Name: Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Impara a valutare la funzione cardiaca e l'energetica in cuori di topo isolati mediante spettroscopia NMR 31P. Questo protocollo combina perfusione Langendorff e monitoraggio della pressione ventricolare sinistra per studi metabolici cardiaci in tempo reale.

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Gli autori desiderano ringraziare Lynne Spencer per il suo sostegno durante la fase di spettroscopia NMR di questo esperimento. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health fondo HL059246 R01, R01 HL067970, R01 HL088634 (il dottor Tian) e F32 HL096284 (al Dott. Kolwicz).

<ol><li> Per questi esperimenti, due sistemi separati sono utilizzati contemporaneamente. Per l'acquisizione di 31 spettri P, un magnete Bruker 14T è interfacciato con il III Avance console e un computer dotato di software TopSpin V2.1. Per la valutazione della funzione cardiaca, un sistema personalizzato costruito perfusione cardiaca è interfacciato con il PowerLab 4 / 30 di acquisizione dati, dotato di 6 LabChartPro il software per l'analisi dei dati. </li><li> Il giorno dell'esperimento, 1 litro di Krebs-Henseleit buffer è preparato come segue: 0,5 mm EDTA, KCl 5,3 mm, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl, NaHCO 3 e 25 mm. La miscela viene poi bollito con 5% di CO 2 / 95% O 2 per 10-15 minuti prima dell'aggiunta di 2mM CaCl 2. Infine, i substrati, sotto forma di 10 mM glucosio e piruvato 0,5 mm, vengono aggiunti. </li><li> Regolazione della temperatura durante l'esperimento è critica. Circolatori riscaldamento vengono utilizzati per mantenere la temperatura tra i 37,0-37,5 ° C, mentre il cuore si trova all'interno del magnete. La temperatura è monitorata per tutta la durata dell'esperimento utilizzando una sonda di temperatura in fibra ottica. </li><li> Pressione di perfusione e la pressione del ventricolo sinistro sono monitorati tramite trasduttori di pressione collegata ad un sistema di acquisizione dati e visualizzati utilizzando il software incluso. Questi sono tarati con uno sfigmomanometro standard di prima dell'esperimento. Inoltre, le linee di pressione sono lavata in modo adeguato al fine di rimuovere tutte le bolle d'aria. </li><li> Un campione standard di 150 mM fosfato di sodio (il che è equivalente alla forza ionica del tampone KH) è usato per "calibrare" la sonda prima l'inserimento del cuore. Questo facilita il segnale e diminuisce il tempo necessario per iniziare il periodo di acquisizione, una volta il cuore è posizionato all'interno della sonda. </li><li> Per ridurre la coagulazione, il mouse viene iniettato con 200 unità di eparina IP Dopo 5 minuti, sodio pentobarbital (175 mg / kg) IP è dato. </li><li> Il cuore è rapidamente asportato (con i polmoni e timo intatto) e arrestato nel ghiaccio freddo KH buffer. </li><li> Mentre tenuta in ghiaccio, i polmoni sono rapidamente rimosse. I lobi del timo sono identificati e delicatamente pelati indietro per esporre l'aorta. Il timo è stato rimosso. L'aorta viene poi isolata con cura rimuovere qualsiasi tessuto circostante. </li><li> Micro pinze sutura vengono utilizzati per tenere delicatamente entrambe le pareti dell'aorta per esporre il lume. L'aorta viene accuratamente posizionato sulla cannula fatto da 0,965 mm esterno tubo di polietilene (PE50). L'aorta viene tenuta in posizione con un morsetto nave micro mentre suture sono rapidamente legato intorno l'aorta. La clip viene rimosso e la pinza sono utilizzati per controllare con attenzione che la cannula è al di sopra della radice aortica. Vincoli aggiuntivi vengono aggiunti se necessario per tenere il cuore a posto. </li><li> Qualsiasi tessuto in più viene rimossa con pinze e microscissors. Una piccola incisione viene fatta in atrio sinistro. A mm 0,61 diametro esterno tubo di polietilene (PE10) viene accuratamente inserito attraverso l'atrio sinistro, cavità ventricolare sinistra, e attraverso l'apice, mentre delicatamente tenendo il cuore. Il tubo in eccesso viene tagliato. </li><li> Un sgonfiato pieni d'acqua palloncino viene inserito attraverso l'atrio nel LV e viene tenuto in posizione con del nastro adesivo o suture. La velocità della pompa peristaltica viene gradualmente aumentata per fornire un flusso sufficiente al cuore. Fino a quando il cuore è posto nella la sonda NMR, il cuore continuerà ad essere perfusi con flusso costante pari a circa 2 ml / min. Il palloncino viene gonfiato LV con un piccolo volume, utilizzando una siringa micrometro per verificare che il trasduttore di pressione bassa tensione è in funzione. </li><li> Il cuore è accuratamente inserito in un tubo NMR 10 mm. Un ampio foro "filatrice" è usato per guidare il tubo nella posizione corretta all'interno della sonda. L'intero apparato è quindi saldamente al "cordone ombelicale" con nastro adesivo. </li><li> Il cordone ombelicale è lentamente abbassato nel foro superiore del magnete fino a quando il cuore / NMR tubo è all'interno della bobina della sonda 10 mm NMR. </li><li> Una volta che il cuore è nella posizione corretta all'interno della sonda, il flusso della pompa peristaltica è regolato in modo da raggiungere una pressione di perfusione di 80mmHg. (Ricordate, che fino a questo punto il cuore era perfuso con un flusso costante di circa 2 ml / min). La pressione di perfusione è quindi mantenuto attivando il meccanismo di "hold" sul controller della pompa. Il cuore è poi consentito un periodo di equilibrio di 15-20 minuti. Durante quel periodo, il volume del pallone LV è regolata per ottenere una pressione telediastolica di 8-10 mmHg. </li><li> Durante il periodo di equilibrio, è necessario ottimizzare i parametri dello spettrometro in modo da ottenere il segnale di fosforo migliore possibile. Questo si ottiene impostando l'impulso radio alla frequenza con cui il nucleo fosforo risuona ("tuning") e rendendo il campo magnetico omogeneo ("shimming"). </li><li> Dopo il periodo di equilibrio, più 31 P spettri NMR può essere ottenuto. Il periodo di acquisizione per ogni spettro dipende da tha intensità di campo del magnete, la dimensione del campione, e il rapporto segnale-rumore richiesti da un esperimento specifico. Spettri sono ottenuti utilizzando un magnete 14 Telsa facendo la media del segnale ottenuto da impulsi radio 256 frequenza di 20 ms con un angolo di 60 gradi a fogli mobili e ritardo di 2,0 secondi. Questo esperimento richiede circa 10 min. </li></ol> Rappresentante Risultati Dall'hardware di acquisizione dati e il software LabChart, diversi parametri della funzione cardiaca può essere misurata in tutto il protocollo sperimentale. La misura tipica della funzione cardiaca, la pressione sviluppata ventricolare sinistra (LVDevP), si ottiene sottraendo la pressione telediastolica (EDP) dalla pressione sistolica (Figura 1). Questa misura può variare a seconda del ceppo del mouse e la condizione del cuore (cioè, sovraccarico di pressione). Tuttavia, in un normale C57BL6 LVDevP cuore del mouse è in genere tra 100-110 mmHg fisso pressione telediastolica di 8-10 mmHg. Inoltre, il programma permette LabChart per la misurazione della frequenza cardiaca in base alla misurazione ciclico delle onde di pressione LV. Ancora una volta, questa misura può variare, ma i valori tipici sono 350-400 bpm quando i cuori sono autorizzati a battere a tassi intrinseca. Tuttavia, il cuore può essere standardizzato mediante un sistema di stimolazione dove è conservata la frequenza cardiaca a 420 bpm. Inoltre, le misure di contrattilità (+ dP / dt) e rilassamento (-dP/dt) può essere stimato utilizzando la derivata prima l'onda di pressione LV. Durante il protocollo sperimentale è facile valutare il meccanismo di Starling incorporando un rapporto pressione-volume. Questo si ottiene effettuando aumenti graduali nel volume pallone LV e rilevando la LVDevP così come per i disavanzi eccessivi. Questi valori possono essere rappresentati come illustrato nella figura 2. Mentre la curva di Starling è ottimale, notando il volume necessario per ottenere un EDP di 8-10 mmHg, può dare un'idea indiretta della dimensione LV da camera. Questo può essere utilizzato nei modelli di banding aortico come cuore ipertrofico di solito richiedono un volume più piccolo palloncino, mentre i cuori dilatati richiedono un volume maggiore rispetto ai controlli. La tabella 1 mostra i dati rappresentativi funzione cardiaca, acquisite durante il protocollo di perfusione. Il P 31 spettrometro NMR fornirà segnali di fosfocreatina (PCr) e le tre fosfati di ATP (γ-ATP, α-ATP, e β-ATP) e fosfato inorganico (Pi) come mostrato nella Figura 2. Analisi di ciascuno di questi picchi fornisce un valore per l'area sotto la curva. La quantità di ATP è stimato dalla media dei γ-ATP e β-ATP aree. (L'α-ATP non viene utilizzato perché le molecole NAD contribuire ad una parte sconosciuta del segnale totale). Lo stato energetico del cuore è determinato dal rapporto tra la PCR e aree ATP (PCR: il rapporto ATP). Questo valore è tipicamente 1,5-1,7 in un cuore mouse fornito con il glucosio come substrato primario. Anche se 31 P NMR non prevede misure dirette di ATP e PCr, l'area dei picchi è proporzionale alla quantità dei composti contenenti fosforo nel campione. I valori per questi segnali possono essere stimati utilizzando altri metodi. Per esempio, le misure dirette di ATP da alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) in una coorte di cuore può produrre una concentrazione media. Questo valore può quindi essere utilizzato per calibrare le superfici medie ATP osservato negli spettri. La concentrazione di PCr può essere calcolata sulla base dell'area PCr relative all'area ATP. E 'anche possibile stimare il pH, analizzando il passaggio relativo chimica del fosfato inorganico (Pi) al segnale PCr. 1 Usando diverse sequenze di impulsi radio, la creatina chinasi velocità di reazione o la velocità di sintesi di ATP reazione può anche essere misurata 2. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Baseline funzione cardiaca da isolate cuori perfusi. LVDevP: pressione ventricolare sinistra sviluppati; LVEDP: ventricolare sinistra telediastolica pressione; HR: frequenza cardiaca; RPP: pressioni sul tasso di prodotto; + dP / dt: prima pressione derivato LV positiva; -dP/dt: prima pressione derivato LV negativo; PP : pressione di perfusione; CF: flusso coronarico. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentante onde di pressione bassa tensione da un software LabChart Pro. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curve di Starling Rappresentante di controllo (linea continua) e aortica bande (linee tratteggiate) topi. A) funzione sistolica rappresentata da LVDevP oltre l'aumento dei volumi LV come determinato dal volume del pallone LV. B) la funzione diastolica come rappresentato dalla EDP oltre l'aumento dei volumi LV come determinato dal volume del pallone LV. LVDevP: pressione ventricolare sinistra sviluppati (sistolica meno p diastolicaressure); EDP: pressione telediastolica. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rappresentante 31 P spettri NMR di cuore isolato perfuso del mouse. Si noti il ​​picco relativamente piccolo Pi. In un cuore aerobico perfuse fornito con acidi grassi piruvato o in aggiunta al glucosio, questo picco dovrebbe essere minimo. Durante i periodi di ischemia, questo aumenta di picco, mentre il picco PCr diminuisce. Si noti la spalla destra del picco α-ATP. Questo è il contributo di molecole di NAD. Pi: fosfato inorganico; PCr: fosfocreatina, ATP: adenosintrifosfato.

<ol><li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li>
<li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A%2831%29P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li>
<li>Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles.</a> Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).</li>
<li>Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngwall%2C+JS+%22Cardiovascular+physiology+in+the+genetically+engineered%22">Cardiovascular physiology in the genetically engineered</a>. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).</li>
<li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li>
<li>Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+uptake+and+oxidation+in+mouse+hearts+prevent+high+fatty+acid+oxidation+but+cause+cardiac+dysfunction+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity.</a> Circulation. 119, 2818-2828 (2009).</li>
<li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

31 P spettroscopia NMR nel Langendorff-perfuso cuore del mouse isolato fornisce dati affidabili e riproducibili. 3, 4 Tuttavia, è imperativo che cannulazione dell&#39;aorta e l&#39;inserimento del palloncino LV sono fatte correttamente tali da consentire stabile funzioni cardiache mentre all&#39;interno del NMR tubo. In aggiunta, la regolazione della temperatura è fondamentale per ottenere il corretto funzionamento di base. Un fattore importante per ottenere buone, analizzabili spettri NMR è in aumento il rapporto segnale-rumore. Ciò può essere ottenuto facendo in modo ottimale &quot;tuning&quot; e &quot;spessoramento&quot; sul campione. Come accennato nel testo del protocollo, l&#39;uso di un campione standard prima l&#39;inserimento del cuore può facilitare questo. E &#39;anche utile avere un adeguato imprese &quot;campione&quot;. Cuori di peso inferiore a 100 mg in genere forniscono inferiore PCr e segnali ATP così aumenta in tempo di acquisizione sarà necessario per ottenere spettri buona fosforo. Ci sono diversi modi per modificare l&#39;attuale protocollo di raccogliere ulteriori informazioni riguardanti la funzione cardiaca ed energetica. Nel nostro laboratorio, abbiamo i cuori perfusi con tampone substrato misto che può includere la presenza di diverse combinazioni di acidi grassi (in concentrazioni basse e alte), lattato, chetoni, e l&#39;insulina. Con l&#39;uso di isotopi stabili nel buffer di perfusione (cioè, 13 C etichettato substrati), possediamo la capacità di stimare l&#39;utilizzo del substrato per il contributo relativo della etichettati acetil-CoA nel ciclo TCA. 5-7 Per questa applicazione, eseguiamo isotopomero analisi di 13 e 13 C3-C4-glutammato con 13 C spettroscopia NMR. Ciò richiede freeze-bloccaggio del cuore, alla fine del protocollo di perfusione e di eseguire una estrazione del tessuto congelato. Questo sarà un ulteriore esperimento in quanto l&#39;analisi richiede l&#39;utilizzo di una sonda diversa con parametri di installazione separato. Altre applicazioni includono la sostituzione del glucosio con desossiglucosio nel buffer durante il monitoraggio del tempo-dipendente accumulo di 2-fosfato desossiglucosio nel cuore con 31 P spettroscopia NMR. Questo metodo consente la misura del consumo di glucosio del miocardio. 7, 8 Inoltre, il nostro laboratorio ha analizzato la funzione cardiaca ed energetica nei protocolli di perfusione costituito da ischemia / riperfusione e sfida elevato carico di lavoro. 6, 8-10 In sintesi, 31 P spettroscopia NMR nei cuori del mouse isolato è una procedura tecnicamente impegnativo che richiede l&#39;uso di attrezzature sofisticate. Tuttavia, i dati che produce un valore inestimabile per il ricercatore che desidera analizzare la funzione energetica e dei modelli di topo geneticamente. Per il nostro laboratorio, queste tecniche sono state fondamentali nella nostra comprensione delle conseguenze di una varietà di fattori di stress sulla funzione cardiaca, energetica, e il metabolismo. 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>Attrezzatura</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltic Pump&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;Disposable BP Transducer&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo campione NMR da 10 mm</td><td>Attrezzatura</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione in polietilene PE10</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;Physiological Pressure Transducer&lt;/a&gt;</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione in polietilene PE50</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Siringa micrometrica</td><td>Attrezzatura</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette McPherson</td><td>Attrezzatura</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Forbici microchirurgiche Castraviejo</td><td>Attrezzatura</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Condizionatore di segnale Neoptix</td><td>Attrezzatura</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione cardiaca e energetica nel cuori mouse isolato mediante 31 p spettroscopia nmr

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Modelli murini bioingegneria sono diventati strumenti di ricerca potenti nel determinare relazioni causali tra alterazioni molecolari e modelli di malattie cardiovascolari. Sebbene la biologia molecolare è necessario identificare i cambiamenti chiave nella via di segnalazione, non è un surrogato significato funzionale. Mentre fisiologia può fornire risposte alla domanda di funzione, che combina la fisiologia con la valutazione biochimica di metaboliti nel intatto, cuore pulsante permette un quadro completo della funzione cardiaca ed energetica. Per anni, il nostro laboratorio ha utilizzato perfusione cuore isolato in combinazione con risonanza magnetica nucleare (NMR) per eseguire questa operazione. Funzione ventricolare sinistra viene valutata Langendorff-mode perfusione cuore isolato mentre energetica cardiaca è misurata eseguendo<sup&gt; 31</sup&gt; P spettroscopia di risonanza magnetica del cuore perfuso. Con queste tecniche, gli indici di funzionalità cardiaca, in combinazione con i livelli di fosfocreatina e ATP possono essere misurate simultaneamente a battere i cuori. Inoltre, questi parametri possono essere monitorati, mentre i fattori di stress fisiologici o patologici sono istituiti. Per esempio, l&#39;ischemia / riperfusione o ad alta protocolli sfida carico di lavoro può essere adottato. L&#39;uso di aortica bande o altri modelli di patologia cardiaca tendono pure. Indipendentemente delle varianti all&#39;interno del protocollo, il significato funzionale ed energetica di modificazioni molecolari di modelli di topi transgenici possono essere adeguatamente descritte, portando a una nuova comprensione delle vie enzimatiche e metaboliche associate. Pertanto,<sup&gt; 31</sup&gt; P spettroscopia NMR nel cuore isolato perfuso è una tecnica di ricerca di valore in modelli animali di malattie cardiovascolari.

Langendorff-mode perfusione cuore isolato, in collaborazione con<sup&gt; 31</sup&gt; P spettroscopia NMR, combina i campi della biochimica e fisiologia in un esperimento. Il protocollo consente la misurazione dinamica del fosfato ad alto contenuto energetico e il fatturato nel cuore, mentre contemporaneamente il monitoraggio della funzione fisiologica. Quando eseguito correttamente, questa è una tecnica preziosa nella valutazione di Energetica cardiaco.

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

I modelli murini bioingegnerizzati sono diventati potenti strumenti di ricerca per determinare le relazioni causali tra alterazioni molecolari e modelli di ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare la funzione cardiaca e l'energetica in un cuore di topo isolato e perfuso. Questo viene ottenuto perfundendo un cuore di topo in modalità LOR. Come secondo passaggio, utilizzando una soluzione tampone di Krebs-Henseleit arricchita con glucosio e piruvato, si inserisce un palloncino riempito d'acqua nel ventricolo sinistro (VS), che consente un monitoraggio costante della funzione cardiaca durante l'esperimento.Successivamente, il cuore viene posizionato in un tubo NMR da 10 millimetri e inserito nel magnete al fine di valutare l'energetica cardiaca osservando le risonanze dei fosfati di fosfocreatina, dell'ATP e del fosfato inorganico. I risultati ottenuti mostrano la funzione e l'energetica cardiaca in base alle onde di pressione del ventricolo sinistro e alla spettroscopia di fosforo-31 e di spettrometria di massa. Ciao, sono Steve Kitz del Centro di Metabolismo MIT Cadre del Dipartimento di Anestesiologia dell'Università di Washington. Oggi vi mostrerò una procedura di perfusione cardiaca isolata abbinata alla spettroscopia 31P-NMR.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per valutare la funzione cardiaca e l'energetica nei nostri modelli murini ingegnerizzati. Cominciamo dunque. Per iniziare questo protocollo, preparare un litro di buffer kres, noto anche come buffer KH.Introdurre bolle di anidride carbonica al 5% e ossigeno al 95% nella miscela per 10-15 minuti. Quindi aggiungere cloruro di calcio a 2 millimolari, seguito dai substrati, glucosio a 10 millimolari e piruvato a 0,5 millimolari. Per questi esperimenti, due sistemi separati vengono utilizzati contemporaneamente per ogni acquisizione di spettri di P 31.Un magnete BRUER da 14 T è collegato a una console avanzata tripla e a un computer dotato di software Top Spin V 2.1 per la valutazione della funzione cardiaca. Un sistema personalizzato di perfusione cardiaca è collegato al Power Lab. Quattro acquisizioni dati da 30.Dotato del software lab chart PRO six per l'analisi dei dati. L'apparato per la perfusione cardiaca include una pompa peristaltica mini pulse three controllata da un regolatore di pompa STH, utilizzata per perfondere il cuore con tampone KH; la regolazione della temperatura del cuore durante l'esperimento NMR è fondamentale. Vengono utilizzati circolatori riscaldati per mantenere la temperatura tra 37,0 e 37,5 gradi Celsius mentre il cuore si trova all'interno del magnete, e la temperatura viene monitorata per tutta la durata dell'esperimento mediante una sonda termica a fibra ottica.Durante tutto l'esperimento, la pressione del ventricolo sinistro e la pressione di perfusione vengono monitorate mediante trasduttori di pressione collegati a un sistema di acquisizione dati e visualizzate tramite il software fornito. Per monitorare la pressione del ventricolo sinistro si utilizza un trasduttore fisiologico, mentre per la pressione di perfusione si impiega un trasduttore monouso per la pressione arteriosa. Infine, un cordone ombelicale viene utilizzato per fornire al cuore il buffer ossigenato e riscaldato.Una volta all'interno del magnete, prima dell'inizio dell'esperimento, calibrare i trasduttori di pressione con il manometro a colonna di riferimento: in primo luogo, applicare nessuna pressione al trasduttore per azzerare la calibrazione. Successivamente, gonfiare il manometro a colonna a una pressione più elevata. Immettere questo valore nel programma del computer.Quindi verificare che i trasduttori di pressione siano stati adeguatamente calibrati gonfiando questo manometro a bulbo di Fick a pressioni note e verificandole sullo schermo del computer. Una volta calibrati i trasduttori di pressione, calibrare la sonda NMR con un tubo NMR da 10 millimetri contenente un campione standard di fosfato di sodio 150 millimolare. Eseguire la calibrazione utilizzando il programma software Top Spin.Per prima cosa, regolare il campione per impostare la frequenza della risonanza del fosforo. Successivamente, effettuare il shim del campione per creare un campo magnetico omogeneo. Questa calibrazione iniziale facilita il segnale e riduce il tempo necessario per iniziare il periodo di acquisizione.Una volta posizionato il cuore all'interno della sonda per iniziare l'estrazione del cuore del topo, iniettare nel topo 200 unità di eparina per via intraperitoneale per ridurre la coagulazione. Dopo cinque minuti, somministrare 175 milligrammi per chilogrammo di pentobarbital sodico per via intraperitoneale. Una volta che il topo è anestetizzato, posizionarlo supino e fissare con del nastro adesivo le zampe anteriori e posteriori per esporre la zona toracica.Eseguire una compressione del dito del piede per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato. Tagliare. Aprire la cavità peritoneale e il torace con le forbici e utilizzare la pinza per sollevare la gabbia toracica ed esporre la cavità toracica. Afferrare il tessuto polmonare e sollevare delicatamente il cuore con le forbici curve.Tagliare i grossi vasi dietro il cuore e procedere lentamente verso la testa del topo fino a quando il cuore non sarà libero. Arrestare immediatamente il cuore in tampone KH freddo di ghiaccio. Mantenere gli organi sul ghiaccio e rimuovere rapidamente i polmoni.Identificare i lobi del timo ed estrarli delicatamente per esporre l'aorta. Successivamente, rimuovere il timo. Infine, isolare l'aorta rimuovendo con attenzione tutti i tessuti circostanti.Utilizzando pinze per sutura microchirurgica, tenere generalmente entrambe le pareti dell'aorta per esporre il lume. Quindi posizionare con attenzione l'aorta sulla cannula. Realizzata in tubo di polietilene con diametro esterno di 0,965 millimetri.Tenere ferma l'aorta con una pinza per vasi microscopici e legare rapidamente dei punti intorno all'aorta. Una volta annodati i punti, rimuovere la pinza. Utilizzare la pinzetta per verificare con attenzione che la cannula sia posizionata sopra la radice aortica.Aggiungere eventuali legature aggiuntive necessarie per mantenere il cuore in posizione. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso utilizzando la pinzetta e le forbici microchirurgiche. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'orecchietto sinistro.Tenere delicatamente il cuore e inserire con attenzione un tubo in polietilene con diametro esterno di 0,61 millimetri attraverso l'atrio sinistro, la cavità del ventricolo sinistro e fino all'apice. Tagliare l'eccesso di tubo. Successivamente, inserire un palloncino sgonfio riempito d'acqua attraverso l'atrio nel ventricolo sinistro.Tenere il palloncino in posizione utilizzando nastro adesivo. Quindi aumentare gradualmente la velocità della pompa peristaltica per garantire un flusso sufficiente al cuore. Continuare a perfondere il cuore con buffer KH utilizzando un flusso costante equivalente a circa due millilitri al minuto fino a quando il cuore non viene posizionato nella sonda NMR.Insuffiare il palloncino del VD con un piccolo volume utilizzando una siringa micrometrica per verificare il corretto funzionamento del trasduttore di pressione del VD per la spettroscopia NMR. Inserire con attenzione il cuore in un tubo NMR da 10 millimetri. Intorno al tubo NMR viene posizionato un supporto largo per aiutare a guidare il tubo nella posizione corretta.All'interno della sonda, fissare saldamente l'intero apparato al cordone ombelicale utilizzando nastro adesivo. Successivamente, abbassare lentamente il cordone ombelicale nel foro superiore del magnete fino a quando il tubo NMR contenente il cuore non si trova all'interno della bobina della sonda NMR da 10 millimetri. Una volta che il cuore si trova nella posizione corretta all'interno della sonda, regolare il flusso della pompa parassita in modo da ottenere una pressione di perfusione di 80 millimetri di mercurio.Mantenere la pressione di perfusione abilitando il meccanismo di blocco sul controllore della pompa. Consentire un periodo di equilibrazione di 15-20 minuti per il cuore. Durante il periodo di equilibrio, regolare il volume del palloncino del VS per ottenere una pressione diastolica finale compresa tra otto e dieci millimetri di mercurio.Quindi ottimizzare i parametri dello spettrometro al fine di ottenere il segnale di fosforo migliore possibile. Regolare lo strumento NMR impostando l'impulso radio in modo da far coincidere la frequenza di risonanza del nucleo di fosforo. Successivamente, effettuare lo shim del campione per rendere omogeneo il campo magnetico dopo il periodo di equilibrazione.Avviare l'acquisizione di spettri multipli di risonanza magnetica nucleare del fosforo-31 (P 31 NMR). Il periodo di acquisizione per ciascuno spettro dipende dall'intensità del campo magnetico, dalle dimensioni del campione e dal rapporto segnale-rumore richiesto per un esperimento specifico. In questo caso, gli spettri vengono ottenuti utilizzando un magnete da 14 Tesla, mediando il segnale ottenuto da 256 impulsi di radiofrequenza di 20 microsecondi con un angolo di ribaltamento di 60 gradi e intervalli di 2,0 secondi.Questo esperimento richiederà circa 10 minuti. Una misura tipica della funzione cardiaca, la pressione sviluppata del ventricolo sinistro, si ottiene sottraendo la pressione diastolica finale o EDP dalla pressione sistolica. In un topo normale C57BL/6, la pressione sviluppata del ventricolo sinistro è tipicamente compresa tra 100 e 110 millimetri di mercurio a una pressione diastolica finale fissa di otto-dieci millimetri di mercurio.Vengono mostrate curve di funzionalità rappresentative ottenute da topi di controllo e da topi sottoposti a benda aortica. La funzione sistolica è rappresentata dalla pressione sviluppata del ventricolo sinistro in relazione all'aumento del volume del ventricolo sinistro, determinato in base al volume del catetere intraventricolare. La funzione diastolica è rappresentata dalla pressione diastolica del ventricolo sinistro in relazione all'aumento del volume del ventricolo sinistro.Gli spettri NMR del P 31 di un cuore di topo isolato e perfuso forniscono segnali di FOSFOCREATINA o PCR, dei tre fosfati dell'ATP e del fosfato inorganico o Pi. In questo caso, il picco di Pi è relativamente piccolo. Questo è tipico di un cuore perfuso in condizioni aerobiche e fornito di piruvato o acidi grassi.Oltre al glucosio durante i periodi di ischemia, questo picco aumenta mentre il picco della PCR diminuisce. Vi ho appena mostrato come preparare un cuore di topo per la perfusione in modo che sia la funzione cardiaca che l'energetica possano essere misurate contemporaneamente durante l'esperimento. È importante assicurarsi che il cuore sia adeguatamente perfuso.Altrimenti, i vostri dati NMR non saranno affidabili. Questo è tutto. Grazie e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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