Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR
31 agosto 2010
Langendorff-mode perfusione cuore isolato, in collaborazione con 31 P spettroscopia NMR, combina i campi della biochimica e fisiologia in un esperimento. Il protocollo consente la misurazione dinamica del fosfato ad alto contenuto energetico e il fatturato nel cuore, mentre contemporaneamente il monitoraggio della funzione fisiologica. Quando eseguito correttamente, questa è una tecnica preziosa nella valutazione di Energetica cardiaco.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare la funzione cardiaca e l'energetica in un cuore di topo isolato e perfuso. Questo viene ottenuto perfundendo un cuore di topo in modalità LOR. Come secondo passaggio, utilizzando una soluzione tampone di Krebs-Henseleit arricchita con glucosio e piruvato, si inserisce un palloncino riempito d'acqua nel ventricolo sinistro (VS), che consente un monitoraggio costante della funzione cardiaca durante l'esperimento.
Successivamente, il cuore viene posizionato in un tubo NMR da 10 millimetri e inserito nel magnete per valutare l'energetica cardiaca osservando le risonanze dei fosfati di fosfocreatina, dell'ATP e del fosfato inorganico. I risultati ottenuti mostrano la funzione e l'energetica cardiaca in base alle onde di pressione del ventricolo sinistro e alla spettroscopia di massa del P31. Ciao, sono Steve Kitz del MIT Cadre Metabolism Center del Dipartimento di Anestesiologia dell'Università di Washington. Oggi vi mostrerò una procedura di perfusione cardiaca isolata abbinata alla spettroscopia 31P-NMR.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per valutare la funzione cardiaca e l'energetica nei nostri modelli murini ingegnerizzati. Cominciamo dunque. Per iniziare questo protocollo, preparare un litro di kres, ovvero buffer KH leggero o KH.
Introdurre bolle di anidride carbonica al 5% e ossigeno al 95% nella miscela per 10-15 minuti. Quindi aggiungere cloruro di calcio a 2 millimolari, seguito dai substrati, glucosio a 10 millimolari e piruvato a 0,5 millimolari. Per questi esperimenti, due sistemi separati vengono utilizzati contemporaneamente per ogni acquisizione di spettri di P 31.
Un magnete BRUER da 14 T è collegato a una console avanzata trifase e a un computer dotato di software Top Spin V 2.1 per la valutazione della funzione cardiaca. Un sistema personalizzato per la perfusione cardiaca è collegato al Power Lab. Quattro acquisizioni dati da 30.
Dotato del software lab chart PRO six per l'analisi dei dati. L'apparato per la perfusione cardiaca include una pompa peristaltica mini pulse three controllata da un regolatore di pompa STH, utilizzata per perfondere il cuore con tampone KH; la regolazione della temperatura del cuore durante l'esperimento NMR è fondamentale. Vengono utilizzati circolatori riscaldati per mantenere la temperatura compresa tra 37,0 e 37,5 gradi Celsius mentre il cuore si trova all'interno del magnete, e la temperatura viene monitorata per tutta la durata dell'esperimento mediante una sonda termica a fibra ottica.
Durante tutto l'esperimento, la pressione del ventricolo sinistro e la pressione di perfusione vengono monitorate mediante trasduttori di pressione collegati a un sistema di acquisizione dati e visualizzate tramite il software fornito. Per monitorare la pressione del ventricolo sinistro si utilizza un trasduttore fisiologico, mentre per la pressione di perfusione si impiega un trasduttore monouso per la pressione arteriosa. Infine, un cordone ombelicale viene utilizzato per fornire al cuore il buffer ossigenato e riscaldato.
Una volta all'interno del magnete, prima dell'inizio dell'esperimento, calibrare i trasduttori di pressione utilizzando il manometro a colonna di riferimento: in primo luogo, applicare nessuna pressione al trasduttore per azzerare la calibrazione. Successivamente, gonfiare il manometro a colonna fino a una pressione più elevata. Immettere questo valore nel programma del computer.
Quindi verificare che i trasduttori di pressione siano stati adeguatamente calibrati gonfiando questo manometro a bulbo di figo a pressioni note e verificandole sullo schermo del computer. Una volta calibrati i trasduttori di pressione, calibrare la sonda NMR con un tubo NMR da 10 millimetri contenente un campione standard di fosfato di sodio 150 millimolare. Eseguire la calibrazione utilizzando il programma software Top Spin.
Per prima cosa, regolare il campione per impostare la frequenza della risonanza del fosforo. Successivamente, effettuare il shim del campione per creare un campo magnetico omogeneo. Questa calibrazione iniziale facilita il segnale e riduce il tempo necessario per iniziare il periodo di acquisizione.
Una volta posizionato il cuore all'interno della sonda per iniziare l'estrazione del cuore del topo, iniettare 200 unità di eparina per via intraperitoneale nel topo per ridurre la coagulazione. Dopo cinque minuti, somministrare 175 milligrammi per chilogrammo di pentobarbital sodico per via intraperitoneale. Una volta che il topo è anestetizzato, posizionarlo supino e fissare con del nastro adesivo braccia e gambe per esporre la zona toracica.
Eseguire una compressione del dito del piede per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato. Tagliare. Aprire la cavità peritoneale e il torace con le forbici e utilizzare la pinzetta per sollevare la gabbia toracica ed esporre la cavità toracica. Afferrare il tessuto polmonare e sollevare delicatamente il cuore con le forbici curve.
Tagliare i grossi vasi dietro il cuore e procedere lentamente verso la testa del topo fino a quando il cuore non sarà libero. Arrestare immediatamente il cuore in tampone KH freddo di ghiaccio. Mantenere gli organi sul ghiaccio e rimuovere rapidamente i polmoni.
Identificare i lobi del timo ed estrarli delicatamente per esporre l'aorta. Successivamente, rimuovere il timo. Infine, isolare l'aorta rimuovendo con attenzione ogni tessuto circostante.
Utilizzando pinzette da microsutura, tenere generalmente entrambe le pareti dell'aorta per esporre il lume. Quindi posizionare con attenzione l'aorta sulla cannula. Realizzata in tubo di polietilene con diametro esterno di 0,965 millimetri.
Tenere ferma l'aorta con una pinza per vasi microscopici e legare rapidamente dei punti intorno all'aorta. Una volta annodati i punti, rimuovere la pinza. Utilizzare la pinzetta per verificare con attenzione che la cannula sia posizionata sopra la radice aortica.
Aggiungere eventuali legature aggiuntive necessarie per mantenere il cuore in posizione. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso utilizzando la pinzetta e le forbici microchirurgiche. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'orecchietta sinistra.
Tenere delicatamente il cuore ed inserire con attenzione un tubo in polietilene con diametro esterno di 0,61 millimetri attraverso l'atrio sinistro, la cavità del ventricolo sinistro e fino all'apice. Tagliare l'eccesso di tubo. Successivamente, inserire un palloncino sgonfio riempito d'acqua attraverso l'atrio nel ventricolo sinistro.
Tenere il palloncino in posizione utilizzando nastro adesivo. Aumentare quindi gradualmente la velocità della pompa peristaltica per garantire un flusso sufficiente al cuore. Continuare a perfondere il cuore con tampone KH utilizzando un flusso costante equivalente a circa due millilitri al minuto fino a quando il cuore non viene posizionato nella sonda NMR.
Utilizzare una siringa micrometrica per gonfiare il palloncino del VS con un piccolo volume, al fine di verificare il corretto funzionamento del trasduttore di pressione del VS per la spettroscopia NMR. Inserire con attenzione il cuore in un tubo NMR da 10 millimetri. Intorno al tubo NMR viene posizionato un supporto girevole largo per facilitare l'inserimento del tubo nella posizione corretta.
Nel sensore, fissare saldamente l'intero apparato al cordone ombelicale utilizzando nastro adesivo. Successivamente, abbassare lentamente il cordone ombelicale nel foro superiore del magnete fino a quando il tubo NMR contenente il cuore si trova all'interno della bobina del sensore NMR da 10 millimetri. Una volta che il cuore è nella posizione corretta all'interno del sensore, regolare il flusso della pompa parassita per ottenere una pressione di perfusione di 80 millimetri di mercurio.
Mantenere la pressione di perfusione abilitando il meccanismo di mantenimento sul controllore della pompa. Consentire un periodo di equilibrazione di 15-20 minuti per il cuore. Durante il periodo di equilibrio, regolare il volume del palloncino del VS per raggiungere una pressione diastolica finale compresa tra otto e dieci millimetri di mercurio.
Quindi ottimizzare i parametri dello spettrometro al fine di ottenere il segnale di fosforo migliore possibile. Regolare lo strumento NMR impostando l'impulso radio in modo da far coincidere la frequenza con quella alla quale risuona il nucleo del fosforo. Successivamente, shimare il campione per rendere omogeneo il campo magnetico dopo il periodo di equilibrazione.
Avviare l'acquisizione di spettri multipli di risonanza magnetica nucleare del P 31. Il periodo di acquisizione per ciascuno spettro dipende dall'intensità del campo magnetico, dalle dimensioni del campione e dal rapporto segnale-rumore richiesto per un esperimento specifico. In questo caso, gli spettri vengono ottenuti utilizzando un magnete da 14 Tesla, mediando il segnale ottenuto da 256 impulsi di radiofrequenza di 20 microsecondi con un angolo di ribaltamento di 60 gradi e intervalli di 2,0 secondi.
Questo esperimento richiederà circa 10 minuti. Una misura tipica della funzione cardiaca, la pressione sviluppata del ventricolo sinistro, si ottiene sottraendo la pressione diastolica finale o EDP dalla pressione sistolica. In un topo normale C57BL/6, la pressione sviluppata del ventricolo sinistro è tipicamente compresa tra 100 e 110 millimetri di mercurio a una pressione diastolica finale fissa di otto-dieci millimetri di mercurio.
Vengono mostrate curve di funzionalità rappresentative ottenute da topi di controllo e da topi sottoposti a banding aortico. La funzione sistolica è rappresentata dalla pressione sviluppata nel ventricolo sinistro in rapporto all'aumento del volume del ventricolo sinistro, determinato in base al volume del palloncino nel ventricolo sinistro. La funzione diastolica è rappresentata dalla pressione diastolica finale del ventricolo sinistro in rapporto all'aumento del volume del ventricolo sinistro.
Gli spettri NMR del P 31 di un cuore di topo isolato e perfuso forniscono segnali di FOSFOCREATINA o PCR, dei tre fosfati dell'ATP e del fosfato inorganico o Pi. In questo caso, il picco di Pi è relativamente piccolo. Questo è tipico di un cuore perfuso in condizioni aerobiche e fornito di piruvato o acidi grassi.
Oltre al glucosio durante i periodi di ischemia, questo picco aumenta mentre il picco della PCR diminuisce. Vi ho appena mostrato come preparare un cuore di topo per la perfusione in modo che sia la funzione cardiaca che l'energetica possano essere misurate contemporaneamente durante l'esperimento. È importante assicurarsi che il cuore sia adeguatamente perfuso.
In caso contrario, i dati NMR non saranno affidabili. Questo è tutto. Grazie e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo per la perfusione cardiaca isolata in modalità Langendorff abbinata alla spettroscopia NMR del 31P, che consente la misurazione dinamica dell'energetica cardiaca. Il metodo permette il monitoraggio simultaneo del contenuto di fosfati ad alta energia e della funzione cardiaca in un cuore isolato di topo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia cardiaca
- Chimica biochimica
- Spettroscopia NMR
Sfondo
- La perfusione di Langendorff è una tecnica utilizzata per studiare la funzione cardiaca.
- La spettroscopia NMR del 31P fornisce informazioni sul metabolismo energetico nei tessuti cardiaci.
- Questo metodo consente una valutazione in tempo reale dell'energetica cardiaca.
- Comprendere l'energetica cardiaca è fondamentale per valutare la salute e le malattie del cuore.
Scopo dello studio
- Osservare la funzione cardiaca e l'energetica in un cuore di topo isolato.
- Valutare l'impatto di diversi substrati sulle prestazioni cardiache.
- Sviluppare un protocollo affidabile per futuri studi sull'energetica cardiaca.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del buffer di Krebs-Henseleit con glucosio e piruvato.
- Inserimento di un palloncino riempito d'acqua nel ventricolo sinistro per il monitoraggio della pressione.
- Utilizzo di un tubo NMR da 10 mm per la valutazione dell'energetica cardiaca.
- Calibrazione dei trasduttori di pressione e delle sonde NMR per misurazioni accurate.
Risultati principali
- Isolamento e perfusione riusciti del cuore di topo.
- Monitoraggio in tempo reale della pressione ventricolare sinistra e della pressione di perfusione.
- Misurazione dinamica dei fosfati ad alta energia durante l'esperimento.
- Informazioni sul rapporto tra disponibilità di substrato e funzione cardiaca.
Conclusioni
- Il protocollo combina efficacemente valutazioni fisiologiche e biochimiche.
- Fornisce uno strumento prezioso per lo studio dell'energetica cardiaca in contesti di ricerca.
- Studi futuri potranno basarsi su questa metodologia per esplorare la salute cardiaca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la valutazione simultanea della funzione cardiaca e dell'energetica in cuori isolati di topo, fornendo un sistema fisiologicamente rilevante per l'analisi di modificazioni molecolari nei modelli di malattia cardiovascolare. Integrando la perfusione Langendorff con la spettroscopia NMR di 31P, i ricercatori possono ottenere letture quantitative in tempo reale dei metaboliti fosfati ad alta energia insieme ai parametri emodinamici, supportando l'identificazione meccanicistica dei rischi nella validazione degli obiettivi e nei flussi di screening preclinico. L'approccio aumenta la fiducia predittiva collegando alterazioni molecolari a fenotipi funzionali e metabolici in un sistema rilevante per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando in che modo interventi genetici o farmacologici influenzano l'energetica e la funzione cardiaca in cuori integri e contrattili.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante il monitoraggio simultaneo della pressione sviluppata dal ventricolo sinistro e dei livelli di fosfocreatina/ATP in condizioni di stress fisiologico o patologico.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando composti o modifiche genetiche in grado di preservare l'omeostasi energetica durante sfide ischemia/riperfusione o ad alto carico lavorativo.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo funzioni cardiache di base e livelli di metaboliti in un formato riproducibile con perfusione Langendorff.
- Output quantitativi: Genera misurazioni simultanee in tempo reale della funzione emodinamica (pressione del ventricolo sinistro) e dell'energetica biochimica (PCr, ATP, Pi) per lo sviluppo di saggi multiparametrici.
- Scalabilità e riutilizzo: La piattaforma del cuore isolato può essere adattata a diversi modelli di malattia (ad esempio, costrizione aortica, modelli transgenici) per consentire una valutazione coerente e trasversale ai progetti dei segnali di sicurezza ed efficacia cardiaca.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Valuta direttamente il significato funzionale ed energetico delle modificazioni molecolari in modelli transgenici di patologia cardiaca, sostenendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Continuità preclinica: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta con la valutazione preclinica, fornendo un parametro quantitativo e fisiologicamente ancorato dello stato di salute cardiaco.
- Decisioni basate sul rischio: Orienta i criteri decisionali di prosecuzione o interruzione indicando precocemente un malfunzionamento energetico che potrebbe prevedere un insuccesso clinico in fase avanzata nei programmi cardiovascolari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, offrendo una piattaforma riutilizzabile per valutare la tossicità cardiaca e il legame al bersaglio in sistemi pertinenti alla malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a modifiche misurabili nell'energetica cardiaca e nella funzione contrattile.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso condizioni di perfusione controllate, monitoraggio in tempo reale della pressione e acquisizione costante degli spettri NMR.
- Analisi: Fornisce letture quantitative e multiparametriche (pressione sviluppata nel ventricolo sinistro, pressione di fine diastole, rapporti PCr/ATP, spostamenti del Pi) che consentono confronti oggettivi tra diverse condizioni sperimentali e trattamenti con composti.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica mantenendo la rilevanza fisiologica e permettendo al contempo l'analisi biochimica dei percorsi metabolici in cuori integri.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità scalabile e trasversale applicabile a programmi di tossicità cardiovascolare, metabolica e mitocondriale in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica correlando i cambiamenti molecolari con misurazioni dirette della funzione cardiaca e del metabolismo dei fosfati ad alta energia.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di preparazione dei tamponi, controllo della temperatura, calibrazione del trasduttore di pressione e shimminatura NMR.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale identificando precocemente composti cardiotoxici o che alterano il metabolismo, riducendo l'abbandono in fase avanzata dello sviluppo di farmaci cardiovascolari.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio di bersagli e composti promettenti fornendo informazioni tempestive sulla riserva energetica e sulla resistenza allo stress nei modelli di malattia.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nella perfusione cardiaca isolata, nella spettroscopia NMR e nella calibrazione del trasduttore di pressione.
- È subordinato all'accesso a spettrometri NMR ad alto campo (ad esempio, 14T) e a dispositivi di perfusione specializzati compatibili con i vincoli del foro del magnete.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi (fisiologia, farmacologia e analisi NMR) per garantire un'acquisizione e un'interpretazione dei dati coerenti.
- Le considerazioni per l'adattamento includono aggiustamenti specifici del modello relativi alla pressione di perfusione, al volume del palloncino e alla composizione del substrato in base al fenotipo della malattia o al background genetico.
- I limiti pratici comprendono i vincoli rapporto segnale-rumore nella rilevazione di metaboliti a bassa abbondanza e la necessità di escludere rigorosamente gli artefatti ischemici durante l'allestimento.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.534Z&w=384&q=75)
