esperimento BD FACSDiva con i seguenti parametri: scatter in avanti; side scatter, Indo-1 Blu (log), Indo-1 Viola (log). Nel foglio di lavoro istituiti i seguenti grafici: forward scatter scatter plot vs lato dot con un cancello su cellule vive (Figura 1a), Indo-1 istogramma blu, Indo-1 istogramma Viola, Indo-1 vs Blu Indo-1 Viola dot plot. </li><li> Calibrare la II LSR con AlignFlow e AlignFlow più perline fluorescenti (Invitrogen). La tensione PMT deve essere regolato per posizionare il picco dell'istogramma tallone fluorescenza nel canale stesso prima di ogni esperimento. </li><li> Iniziare l'acquisizione dati utilizzando le cellule 32Dkit al punto 0 minuti di tempo. Regolare tensioni parametro, se necessario. Acquisire e registrare 10.000 eventi per ogni campione. </li><li> Ripetere l'acquisizione per ogni campione, il risciacquo la macchina con il tampone di FACS tra ciascun tubo. </li><li> Esportare i dati. Garantire LSR II viene pulito secondo le linee guida dell'istituto. </li></ol> Saggio calpaina in cellule vive <ol><li> Preparare le sospensioni cellulari come sopra, senza PD150606. Portare i campioni al II LSR e impostare filtri e parametri come sopra. Impostare il foglio di lavoro come sopra. Includono un grande appezzamento dot mostrando Indo-1 blu in funzione del tempo. Impostare il programma di acquisire il numero massimomero di eventi (non cancello stop). </li><li> Aggiungi 50 micron PD150606 ad una sospensione cellulare di cellule 32Dkit. Tenere il campione al buio e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. </li><li> Iniziare l'acquisizione dati sulla sospensione cellulare 32Dkit senza PD150606. Utilizzare un basso tasso di flusso di 200-300 eventi al secondo. Dopo 30 secondi a 1 minuto togliere il tubo dalla macchina. Aggiungi 20μM BOC-LM-CMAC alle cellule. Vortex brevemente poi proseguire l'acquisizione dei dati. </li><li> Acquisire dati per 10-20 minuti o fino a quando gli altipiani attività calpaina. </li><li> Ripetere i passaggi 3 e 4 con le cellule trattate con 32Dkit PD150606. </li><li> Esportare i dati. Garantire LSR II viene pulito secondo le linee guida dell'istituto. </li></ol> Saggio calpaina in complesso (Misto) popolazioni di cellule * Questo esperimento 32Dkit identificare le cellule in una sospensione di cellule prelevate da una milza del mouse. <ol><li> Raccolto la milza da ogni mouse. Lisare il globulo rosso con NH 4 Cl per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare sospensioni singola cella in 2 ml di PBS. </li><li> Dividere ogni sospensione di cellule in due. Trattare 1 sospensione cellulare con 50 micron PD150606 per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Procedere come sopra per il saggio Calpain nelle celle fisso (Fasi 1-6) </li><li> Aspirare il sopranatante. Lavare le cellule in 500μL PBS. Aspirare il sopranatante. </li><li> Risospendere le cellule in tampone di colorazione 200μL con il 2% BSA. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare l'anticorpo primario (FITC anti-topo CD117). L'anticorpo deve essere utilizzato a una diluizione 1:200 in colorazione buffer. Assicurarsi che l'anticorpo è tenuto all'oscuro. </li><li> Aggiungi 200μL anticorpo primario per le cellule. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungi 400μL PBS per aumentare il volume di citometria a flusso. Posizionare le cellule in ghiaccio e tenere al buio. </li><li> Procedere come descritto nella acquisizione dei dati per le celle fisso. Aggiungi FITC ai parametri e comprendono un istogramma per FITC sul foglio di lavoro. </li></ol> Analisi e risultati rappresentativi <ol><li> Analizzare i dati utilizzando FlowJo (Treestar). Cancello su cellule vive in base al profilo scatter in avanti e laterale (Figura 1a). Determinare la fluorescenza media per indo-blu dalla porta delle cellule vitali (Figura 1b). </li><li> a) Per la popolazione di cellule miste <ul><li> uso FITC fluorescenza su parcelle istogrammi e punto per identificare la popolazione 32Dkit </li><li> Determinare la fluorescenza media per indo-blu della popolazione 32Dkit </li></ul></li><li> Utilizzare Microsoft Excel per rappresentare graficamente la fluorescenza media (Figura 2a). Calcolare la pendenza della linea tra i 5 ei 10 minuti. Grafico la pendenza come un grafico a barre per determinare l'attività calpaina nelle cellule (Figura 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1a. Determinazione cellule vive in base al profilo scatter in avanti e laterale. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1b. Variazione media fluorescenza nel corso di 10 minuti di tempo. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> Figura 2a. Rappresentante grafico di fluorescenza media. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> Figura 2b. Calpain attività nelle cellule 32Dkit con inibitori.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;attività calpaina in cellule 32Dkit fisse e vita è stato determinato in questo protocollo video. Il trattamento della linea cellulare con l&#39;inibitore della calpaina PD150606 portato a completa inibizione dell&#39;attività calpaina nelle cellule. Inoltre, il trattamento con l&#39;inibitore MEK1 PD98059 portato a completa inibizione dell&#39;attività calpaina nelle cellule. ERK è un importante attivatore di calpaina-2 3. Questi risultati suggeriscono che l&#39;attività calpaina-2 è predominante nelle ...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldeide</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Sciogliere 4 g di paraformaldeide in 100 mL di PBS. In cappa, riscaldare il campione con agitazione fino a quando diventa limpido.&lt;br/&gt;Lasciare raffreddare, quindi conservare a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Utilizzare PD150606 ricostituito frescamente per un'inibizione massimale della calpaina.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow più perle fluorescenti, provette FACS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Il sopranatante delle cellule WEHI-3 viene utilizzato come fonte di IL-3 in questi esperimenti. Ogni raccolta di sopranatante di WEHI-3 viene titolata per determinare la concentrazione ottimale da utilizzare per la crescita delle cellule 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

misurazione dell&#39;attività calpain nelle celle fissi e living in citometria a flusso

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains sono onnipresenti intracellulari, calcio-sensibili, la cisteina proteasi neutre<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains svolgono un ruolo cruciale in molti processi fisiologici, tra cui segnalazione, rimodellamento del citoscheletro, regolazione dell&#39;espressione genica, l&#39;apoptosi e la progressione del ciclo cellulare<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains sono stati coinvolti in molte patologie tra cui le distrofie muscolari, cancro, diabete, morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaina regolamento è complesso e non completamente compreso. livelli di mRNA e proteine ​​correlate con l&#39;attività poco, limitando l&#39;uso di tecniche di espressione dei geni o proteine ​​per misurare l&#39;attività calpaina. Questo il video dettagli protocollo un test citometria a flusso sviluppato nel nostro laboratorio per la misurazione dell&#39;attività calpaina in cellule fisse e viventi. Questo metodo utilizza il substrato fluorescente BOC-LM-CMAC, che viene scissa in particolare da calpaina, per misurare l&#39;attività calpaina.<sup&gt; 2</sup&gt; In questo video, attività calpaina nelle cellule 32Dkit fisso e vive leucemia murina, da soli o come parte di una popolazione splenocyte viene misurata utilizzando un LSRII (BD Bioscience). Le cellule sono 32Dkit dimostrato di avere attività elevata rispetto a splenociti normali.

Questo articolo dettaglio il protocollo per la misurazione dell&#39;attività calpaina in cellule fisse e vivere in citometria a flusso.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Le calpaine sono proteasi a cisteina neutre, ubiquitarie, intracellulari e sensibili al calcio 1. Le calpaine svolgono ruoli cruciali in molti processi fisiologici, ...

Le calpaine sono proteasi citosoliche neutre sensibili al calcio, ubiquitarie, che svolgono ruoli cruciali in numerosi processi fisiologici, tra cui il segnaling, il rimodellamento del citoscheletro, la regolazione dell'espressione genica, l'apoptosi e il progresso del ciclo cellulare. Per misurare l'attività delle calpaine in cellule fissate e vive, viene aggiunto il substrato fluorescente BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC viene specificamente scisso dalla calpaina, determinando un aumento della fluorescenza. La variazione della fluorescenza viene monitorata mediante citometria a flusso, che rivela un'attività aumentata della calpaina in cellule 30 2D kit rispetto ai citi normali.Ciao, sono Christina Farr del laboratorio del Dottor Stewart Berger presso l'Università di Toronto, Dipartimento di Immunologia e la University Health Network. Oggi vi mostrerò come misurare l'attività della calpaina in cellule fisse e vive utilizzando un saggio basato sulla citometria a flusso. Utilizziamo questo saggio nel nostro laboratorio per analizzare l'attività della calpaina in cellule di leucemia e linfoma.Cominciamo. Prima di iniziare gli esperimenti, preparare i reagenti necessari, inclusi il reagente di rilevamento 1%PARAFORM aldeide cal pain inibitore PD 1 50 0 6 0 6 e l'inibitore di MEC uno PD 9 8 0 5 9. Per i dettagli sulla preparazione di questi reagenti, consultare il protocollo scritto allegato. Aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 1% a ogni provetta da fax.Sono richiesti tre tubi da centrifuga per ogni condizione sperimentale per le cellule fissate mostrate in questo video. Vengono testate tre condizioni, quindi sono necessari nove tubi da centrifuga. Iniziare con 32 cellule dki a 0,5-1 × 10⁶ cellule per millilitro coltivate in mezzo ottimale.Integrato con siero fetale bovino, IL-3, capto etanolo e antibiotici. Trasferire quattro volte 10 alla sesta cellule in ciascuna delle tre provette Falcon da 15 millilitri. Posizionare le provette nella centrifuga e formare il pellet centrifugando a 225 ×g per cinque minuti a 15 °C.Dopo la centrifuga, aspirare il sopranatante e risospendere le cellule in due millilitri di PBS a temperatura ambiente. Trattare una sospensione cellulare con 50 micromolar di inibitore della calpaia PD 150606. Assicurarsi che il campione sia protetto dalla luce coprendo il tubo con carta d'alluminio. Vortexare brevemente, quindi incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio.Trattare la seconda sospensione cellulare con 20 micromolar me un inibitore PD 9 0 5 9. Piastrare le cellule in una piastra per colture cellulari da 35 millimetri e incubarle per due ore a 37 gradi Celsius mentre i campioni sono in incubazione. Iniziare il saggio Calpain sui campioni non trattati.Iniziare aggiungendo due millilitri di reagente di rilevamento alla sospensione cellulare. Aggiungere immediatamente un millilitro della miscela di sospensione cellulare e reagente di rilevamento ai tubi fax precedentemente preparati per ottenere il campione T uguale a zero. Incubare le sospensioni cellulari con il reagente di rilevamento per cinque minuti.A temperatura ambiente, aggiungere un millilitro della miscela di reagenti per il rilevamento della sospensione cellulare al tubo fax precedentemente preparato con un millilitro di paraformaldeide al 1% per ottenere il campione T uguale a cinque. Continuare l'incubazione delle sospensioni cellulari rimanenti con la miscela di rilevamento per ulteriori cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, trasferire un altro millilitro della sospensione cellulare in un tubo fax preparato contenente un millilitro di paraformaldeide al 1%.Questo è il punto temporale corrispondente a T uguale a 10 minuti. Successivamente, ripetere il saggio della calpaina su 30 cellule del kit 2D trattate con inibitori. Coprire il rack con carta d'alluminio.Fissare le cellule tutta la notte al buio a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Raccogliere le cellule in pellet centrifugandole a 725 G per cinque minuti a 15 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante quindi risospendere le cellule in 750 microlitri di PBS.Posizionare le cellule sul ghiaccio e mantenerle al buio fino al momento dell'analisi mediante citometria a flusso. Qui viene mostrata l'acquisizione di dati per cellule fissate. Eseguire la citometria a flusso utilizzando un LSR due.Impostare i filtri per la lunghezza d'onda della luce o per la linea di eccitazione del laser UV a 355 nanometri e la potenza del laser a 25 milliwatt, con un'emissione a 405 e 450 nanometri rispettivamente per il substrato e il prodotto. I filtri passa-banda (BAM) utilizzati per substrato e prodotto devono essere 405/20 e 450/50. I filtri passa-alto per substrato e prodotto devono essere rispettivamente a 405 e 450 nanometri.Impostare la tensione del PMT a 350-375 per il substrato e a 325-350 per il prodotto. Configurare un esperimento BD FACS Diva con i seguenti parametri: scatter anteriore, scatter laterale, Indo uno blu utilizzando una scala logaritmica e uno violetto.Utilizzare anche una scala logaritmica nel foglio di lavoro. Creare i seguenti grafici. Un grafico di scattering anteriore rispetto a scattering laterale con un'area di selezione sulle cellule vitali.Un istogramma Indo uno blu, un istogramma Indo uno violetto e un diagramma a punti Indo uno blu contro Indo uno violetto calibrano l'LSR due con un flusso lineare e un flusso lineare più perline fluorescenti. La tensione del PMT deve essere regolata in modo da posizionare il picco dell'istogramma fluorescente delle perline nello stesso canale prima di ogni esperimento. Iniziare l'acquisizione dei dati utilizzando le cellule del kit 30 2D al tempo zero.Regolare le tensioni dei parametri secondo necessità. Acquisire e registrare 10.000 eventi per campione. Lavare la macchina con tampone fax e ripetere l'acquisizione per ogni campione.Esportare i dati dopo l'acquisizione dei dati. Assicurarsi che l'LSR two venga pulito secondo le linee guida dell'istituto. Preparare le sospensioni cellulari come in precedenza, senza aggiungere il reagente di rilevamento o l'inibitore del calpain.Portare i campioni al LSR due e configurare filtri e parametri come in precedenza. Configurare il foglio di lavoro come in precedenza. Includere un grafico a punti di grandi dimensioni che mostri Indo uno blu rispetto al tempo.Impostare il programma per acquisire il numero massimo di eventi. Nessun stop gate. Aggiungere 50 micromolar di inibitore del calpain a una sospensione cellulare di cellule del kit 32 G.Mantenere il campione al buio e incubarlo a temperatura ambiente per 20-30 minuti mentre le cellule sono in incubazione. Iniziare ad acquisire i dati sulla sospensione cellulare del kit 30 2D senza l'inibitore di calpain. Utilizzare un flusso basso di 200-300 eventi al secondo.Dopo 30 secondi a un minuto, rimuovere il tubo dalla macchina. Aggiungere 20 micromolari di Bach LMC mac alle cellule. Questo è il reagente di rilevamento.Viene scisso specificamente dalla calpaina e la sua scissione determina un aumento della fluorescenza del substrato nel vortice. Di seguito, continuare ad acquisire i dati. Acquisire i dati per 10-20 minuti o fino a quando l'attività della calpaina non raggiunge un plateau.Successivamente, ripetere l'acquisizione con 32 cellule gki trattate con inibitore della calpaina. Al termine, esportare i dati per l'analisi. Iniziare il saggio con cellule miste utilizzando una sospensione cellulare ottenuta da milza di topo.Dividere ogni sospensione cellulare in due parti. Trattare una sospensione cellulare con 50 micromolar di inibitore della calpauna, coprire con stagnola e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver eseguito il saggio della calpauna come descritto in precedenza per le cellule fissate, coprire i tubi con stagnola e incubare le cellule tutta la notte a quattro gradi Celsius al buio.Il giorno successivo, centrifugare a 725 G per cinque minuti a 15 gradi Celsius. Aspirare il soprannatante, lavare le cellule in 500 microlitri di PBS e aspirare nuovamente il soprannatante; risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer di marcatura contenente il 2% di BSA e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, preparare l'anticorpo primario, in questo caso ZI anti-US.CD17 viene preparato in tampone di marcatura in modo che il diluizione finale sia 1:200. Assicurarsi che l'anticorpo sia mantenuto al buio. Aggiungere 200 microlitri di anticorpo primario alle cellule, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.Successivamente, aggiungere 400 microlitri di PBS per aumentare il volume destinato alla citometria a flusso. Porre le cellule sul ghiaccio e mantenere al buio. Acquisire i dati utilizzando la stessa procedura di citometria a flusso mostrata per le cellule fissate.Aggiungere ZI ai parametri e includere un istogramma per ZI nel foglio di lavoro dopo l'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. Analizzare utilizzando la finestra di FlowJo su cellule vitali in base al profilo di scattering anteriore e interno. Determinare la fluorescenza media per Indo Blue a partire dalla finestra delle cellule vitali.In questo grafico, la linea rossa indica la fluorescenza media del substrato a zero minuti, mentre le linee blu e verde indicano la fluorescenza media del substrato a cinque e dieci minuti. Per la popolazione cellulare mista, utilizzare la fluorescenza FXI negli istogrammi e nei grafici a punti per identificare la popolazione 30 2D kip. Determinare la fluorescenza media per endo blue della popolazione 30 2D kip.Infine, utilizzare Microsoft Excel per rappresentare graficamente la fluorescenza media. Calcolare la pendenza della retta compresa tra cinque e dieci minuti. Riportare la pendenza in un istogramma per determinare l'attività della calpaina nelle cellule.I dati mostrati qui indicano che 30 cellule 2D presentano livelli elevati di attività della cal pain e che l'attività della cal pain può essere inibita da inibitori della MEK. Abbiamo appena illustrato come misurare l'attività della cal pain in cellule fissate e vive. Quando si esegue questa tecnica, è fondamentale configurare correttamente l'LSR due e calibrare lo strumento utilizzando perle fluorescenti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra la marcatura delle cellule neuronali con anticorpi per i complessi della catena respiratoria mitocondriale, la proteina associata al DNA mitocondriale e la proteina della membrana esterna mitocondriale, seguita da citometria a flusso per quantificarne i livelli.

Misurazione di più parametri mitocondriali nei neuroni mediante citometria a flusso

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Mitophagy, la degradazione selettiva dei mitocondri, è stato implicato nell'omeostasi mitocondriale ed è liberalizzato in varie malattie umane. Tuttavia, convenienti metodi sperimentali per misurare l'attività di mitophagy sono molto limitati. Qui, forniamo un test sensibile per misurare l'attività di mitophagy mediante citometria a flusso.

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Fornire sensibilità unicellulare, citometria a flusso in tempo reale è in grado di quantificare le funzioni del ricevitore multimodale di culture vivono. Utilizzando cellule progenitrici neurali adulte, la funzione del recettore P2X7 è stata valutata tramite afflusso del calcio rilevato dal colorante indicatore di calcio, la formazione dei pori transmembrana dall'assorbimento di bromuro di etidio e fagocitosi utilizzando granuli di lattice fluorescente.

In tempo reale Live-cella flusso Cytometry per indagare l'afflusso del calcio, la formazione del poro e fagocitosi dai recettori P2X7 in cellule progenitrici neurali adulto

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Il presente protocollo descrive due metodi per misurare l'attività delle caspasi attraverso un substrato fluorogenico utilizzando la citometria a flusso o uno spettrofluorometro.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare la sopravvivenza post-stress in campioni di lievito. Il test utilizza due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e ioduro di propidio (PI), per quantificare l'integrità della membrana plasmatica. Utilizza la citometria a flusso per fornire stime quantitative e riproducibili delle frazioni cellulari vive, morte e danneggiate per campioni di stress post-ossidativo.

Un test LIVE/DEAD ottimizzato abbinato alla citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nelle cellule di lievito

Scopri come misurare l'attività delle calpaiane in cellule fisse e vive mediante citometria a flusso con substrati fluorescenti. Questo metodo consente di studiare il ruolo delle proteasi in malattie come leucemie e linfomi.

Misurazione dell'attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Esplora altri video