Name: Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri la dechorionazione degli embrioni di medaka e il trapianto di cellule per generare chimere. Questa tecnica consente di studiare l'autonomia cellulare di geni e proteine nello sviluppo embrionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è supportato da un finanziamento della MRC a M. FS.

1. Lo sviluppo degli embrioni <ol><li> Quando sono previste, le uova sono raggruppati a causa di filamenti attaccamento al corion. Per consentire gli embrioni si sviluppano normalmente, è necessario separare le uova. Groviglio e tagliare filamenti attaccamento tenendo i filamenti allegato con due pinze. </li><li> Dopo unclustering, le uova sono separati da feci e alghe e trasferita ad un mezzo embrione fresco ad una densità massima di 40 uova per ogni piatto 6 centimetri di Petri. </li><li> Embrioni Medaka sviluppare leggermente più lento rispetto zebrafish a 27 ° C. I tempi di schiusa è diverso tra le due specie; embrioni Medaka portello dal corion in 7 giorni e cominciare subito a nuotare e mangiare, mentre gli embrioni di zebrafish schiudono in 2 giorni, ma iniziano a nuotare e mangiare in 5-6 giorni. Sviluppo di Medaka si svolge secondo 4 Iwamatsu messa in scena è. </li><li> Lo sviluppo degli embrioni Medaka può essere comodamente regolato piani sperimentali, selezionare la temperatura appropriata. Sviluppo di embrioni Medaka può essere fermato a 4 ° C nel primo sviluppo. Dopo la tappa 24, quando il cuore inizia a battere, lo sviluppo può essere rallentato con una temperatura minima di 18 ° C. </li><li> I tempi di comparsa di organi / tessuti è leggermente diverso in Medaka rispetto al pesce zebra, vale a dire in somitogenesis Medaka si verifica dopo l'inizio dello sviluppo del cervello mentre in somitegenesis zebrafish precede lo sviluppo del cervello. </li></ol> 2. Rimozione del corion Il corion di Medaka è costituito da due strati protettivi con uno strato duro interno e una superficie morbida esterna. Così, in due fasi di trattamento della proteasi impiegando pronasi ed enzimi cova è necessario rimuovere questo corion. Una volta dechorionated, gli embrioni devono essere conservati in 1X BSS. Semi-sterile condizioni miglioreranno la cultura di successo degli embrioni dechorionated, specialmente quando lunghi periodi di osservazione sono obbligatori. Queste includono l'utilizzo di soluzioni sterili (ad esempio sterilizzati 1X BSS con gli antibiotici) e gli strumenti sterilizzati con etanolo al 70% seguita da risciacquo con 1X BSS. Come dechorionated embrioni Medaka sono più morbide e più fragili di embrioni di zebrafish dechorionated, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che non entrino in contatto con l'aria o bolle nella pipetta, in modo da causare il collasso immediato. Per garantire il minimo danno agli embrioni, una bocca larga pipetta di vetro lucido con pompa di calore pipetta deve essere utilizzato per il trasferimento di embrioni e un ciclo capelli dovrebbero essere utilizzate per orientare gli embrioni per l'osservazione. Non aderente scatole di Petri devono essere usati per prevenire gli embrioni di attaccarsi alle superfici. <ol><li> Prima di dechorionation è opportuno verificare che le uova sono state sufficientemente separati e ripulito. </li><li> Dal momento che sia pronasi ed enzimi cova sono proteinasi, dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e minimizzare l'esposizione degli embrioni a questi enzimi. </li><li> Trasferimento uova di carta vetrata (grana P2000, impermeabile) posta nel coperchio di un piatto nove centimetri Petri. Rimuovere l'eccesso di media, ma garantire un volume sufficiente resta contro l'essiccamento della embrioni. </li><li> Ruotare delicatamente embrioni per circa 45-60 secondi per rimuovere alcuni dei peli superficie esterna e punteggio leggermente la superficie del corion (Figura 1). Trasferimento degli embrioni indietro originale Petri ed esaminare. Quando gli embrioni che rotola su carta vetrata usare il dito indice, applicando una pressione minima e mantenendo le dita parallele alla superficie della carta vetrata. Non tiro più di 5-7 embrioni alla volta. Questa precauzione riduce al minimo il rischio di schiacciare gli embrioni sotto l'altro. </li><li> Sostituire medio uovo in un piatto con pronasi 20mg/ml ed embrioni incubare per 40-60 minuti a 27 ° C. Assicurarsi che gli embrioni sono sufficientemente coperti da pronasi e un coperchio è presente sul piatto. Pronasi non utilizzati devono essere tenuti in ghiaccio durante questa fase di minimizzare auto-digestione e può essere riutilizzato fino a quando l'attività è persa (circa 1-2 settimane). </li><li> Recuperare pronasi per il riutilizzo e lavare gli embrioni 5X in media embrione per rimuovere le tracce di pronasi quanto ciò inattivare l'enzima cova da aggiungere. </li><li> Rimuovere medio embrione embrioni e coprire con l'enzima cova, assicurando embrioni riunirsi in monostrato nel piatto. Se le uova sedersi su uno sopra l'altro nel piatto, quelli in basso saranno schiacciati come il corion si dissolve. Tenere enzima utilizzato cova sul ghiaccio. </li><li> Incubare gli embrioni a 27 ° C e dopo 15 minuti controllare periodicamente i progressi della cova utilizzando uno stereomicroscopio. Si vedrà che un certo numero di cratere lunare, come i buchi cominciano ad apparire nello strato interno del corion, che si dissolve ben presto seguendo questo lasciando lo strato morbido esterno del corion facilmente rimosso manually. L'intero processo di schiusa può richiedere 15-60 minuti. </li><li> Non appena gli embrioni escono dal corion, il trasferimento degli embrioni a una piastra di Petri contenente 1X BSS. Assicurarsi di non trasferire enzima da cova verso la BSS 1X toccando la punta della pipetta sulla superficie del BSS permettendo al embrioni a rotolare delicatamente. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni vengono trasferiti da enzima cova, effettuare un trasferimento finale ad un altro piatto fresco di 1X BSS. In questo modo gli embrioni non siano esposti a eventuali residui di enzima cova, in quanto ciò potrebbe danneggiare gli embrioni esposti. Una volta in questo piatto finale di tutti gli embrioni che possiedono ancora lo strato esterno del corion possono essere liberati manualmente utilizzando sterilizzati micro-pinze con lo stereomicroscopio. Se gli embrioni devono essere sviluppate dechorionation seguenti, penicillina / streptomicina deve essere aggiunto il BSS per prevenire la crescita batterica. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Confronto di embrioni arrotolato e srotolato durante dechorionation. Osservate come gli embrioni pannello arrotolato in B mancano i capelli visto sul embrioni srotolato nel pannello A. 3. Montaggio embrioni dechorionated Embedding agarosio è utile per lunghi periodi di immagini (ad esempio, time-lapse imaging) per gli embrioni di vivere così come per osservazioni dettagliate di embrioni fisso. Durante la gastrulazione e organogenesi precoce (stadio 14 a tappa 28), embrioni Medaka mostra ondate di movimenti ritmici contrattile attraverso il periderm, uno strato di tessuto che copre sia nello sviluppo embrionale e il tuorlo 5. Gli embrioni sono trattati con 3,5 mm 1-eptanolo per fermare i movimenti contrattili 6. Per fermare il movimento di embrioni dopo la tappa 28 (64hpf), gli embrioni vengono anestetizzati con l'aggiunta di gocce di Tricaine mesilato (TMS) prima di incorporamento. TMS è aggiunto anche l'agarosio (aggiungere solo una minima quantità, questa dose deve essere ottimizzato, circa una diluizione 1:25). <ol><li> Scongelare una piccola quantità del 3% agarosio a bassa temperatura di gelificazione (in 1X BSS), con il riscaldamento a 37 ° C e mantenendolo a tale temperatura. </li><li> Le seguenti operazioni devono essere svolte rapidamente per garantire che l'agarosio non solidificare prima orientare l'embrione. Usando una bocca larga trasferimento pipetta di vetro fuso sufficiente agarosio a riempire la depressione tappo di una provetta Eppendorf. </li><li> Trasferimento di un embrione dechorionated alla depressione tappo minimizzando riporto BSS con l'embrione. Immediatamente l'assorbimento e l'agarosio embrione dalla depressione cappuccio e trasferimento in una camera di cultura capsula di Petri. Un piatto di Petri 3,5 centimetri con una finestra di vetro sul fondo viene utilizzato. Per le immagini utilizzando un microscopio invertito, gli embrioni sono orientati a faccia in giù il corpo e posto vicino al vetro di copertura. Per le immagini utilizzando un microscopio in posizione verticale, lo spessore di agarosio è ridotto al minimo. </li><li> Trasferire il piatto 3,5 centimetri Petri in un piatto di 14 centimetri di diametro Petri contenente acqua e ghiaccio (acqua riempito circa 1 / 3 profondità totale di piatto di grandi dimensioni). Mentre tenendo la camera con decisione sul fondo del piatto 14 centimetri Petri, utilizzare un ciclo capelli per orientare delicatamente l'embrione come desiderato nel fuso agarosio e tenere l'embrione fino alla agarosio solidifica delicatamente alzare ed abbassare il piatto più piccolo nella sua posizione originale in acqua gelida. </li></ol> 4. Trapianto di cellule negli embrioni Medaka L'obiettivo di questa procedura è quello di determinare se il gene di interesse atti cellule autonomamente (all'interno di una cella) o non cellulari autonomamente (tra le cellule). Cellule del donatore possono essere etichettati con un colorante tracciante come rodamina-destrano prima del trapianto (come descritto in 'microiniezione di embrioni Medaka' il protocollo che accompagna Giove) o di un ceppo transgenico con espressione GFP può essere utilizzata, che permetta di valutare il trapianto. Una combinazione di entrambe le tecniche di etichettatura è spesso utile a superare l'auto-fluorescenza che si possono incontrare. Per time-lapse studi dopo il trapianto, l'espressione della GFP è particolarmente utile. Utilizzare una pipetta ad imboccatura larga in vetro con pompa pipetta durante tutta la procedura e sterilizzare tutti gli strumenti (compresi gli scivoli) in anticipo con il 70% EtOH seguito da un risciacquo con sterili 1X BSS. Embrioni destinatari sono in genere sviluppati intorno al palco 12 come questo permette la discriminazione dei poli ventrale e dorsale nello svolgimento trapianto. <ol><li> Iniziare dechorionating embrioni 1,5 ore prima del trapianto e l'iniezione apparato di setup durante l'incubazione dell'enzima. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio cavità in un piatto di 9 centimetri di diametro Petri. </li> Aggiungere una piccola quantità del 3% di metilcellulosa al centro della diapositiva cavità con una punta di pipetta sterile e diffondere sottilmente. <li> Metilcellulosa asciugare per circa 1-2 minuti. </li><li> Aggiungere 350μl di sterili 1X BSS a riempire la depressione diapositive. </li><li> Trasferimento di un embrione donatore e fino a quattro embrioni destinatario alla diapositiva con una pipetta di vetro. </li><li> Embrioni orientarsi utilizzando un ciclo capelli in modo che il Blastoderm dell'embrione è rivolto verso l'alto. Gli embrioni possono essere appoggiati uno contro l'altro per aumentare ulteriormente la stabilità. </li><li> Inserire delicatamente la micro-ago nel Blastoderm donatore e lentamente assorbimento 10-20 cellule. </li><li> Inserire delicatamente l'ago in area richiesta di Blastoderm destinatario embrione ed espellere le cellule lentamente. Grande attenzione dovrebbe essere presa quando si inserisce nelle cellule Blastoderm destinatario in modo da non disturbare la cellula-uovo confine sacco in quanto ciò può provocare la morte dell'embrione. </li><li> Versare sterilizzati 1X BSS nella capsula di Petri. Versare cautamente il BSS in piatto più vicino al lato del piatto il più possibile in modo da non disturbare gli embrioni. Non versare mai il BSS direttamente sul embrioni e aggiungere sufficiente BSS in modo che la diapositiva e gli embrioni sono immersi. </li><li> Aggiungere 100μl di penicillina / streptomicina per il piatto e coprire. Con attenzione trasferire il piatto ad un 27 ° C incubatore per consentire il normale sviluppo. </li><li> Gli embrioni possono essere periodicamente osservare come desiderato. Quando si utilizza il trapianto di effettuare guadagno di funzione e / o esperimenti di salvataggio fenotipo, alcuni cambiamenti morfologici osservati potrebbe essere dovuta agli effetti del trapianto. Così trapianti multipli sono necessari. Dopo 2-3 giorni, melanofore deve essere presente sul sacco vitellino, testa, occhi e del tronco. Se presente sugli embrioni poi trapiantato con successo chimera è probabilmente stato prodotto (Figura 3). </li></ol> Se necessario, embrione donatore genotipo (s), trasferendo alla PCR tubo (s) contenente 20mg/ml 25μl di proteinasi K. Incubare a 55 ° C per 4 ore seguiti da 10 minuti a 94 ° C ed eseguire PCR. 5. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posizione Esempio di agarosio-embedded embrione. Anteriore è mostrato a destra e la vista è dorsale. Pannello B: cellule endoteliali possono essere visti su entrambi i lati del corpo dell'embrione e sono etichettati con GFP guidata dal promotore fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagini di post-trapianto di embrioni. Una immagine mostra un embrione donatore e ricevente immediatamente post-trapianto. L'embrione donatore viene mostrato sulla destra con un Blastoderm completamente rossa (freccia). L'embrione destinatario è mostrato sulla sinistra ed è facilmente identificabile dalla piccola massa di cellule trapiantate rosso visibile nella Blastoderm (punta di freccia). B immagine mostra due embrioni destinatario circa 7 ore dopo il trapianto (incubazione a 27 ° C). Notate le cellule trapiantate sono migrate dal sito del trapianto e sono ora dispersi in tutto il Blastoderm (frecce). Immagine C mostra un embrione destinatario a st.29 (circa 74hpf). Si noti la pigmentazione negli occhi e la presenza di melanofore nella regione del tronco e del cervello (frecce). La rodamina marcato le cellule possono essere visti da colonizzare molte delle strutture embrionali che indica la produzione di successo di una chimera.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo video ci mostrano come dechorionate e realizzare transplanataion cellula su embrioni Medaka. Questa è una tecnica potente per produrre embrioni chimerici per lo studio del gene / proteina funzione durante lo sviluppo, nonché per chiarire l&#39;autonomia del gene / proteina in questione. Medaka sono un utile sistema modello vertebrato per questa tecnica a causa di mappe destino ben consolidata e il loro prestito trasparenza bene di in vivo imaging in tempo reale. Trapianto può essere combinato con microiniezione (come descritto in &#39;microiniezione di embrioni Medaka&#39; il protocollo che accompagna Giove) in modo che il comportamento delle cellule trapiantate possono essere facilmente osservati.

<table><tbody><tr><td>Mezzo per embrioni</td><td>Reagente</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>200 ml di soluzione madre 50X, 1 ml di metilene blu al 1% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litri di acqua RO (soluzione madre 50X: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litro di acqua RO.)</td></tr><tr><td>Pinzette per microdissezione</td><td>Strumenti</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td><td>N/D</td><td>Punte molto affilate per rimuovere la coriona.</td></tr><tr><td>Carta vetrata impermeabile fine - grana p2000</td><td>Strumenti</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/D</td><td>Grana molto fine per arrotolare/pulire embrioni con coriona.</td></tr><tr><td>Methylcellulosa al 3%</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Alta viscosità per mantenere gli embrioni in posizione durante il trapianto.</td></tr><tr><td>BSS 1X</td><td>Reagente</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>20X BSS: 130 g NaCl, 8 g KCl, 4 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O e 10 mg di rosso fenolo in 1 L di acqua MilliQ, autoclavare; 500 mM Hepes in acqua MilliQ autoclavata. Aggiungere 25 ml di 20X BSS e 15 ml di 500 mM Hepes pH 7,0, portare a 500 ml e filtrare per sterilizzare prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Reagente</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Aggiunta al BSS durante l'incubazione di embrioni dechorionati.</td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Per la dechorionazione.</td></tr><tr><td>Enzima di schiusa</td><td>Reagente</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Per la dechorionazione.</td></tr><tr><td>Tricaina mesilato (TMS)</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400 mg di tricaina in 97,9 ml di acqua distillata e 2,1 ml di Tris 1 M, pH regolato a 7; 4,2 ml di questa soluzione in 100 ml di acqua pulita del serbatoio.</td></tr><tr><td>Agarosio con temperatura di gelificazione ultra-bassa al 3%</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Tipo IX-A. Utilizzato durante l'inclusione degli embrioni per l'osservazione.</td></tr><tr><td>Camera di coltura in piastra di Petri</td><td>Strumento</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Piatto in vetro Iwaki da 35 mm con finestra da 12 mm. Utilizzato durante l'inclusione degli embrioni per l'osservazione.</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Attrezzatura</td><td>Narishige</td><td>N/D</td><td>Modello MN151. Per la rimozione e l'inserimento di cellule durante il trapianto.</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Strumento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Per la preparazione degli aghi da trapianto.</td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Attrezzatura</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello P-97</td><td>Per la preparazione degli aghi da trapianto.</td></tr></tbody></table>

dechorionation di embrioni medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka è un piccolo deposizione delle uova di pesce d&#39;acqua dolce che permette le analisi genetiche ed embriologica ed è uno dei tre organismi modello vertebrato, in cui sono state effettuate genome-wide schermi mutante fenotipo-cacciati 1. Divergenza di sovrapposizione funzionale di geni correlati tra Medaka zebrafish e consente l&#39;identificazione di fenotipi romanzo che sono identificabili in una singola specie 2, così Medaka e zebrafish sono complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati. Manipolazione di embrioni Medaka, come dechorionation, embrioni di montaggio per l&#39;imaging e il trapianto di cellule, sono procedure fondamentali per lavorare su entrambi i Medaka zebrafish e in un laboratorio. Trapianto di cellule esamina autonomia cellula di mutazioni Medaka. Chimere sono generati dal trapianto di cellule da embrioni etichettati donatore in embrioni destinatario senza etichetta. Cellule del donatore possono essere trapiantati ad aree specifiche degli embrioni destinatario in base al destino mappe 3 in modo che i cloni di cellule trapiantate possono essere integrati nel tessuto di interesse durante lo sviluppo. A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. In questo video vi mostriamo le procedure dettagliate per manipolare embrioni Medaka.

A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. Questo video mostra passo per passo le procedure di come manipolare gli embrioni Medaka, tra cui dechorionation, montaggio in agarosio per l&#39;imaging e il trapianto di cellule per la produzione di chimere. Queste procedure sono essenziali per l&#39;uso Medaka zebrafish e in un laboratorio per sfruttare al massimo delle loro caratteristiche complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Il medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce oviparo che consente sia analisi genetiche che embriologiche ed è uno dei tre organismi modello vertebrati in...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre cloni in un embrione al fine di esaminare l'autonomia di un gene o di una proteina di interesse. Questo viene ottenuto etichettando gli embrioni donatori con Rodamina dextrano mediante microiniezione allo stadio a una cellula, come mostrato nel video correlato, microiniezione di embrioni Maka. Il secondo passaggio della procedura consiste nello sviluppare sia gli embrioni donatori che quelli riceventi fino allo stadio corretto.Il terzo passaggio della procedura consiste nel rivestire sia gli embrioni donatori che quelli riceventi. L'ultimo passaggio della procedura è il trapianto di cellule dagli embrioni donatori etichettati agli embrioni riceventi. Alla fine, i risultati possono essere ottenuti analizzando la distribuzione, la proliferazione e la differenziazione delle linee cellulari, delle cellule trapiantate, rilevando tali cellule mediante la loro fluorescenza o tramite marcatori di linea cellulare.Ciao, sono Sean Brazinski del laboratorio del Dottor Makoto Fki del Dipartimento di Biologia e Biochimica dell'Università di Bath. Sono affiliato anche al laboratorio Zeki. Oggi vi mostreremo una procedura per il trapianto cellulare in embrioni di pesce al buio.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare se un gene o una mutazione di interesse ha una funzione autonoma o non autonoma a livello cellulare. Cominciamo. Durante il rivestimento delle uova maka, utilizzare soluzioni e strumenti sterili per aumentare il successo dell'osservazione e della coltura a lungo termine.Posizionare un pezzo di carta vetrata impermeabile di grana P 2000 nel coperchio di una piastra di Petri non aderente da nove centimetri. Utilizzare una pipetta di pasta vetrata a bocca larga per trasferire fino a 10 uova appena disgregate, pulite ed etichettate da una piastra contenente uova in mezzo di coltura sulla carta vetrata.Rimuovere il mezzo in eccesso, lasciandone appena sufficiente nella piastra per evitare che le uova si secchino. Utilizzare la punta di un dito guantato per arrotolare delicatamente 10 uova alla volta sulla carta vetrata per 45-60 secondi. Per rimuovere i peli della superficie esterna e graffiare la superficie in Corian, applicare una pressione minima e mantenere la punta del dito parallela alla carta vetrata.Trasferire le uova nella piastra originale contenente il mezzo. Rimuovere il mezzo, ricoprire le uova con una soluzione di 20 milligrammi per millilitro di prone. Coprire la piastra e incubare a 27 gradi Celsius per 60 minuti.Assicurarsi di posizionare la piastra con un angolo tale che gli embrioni siano sufficientemente immersi nell'enzima. Per ridurre al minimo la quantità di enzima necessaria, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per recuperare la pronasi da riutilizzare e collocarla sul ghiaccio. Lavare le uova cinque volte con il mezzo per embrioni per rimuovere ogni traccia di pronasi, al fine di impedire che digerisca l'enzima della schiusa.Aggiungere un quantitativo sufficiente di enzima di schiusa per coprire le uova lavate. Assicurarsi che le uova rimangano in un singolo strato sul fondo della piastra per evitare schiacciamenti durante la dissoluzione del Corian. Incubare le uova a 27 gradi Celsius.Assicurarsi di posizionare la piastra con un angolo tale che gli embrioni siano sufficientemente immersi nell'enzima. Per ridurre al minimo la quantità di enzima necessaria, verificare l'avanzamento sotto un microscopio stereoscopico da dissezione: compariranno dei fori simili nello strato interno della Corion prima che questo si sciolga completamente. Il processo può richiedere fino a 60 minuti, a seconda dell'attività enzimatica.Quando una piccola parte del Corian viene disciolta, aspirare immediatamente l'uovo singolo con una pipetta per evitare la digestione dell'embrione da parte dell'enzima di schiusa. Trasferirlo in una capsula pulita contenente BSS una volta, toccando delicatamente la punta della pipetta a una capsula pulita contenente BSS una volta e lasciando rotolare fuori l'uovo, per minimizzare il trasferimento dell'enzima di schiusa. Utilizzare pinzette per rimuovere il resto del Corian una volta che tutte le uova sono state trasferite dall'enzima di schiusa.Eseguire un trasferimento finale in una nuova piastra contenente BBSS una volta. Aggiungere antibiotici se gli embrioni devono essere portati a uno stadio successivo dello sviluppo embrionale. Dopo la decorazione per questa procedura, iniziare la decorticazione di embrioni allo stadio 12, 1,5 ore prima del trapianto. Utilizzare la punta di una pipetta per aggiungere una piccola quantità di metilcellulosa al 3% al centro di una cavità del microscopio.Inserire una piastra di Petri da nove centimetri. Distribuire il liquido in modo sottile sulla superficie della depressione. Lasciare asciugare la metilcellulosa per due minuti.Riempire la depressione del vetrino con 350 microlitri di BSS sterile una volta sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare una pipetta di vetro a bocca larga e levigata a fuoco per trasferire un embrione donatore e fino a quattro embrioni riceventi sul vetrino. Utilizzare un anello di capello per orientare gli embrioni in modo che il derma blastico sia rivolto verso l'alto.Inclinare gli embrioni l'uno contro l'altro per garantire stabilità, se necessario. Inserire delicatamente un micropipetta nel blastoderma del donatore. Aspirare lentamente da 10 a 20 cellule.Inserire delicatamente l'ago nella zona appropriata dell'embrione ricevente e iniettare lentamente le cellule donatrici. Non disturbare il limite del sacco corioallantoideo. Riempire con attenzione la piastra di Petri con circa 30 millilitri di BSS sterile 1x per immergere gli embrioni e staccarli dal metilcellulosa.Versare lungo il lato della piastra in modo da non disturbare gli embrioni. Aggiungere 100 microlitri di penicillina-streptomicina nella piastra per ottenere una concentrazione approssimativa dello 0,3%. Coprire la piastra. Osservare periodicamente gli embrioni secondo necessità.Per studi di imaging prolungati, come quelli a intervalli di tempo o osservazioni dettagliate, incorporare embrioni vivi rivestiti in aros e anestetizzare gli embrioni vivi per prevenire movimenti, aggiungendo un anestetico appropriato al mezzo contenente gli embrioni. Sciogliere circa un millilitro di agarosio al 3% a basso punto di fusione in BSS 1x e mantenerlo a 37 gradi Celsius. Se necessario, aggiungere una quantità adeguata di anestetico all'agarosio per prevenire contrazioni muscolari. Lavorare rapidamente per evitare la solidificazione e utilizzare una pipetta Pasteur a bocca larga per riempire la cavità di un tubo da microcentrifuga con agarosio.Utilizzare una pipetta a bocca larga per trasferire un embrione rivestito e anestetizzato nell'aros nel tappo. Trasferire con l'embrione la minima quantità possibile di mezzo. Aggiornare immediatamente l'aros e l'embrione e spostarli in una piastra di Petri da 3,5 centimetri con fondo in vetro.Trasferire la piastra in una piastra da 14 centimetri riempita per un terzo con una miscela di ghiaccio e acqua. Tenere saldamente la piastra più piccola sul fondo della piastra più grande sotto un microscopio stereoscopico da dissezione. Utilizzare un anello di capello per orientare rapidamente l'embrione nella posizione desiderata.Tenere fermo l'embrione fino a quando l'agaro si solidifica. A questo punto, l'embrione può essere sottoposto a imaging. L'immagine A mostra un embrione donatore e uno ricevente immediatamente dopo il trapianto.L'embrione donatore è mostrato a destra con un derma di plaster completamente etichettato in rosso. L'embrione ricevente è mostrato a sinistra ed è facilmente identificabile per la piccola massa di cellule trapiantate rosse visibile nell'immagine del derma blaster. B mostra due embrioni riceventi circa sette ore dopo il trapianto. Si noti che le cellule trapiantate si sono migrate dal sito di trapianto e ora sono disperse attraverso il blaster.L'immagine cutanea C mostra un embrione ricevente allo stadio 29. Si noti la pigmentazione dell'occhio e la presenza di mefor nella regione del tronco e del cervello. Le cellule marcate del rod domine possono essere osservate mentre colonizzano molte delle strutture embrionali, indicando la corretta produzione di una chimera.Abbiamo appena mostrato come disporre gli embrioni di pesce meca e come eseguire il trapianto cellulare in una fase embrionale precoce. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di trapiantare le cellule del donatore nell'area corretta del blastomero ricevente. Questo permetterà alle cellule del donatore di differenziarsi nel tipo cellulare appropriato.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un passo-passo guida mirate a generare embrioni di zebrafish chimerico da trapianto allo stadio di blastula o gastrula.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

Zebrafish trapianto di cellule consente la combinazione di genetica e dell'embriologia per generare chimere tessuto specifiche. Questo video dimostra gastrula scena trapianti di cellule che hanno permesso al nostro laboratorio per studiare il ruolo delle popolazioni astrogliali e spunti indicazioni specifiche durante la formazione commessura nel proencefalo.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l'embriogenesi.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Medaka e zebrafish sono complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati. Questo protocollo mette in evidenza i punti chiave per il successo microiniezione in embrioni Medaka, una tecnica importante per l'analisi embriologiche e genetiche utilizzando Medaka zebrafish e in un laboratorio.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

Piccoli pesci da laboratorio sono diventati modelli popolari per la ricerca sulle ossa sui meccanismi alla base dei disturbi ossei umani e per lo screening di farmaci modulanti le ossa. In questo rapporto, descriviamo un protocollo per valutare l'effetto dell'alendronato sulle cellule ossee nelle larve di medaka con lesioni osteoporotiche.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Scopri la dechorionazione degli embrioni di medaka e il trapianto di cellule per generare chimere. Questa tecnica consente di studiare l'autonomia cellulare di geni e proteine nello sviluppo embrionale.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Esplora altri video