Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante ³¹ P spettroscopia NMR

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare la funzione cardiaca e l'energia in un cuore di topo isolato perfuso. Ciò si ottiene perfondendo il cuore di un mouse in modalità LOR. Con il tampone di selezione manuale di Krebs arricchito con glucosio e piruvato come seconda fase, un palloncino riempito d'acqua viene inserito nel ventricolo sinistro o nel ventricolo sinistro, che consente il monitoraggio costante della funzione cardiaca durante l'esperimento.

Successivamente, il cuore viene inserito in un tubo NMR da 10 millimetri e inserito nel magnete al fine di valutare l'energia cardiaca osservando le risonanze dei fosfocreatina fosfati di un TP e sono stati ottenuti i risultati del fosfato inorganico che mostrano la funzione cardiaca e l'energetica sulla base delle onde di pressione del ventricolo sinistro e P 31 e una spettroscopia di massa p. Sono Steve Kitz del MIT Cadre Metabolism Center presso il Dipartimento di Anestesiologia dell'Università di Washington. Oggi vi mostrerò una procedura per la perfusione cardiaca isolata combinata con la spettroscopia 31 PNMR.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per valutare la funzione cardiaca e l'energia nei nostri modelli murini bioingegnerizzati. Quindi iniziamo. Per iniziare questo protocollo, prepara un litro di kres, quindi tampone leggero o KH.

Introdurre il 5% di anidride carbonica e il 95% di bolle di ossigeno nella miscela per 10-15 minuti. Quindi aggiungere due millimolari di cloruro di calcio, seguiti da substrati, 10 millimolari di glucosio e 0,5 millimolari di piruvato. Per questi esperimenti, vengono utilizzati contemporaneamente due sistemi separati per l'acquisizione di spettri P 31.

Un magnete BRUER 14 T è interfacciato con l'avanzata console three e un computer dotato del software top spin V 2.1 per la valutazione della funzione cardiaca. Un sistema di perfusione cardiaca costruito su misura è interfacciato con il laboratorio di potenza. Quattro 30 richiesta di dati.

Dotato del software Lab Chart PRO six per l'analisi dei dati. L'apparato di perfusione cardiaca include una pompa peristaltica a tre impulsi mini controllata da un controller della pompa STH utilizzata per perfondere il tampone KH nella regolazione della temperatura cardiaca durante l'esperimento NMR. I circolatori riscaldati vengono utilizzati per mantenere la temperatura tra 37,0 e 37,5 gradi Celsius mentre il cuore è all'interno del magnete e la temperatura viene monitorata per tutta la durata dell'esperimento utilizzando una sonda di temperatura in fibra ottica.

Durante l'esperimento, la pressione ventricolare sinistra e la pressione di perfusione vengono monitorate tramite trasduttori di pressione collegati a un sistema di acquisizione dati e visualizzati utilizzando il software incluso. Un trasduttore fisiologico viene utilizzato per monitorare la pressione ventricolare sinistra e un trasduttore di pressione sanguigna monouso viene utilizzato per monitorare la pressione di perfusione. Infine, un cordone ombelicale viene utilizzato per fornire il tampone ossigenato riscaldato al cuore.

Una volta all'interno del magnete, prima dell'inizio dell'esperimento, tarare i trasduttori di pressione con gli standard del manometro del momento fig primo posto, nessuna pressione nel trasduttore, per azzerare la calibrazione. Quindi gonfiare questo manometro in modalità fig a una pressione più alta. Immettere questo valore nel programma per computer.

Quindi verificare che i trasduttori di pressione siano stati adeguatamente calibrati gonfiando questo manometro del momento fig a pressioni note e verificandole sullo schermo del computer. Una volta tarati i trasduttori di pressione, tarare la sonda NMR con un tubo NMR da 10 millimetri contenente un campione standard di fosfato di sodio da 150 millimolari. Eseguire la calibrazione utilizzando il programma software top spin.

Innanzitutto, sintonizzare il campione per impostare la frequenza della risonanza del fosforo. Quindi spessorare il campione per creare un campo magnetico omogeneo. Questa calibrazione iniziale facilita il segnale e diminuisce il tempo necessario per iniziare il periodo di acquisizione.

Una volta che il cuore è posizionato all'interno della sonda per avviare l'estrazione del cuore del topo, iniettare nel topo 200 unità di eparina intraperitoneale per ridurre la coagulazione. Dopo cinque minuti, somministrare 175 milligrammi per chilogrammo di sodio Penta barbital intraperitoneale. Una volta che il topo è anestetizzato, posizionalo sulla schiena e fissa le braccia e le gambe con del nastro adesivo per esporre la zona del torace.

Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato. Tagliare. Apri la cavità peritoneale e il torace con le forbici e usa una pinza per staccare la gabbia toracica ed esporre una cavità toracica con una pinza. Afferra il tessuto polmonare e solleva delicatamente il cuore con le forbici curve.

Tagliate i grandi vasi dietro il cuore e continuate lentamente verso la testa del topo fino a quando il cuore non si è liberato. Arrestare immediatamente il cuore in un tampone KH ghiacciato. Mantieni gli organi sul ghiaccio e rimuovi rapidamente i polmoni.

Identifica i lobi del timo e sbucciali delicatamente per esporre l'aorta. Quindi rimuovere il timo. Infine, isolare l'aorta rimuovendo con cura il tessuto circostante.

Usando una pinza per micro sutura, generalmente tieni entrambe le pareti dell'aorta per esporre il lume. Quindi posizionare con cura l'aorta sulla cannula. Realizzato con tubi in polietilene con diametro esterno di 0,965 millimetri.

Tenere l'aorta in posizione con un morsetto per microvasi e legare rapidamente i punti di sutura attorno all'aorta. Una volta che i punti di sutura sono legati, rimuovere il morsetto. Usa la pinza per controllare attentamente che la cannula si trovi sopra la radice aortica.

Aggiungi eventuali lacci aggiuntivi necessari per tenere il cuore in posizione. Rimuovere il tessuto in eccesso utilizzando la pinza e le micro forbici. Quindi fai una piccola incisione nell'oracolo sinistro.

Tenere delicatamente il cuore e inserire con cura un tubo di polietilene da 0,61 millimetri di diametro esterno attraverso l'atrio sinistro, la cavità ventricolare sinistra e fuori attraverso l'apice. Tagliare il tubo in eccesso. Quindi, inserire un palloncino sgonfio riempito d'acqua attraverso l'atrio nel ventricolo sinistro.

Tieni il palloncino in posizione usando del nastro adesivo. Quindi aumentare gradualmente la velocità della pompa peristaltica per fornire un flusso sufficiente al cuore. Continuare a perfondere il cuore con il tampone KH utilizzando un flusso costante equivalente a circa due millilitri al minuto fino a quando il cuore non viene inserito nella sonda NMR.

Gonfiare il palloncino LV con un volume ridotto utilizzando una siringa micrometrica per verificare che il trasduttore di pressione LV funzioni per la spettroscopia NMR. Per prima cosa, inserisci con cura il cuore in un tubo NMR da 10 millimetri. Un ampio spinner di cinghiale è posizionato attorno al tubo NMR per aiutare a guidare il tubo nella posizione corretta.

All'interno della sonda, fissare saldamente l'intero apparecchio al cordone ombelicale con del nastro adesivo. Quindi, abbassare lentamente il cordone ombelicale nel foro superiore del magnete fino a quando il tubo NMR contenente il cuore si trova all'interno della bobina della sonda NMR da 10 millimetri. Una volta che il cuore si trova nella posizione corretta all'interno della sonda, regolare il flusso della pompa parassita in modo da raggiungere una pressione di perfusione di 80 millimetri di mercurio.

Mantenere la pressione di perfusione abilitando il meccanismo di mantenimento sul controller della pompa. Consentire un periodo di equilibrio da 15 a 20 minuti per il cuore. Durante il periodo di equilibrio, regolare il volume del palloncino LV per ottenere una pressione telediastolica compresa tra 8 e 10 millimetri di mercurio.

Quindi ottimizzare i parametri dello spettrometro per ottenere il miglior segnale di fosforo possibile. Sintonizzare lo strumento NMR impostando l'impulso radio, in modo che la frequenza alla quale risuoni il nucleo del fosforo. Quindi spessorare il campione per rendere omogeneo il campo magnetico dopo il periodo di equilibratura.

Iniziare l'acquisizione multipla di spettri NMR P 31. Il periodo di acquisizione per ogni spettro dipende dall'intensità di campo del magnete, dalle dimensioni del campione e dal rapporto segnale/rumore richiesto per un esperimento specifico. Qui gli spettri sono ottenuti utilizzando un magnete da 14 Tesla facendo la media del segnale ottenuto da 256 impulsi a radiofrequenza di 20 microsecondi con un angolo di inversione di 60 gradi e ritardi di 2,0 secondi.

Questo esperimento richiederà circa 10 minuti. Una misura tipica della funzione cardiaca, la pressione sviluppata dal ventricolo sinistro si ottiene sottraendo la pressione telediastolica o EDP dalla pressione sistolica. In un normale topo C 57 nero, la pressione cardiaca sviluppata dal ventricolo sinistro è tipicamente compresa tra 100 e 110 millimetri di mercurio a una pressione diastolica fissa di 8-10 millimetri di mercurio.

Le curve di stile rappresentative sono mostrate dai topi di controllo e dai topi a bande aortiche. La funzione sistolica è rappresentata dalla pressione sviluppata dal ventricolo sinistro rispetto all'aumento dei volumi del ventricolo sinistro, come determinato dal volume del palloncino ventricolare sinistro. La funzione diastolica è rappresentata dall'EDP rispetto all'aumento dei volumi del ventricolo sinistro.

Gli spettri NMR P 31 di un cuore di topo isolato perfuso forniscono segnali di FOSTROCREATINA o PCR, i tre fosfati di un TP e di fosfato inorganico o pi greco. Qui, il picco PI è relativamente piccolo. Questo è tipico di un cuore prodigato aerobicamente e fornito di piruvato o acidi grassi.

Oltre al glucosio durante i periodi di ischemia, questo picco aumenta mentre il picco della PCR diminuisce. Vi ho appena mostrato come preparare un cuore di topo per la perfusione in modo che sia la funzione cardiaca che l'energia possano essere misurate contemporaneamente durante l'esperimento. È importante assicurarsi che il cuore sia adeguatamente perfuso.

In caso contrario, i dati NMR non saranno affidabili. Quindi questo è tutto. Grazie e buona fortuna per i tuoi esperimenti.