Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. Questo video mostra passo per passo le procedure di come manipolare gli embrioni Medaka, tra cui dechorionation, montaggio in agarosio per l'imaging e il trapianto di cellule per la produzione di chimere. Queste procedure sono essenziali per l'uso Medaka zebrafish e in un laboratorio per sfruttare al massimo delle loro caratteristiche complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre cloni in un embrione allo scopo di esaminare l'autonomia di un gene o di una proteina di interesse. Ciò si ottiene etichettando gli embrioni di donatori con destrano Rod Domine mediante microiniezione allo stadio di una cellula, come mostrato nel complemento di questo video, microiniezione di embrioni Maka. Il secondo passo della procedura consiste nello sviluppare sia gli embrioni donatori che quelli riceventi allo stadio corretto.

La terza fase della procedura consiste nel rivestire sia gli embrioni della donatrice che quelli della ricevente. La fase finale della procedura consiste nel trapiantare le cellule dagli embrioni del donatore marcati agli embrioni del ricevente. In definitiva, i risultati possono essere ottenuti analizzando la distribuzione, la proliferazione e la differenziazione dei cloni, delle cellule trapiantate attraverso la rilevazione delle cellule trapiantate dai loro traccianti di fluorescenza o di linearità.

Ciao, sono Sean Brazinski del laboratorio del Dr.Makoto Fki nel Dipartimento di Biologia e Biochimica dell'Università di Bath. Anch'io vengo dal laboratorio Zeki. Oggi vi mostreremo una procedura per il trapianto di cellule negli embrioni di pesce scuro.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare con un gene o una mutazione di interesse, ha una funzione autonoma cellulare o non cellulare. Quindi iniziamo. Quando si ricoprono le uova di maka, utilizzare soluzioni e strumenti sterili per migliorare il successo dell'osservazione e della coltura a lungo termine.

Mettere un pezzo di carta vetrata impermeabile P 2000 grana nel coperchio di una capsula di Petri non aderente di nove centimetri. Usa una pipetta per pasta lucidata a bocca larga per trasferire fino a 10 uova appena non raggruppate, pulite ed etichettate da un piatto di uova. Medio rispetto alla carta vetrata.

Rimuovere il terreno in eccesso, lasciandone nel piatto quanto basta per evitare che le uova si secchino. Usa la punta di un dito guantato per arrotolare delicatamente 10 uova alla volta sulla carta vetrata per 45-60 secondi. Per rimuovere i peli della superficie esterna e incidere la superficie in Corian, applicare una pressione minima e mantenere la punta del dito parallela alla carta vetrata.

Trasferisci le uova nel piatto originale di medio. Togliete il terreno, coprite le uova con una soluzione di 20 milligrammi per millilitro di prono. Coprire il piatto e incubare a 27 gradi Celsius per 60 minuti.

Assicurati di posizionare il piatto ad angolo in modo che gli embrioni siano sufficientemente immersi nell'enzima. Al fine di ridurre al minimo l'enzima richiesto, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per recuperare la pronasi per il riutilizzo e metterla sul ghiaccio. Lavare le uova cinque volte in un mezzo embrionale per rimuovere tutte le tracce di prono per evitare che digerisce l'enzima di schiusa.

Aggiungi abbastanza enzima da cova per coprire le uova lavate. Assicurati che le uova rimangano in un unico strato sul fondo del piatto per evitare che si schiaccino mentre il Corian si scioglie. Incubare le uova a 27 gradi Celsius.

Assicurati di posizionare il piatto ad angolo in modo che gli embrioni siano sufficientemente immersi nell'enzima. Al fine di ridurre al minimo l'enzima richiesto, controllare i progressi sotto uno stereomicroscopio da dissezione, nello strato interno del Corian appariranno fori simili prima che si dissolva completamente. Il processo può richiedere fino a 60 minuti a seconda dell'attività enzimatica.

Quando una piccola parte del Corian è disciolta, aspirare immediatamente il singolo uovo con una pipetta per evitare la digestione dell'embrione da parte dell'enzima di schiusa. Trasferire in un piatto pulito di una volta BSS toccando delicatamente la punta della pipetta con una piastra pulita di una volta BSS e lasciando che l'uovo rotoli fuori per ridurre al minimo il trasferimento dell'enzima di schiusa. Usa una pinza per rimuovere il resto del Corian quando tutte le uova sono state trasferite dall'enzima di schiusa.

Effettua un trasferimento finale su un nuovo piatto di una volta BBSS. Aggiungere antibiotici se gli embrioni devono essere portati a una fase successiva dello sviluppo embrionale Dopo la decorazione per questa procedura, iniziare la fase di rivestimento dec 12 embrioni 1,5 ore prima del trapianto. Utilizzare la punta di una pipetta per aggiungere una piccola quantità di metilcellulosa al 3% al centro di un microscopio a cavità.

Scivolare in una capsula di Petri di nove centimetri. Distribuire il liquido sottilmente sulla superficie della depressione. Asciugare la metilcellulosa per due minuti.

Riempire la depressione del vetrino con 350 microlitri di BSS sterile una volta al microscopio da dissezione. Utilizzare una pipetta in vetro lucidato a fuoco a bocca larga per trasferire un donatore e fino a quattro embrioni riceventi sul vetrino. Usa un anello per capelli per orientare gli embrioni in modo che il derm blaster sia rivolto verso l'alto.

Appoggia gli embrioni l'uno contro l'altro per stabilità, se necessario. Inserire delicatamente un microago nel blaster donatore. Derm. Assorbire lentamente da 10 a 20 cellule.

Ora inserisci delicatamente l'ago nell'area pertinente del derm blaster dell'embrione ricevente ed espelli lentamente le cellule del donatore. Non disturbare il confine della sacca del violoncello. Riempire con cura la capsula di Petri con circa 30 millilitri di BSS sterile una volta per immergere gli embrioni e staccare gli embrioni dalla metilcellulosa.

Versare contro il lato del piatto per non rompere gli embrioni. Aggiungere 100 microlitri di penicillina streptomicina nel piatto per una concentrazione approssimativa dello 0,3%Coprire il piatto. Osservare periodicamente gli embrioni se necessario.

Per studi di imaging più lunghi, come il time-lapse e le osservazioni dettagliate, incorporare embrioni rivestiti vivi in aros, anestetizzare gli embrioni vivi per prevenire il movimento aggiungendo un anestetico appropriato al terreno contenente gli embrioni, fondere circa un millilitro di 3%Il punto di fusione basso è sorto in una volta BSS e mantenerlo a 37 gradi Celsius. Se necessario, aggiungere una quantità adeguata di anestetico agli aros per evitare contrazioni lavorando rapidamente per prevenire la solidificazione, utilizzare una pipetta per pasta a bocca larga per riempire il tappo. Depressione di una provetta per microcentrifuga con aros.

Utilizzare una pipetta a bocca larga per spostare un embrione rivestito e anestetizzato nell'aros del cappuccio. Trasferire la minor quantità possibile di terreno con l'embrione. Aggiorna immediatamente l'aros e l'embrione e spostali in una capsula di Petri con fondo di vetro da 3,5 centimetri.

Trasferire il piatto in un piatto da 14 centimetri riempito per un terzo con una miscela di ghiaccio e acqua. Tenere saldamente il piatto più piccolo sul fondo del piatto più grande sotto uno stereomicroscopio da dissezione. Usa un anello per capelli per orientare rapidamente l'embrione come desideri.

Tenere fermo l'embrione fino a quando l'agro non si solidifica. L'embrione può ora essere visualizzato. L'immagine A mostra un embrione donatore e ricevente subito dopo il trapianto.

L'embrione donatore è mostrato a destra con un derma in gesso completamente etichettato in rosso. L'embrione ricevente è mostrato a sinistra ed è facilmente identificabile dalla piccola massa di cellule rosse trapiantate visibili nel blaster. L'immagine B mostra due embrioni riceventi circa sette ore dopo il trapianto. Si noti che le cellule trapiantate sono migrate dal sito di trapianto e sono ora disperse in tutto il blaster.

L'immagine dermica C mostra l'embrione di una ricevente allo stadio 29. Si noti la pigmentazione nell'occhio e la presenza di mefor nel tronco e nella regione del cervello. Si può vedere che le cellule marcate con il domine a bastoncello stanno colonizzando molte delle strutture embrionali indicando il successo della produzione di una chimera.

Ti abbiamo appena mostrato come mangiare embrioni di pesce meca ed eseguire il trapianto di cellule in una fase embrionale precoce. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di trapiantare le cellule del donatore nell'area corretta dell'inm blasted ricevente. Ciò consentirà alle cellule del donatore di differenziarsi nel tipo di cellula corretto.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.