Name: Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Impara a indurre infezioni del tratto urinario nei topi mediante inoculazione transuretrale di ceppi batterici e quantificazione delle colonie. Questo metodo fornisce risultati riproducibili per studiare la patogenesi delle ITU.

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Gli autori desiderano ringraziare Shelly Xie e Jennifer Payne per la loro assistenza tecnico esperto. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso sovvenzioni da parte della Società di Urologia Pediatrica e lo Stanford Research Pediatric Fondo.

I. Preparazione dei cateteri uretrali <ol><li> Per ogni vescica del mouse e reni da campionare, posto 5-6 grani in acciaio inox (vescica, 1.6 mm o dimensione 0,9-2,0 miscela mm) o perle di ossido di zirconio (rene, 0,5 mm di diametro) in una provetta provetta Microbank ™, rispettivamente. Autoclave il tallone contenenti tubi. </li><li> Dopo i tubi raffreddare a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di PBS sterile ad ogni acciaio inox tallone contenenti tubi e 400 microlitri di PBS sterile ad ogni ossido di zirconio contenenti perline tubo. </li><li> Prepariamo cateteri uretrali come descritto da Hung e Hultgren 13. Autoclave una coppia pulita di testa piatta pinze e forbici fine (iride o altri tipi) e lasciare gli strumenti per raffreddare a temperatura ambiente. Pulire le superfici di una cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo. Nel cofano, tagliare una (approssimativa) segmento 30 cm di tubo di polietilene. Asetticamente inserire un ago sterile da 30 gauge (1 / 2 pollice ago lungo) su una sterile siringa da 3 cc. Prendete una delle estremità del tubo in polietilene tagliato con le pinze in autoclave e far scorrere il tubo l'ago fino ad incontrare il mozzo. Tagliare il tubo in modo che circa 2 cm si estende oltre la punta dell'ago. Rimuovere il catetere dalla siringa e posto in una piastra di Petri sterile. </li><li> Per ridurre la probabilità di contaminazione incrociata, facciamo un catetere per ogni mouse. Dopo tutti i cateteri sono fatti, li sterilizzare in esposizione in un tegame scoperto petri ai raggi UV per almeno 30 minuti. Non guardare direttamente le lampade UV o esporre qualsiasi parte del corpo della cappa, mentre le lampade sono attivati. Dopo l'esposizione ai raggi UV, cateteri possono essere conservati a lungo termine nella capsula di Petri. Si consiglia di sigillare il piatto con Parafilm per aiutare a mantenere la sterilità. </li></ol> II. Inoculazione degli animali <ol><li> I topi dovrebbero arrivare almeno una settimana prima di manipolazione sperimentale al fine di evitare fattori di confondimento indotta da stress. Topi di sesso femminile sono utilizzati per l'uretra maschile del mouse è estremamente difficile da cateterizzare. CBA / J è un comunemente utilizzata, UTI sensibili ceppo di topi inbred. I topi devono essere utilizzati tra 8 e 12 settimane di età, poiché questa è la finestra di maturità immunologica prima della senescenza. Il primo giorno dell'esperimento, immergere la fine di un ciclo sterile inoculare in una fiala di batteri congelati magazzino. Raschiare un inoculo piccolo e fuori vena su una piastra di agar adeguato. In generale, uropatogeni E. coli (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivate pernottamento a Luria-Bertani (LB) agar a 37 ° C nell'aria ambiente. Ceppi UPEC crescere come solido, colonie traslucido bianco-giallastro su agar LB. Restituire immediatamente il brodo batterica al congelatore. Ceppi uropatogeni batterica può diventare meno virulento nel tempo con ripetute, le culture di serie. Quindi, si consiglia di striature un piatto fresco agar per ogni esperimento. </li><li> Il giorno 2 di questo esperimento, dopo aver confermato la morfologia propria colonia, raccogliere singole colonie sulle piastre di agar e il luogo in almeno 5 cc di brodo di cultura durante la notte. LB brodo può essere utilizzato per i ceppi batterici più uropatogeni (37 ° C, 200 giri in aria ambiente). Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l'aerazione. </li><li> Il giorno 3 di questo esperimento, prendere il 10% della cultura brodo di primo e cultura in brodo di nuovo durante la notte (di solito 37 ° C min e 200), per aumentare l'espressione di tipo I pili. Culture brodo seriale aiutare ad ottimizzare uropathogenicity batterica, dal momento che pili di tipo I hanno dimostrato di essere un fattore critico per la virulenza uropatogeni in vivo 1. Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l'aerazione. </li><li> Il giorno 4 dell'esperimento, misurare il diametro esterno 600 del brodo di cultura fin dal primo giorno 3. Se non è già noto per il ceppo batterico in fase di test, eseguire dieci volte placcatura seriale diluizione nel corso di almeno 7 log (diluizioni effettuate con PBS, le culture eseguita su agar LB, 37 ° C notte di incubazione) per determinare il rapporto tra diametro esterno 600 e cfu / ml. Come regola generale, un OD 600 del 0,4-0,5 corrisponde in genere a 1-2x10 7 cfu per 50 microlitri. Una volta che il rapporto tra diametro esterno 600 e ufc / ml è stata determinata, si può regolare il brodo di cultura per l'OD 600 cfu corrispondenti ai desiderata per il mouse in 50 microlitri di PBS. Alcuni lavori hanno suggerito che l'inoculazione di 10 microlitri, piuttosto che 50, porta a meno reflusso nel kidneys6. Tuttavia, la maggior parte delle pubblicazioni hanno segnalato l'uso di 50 microlitri per mouse. In generale, gli intervalli di cfu desiderata tra 10 6 e 108 ufc / mouse, ma ogni combinazione ceppo batterico / mouse deve essere empiricamente testato in vivo. </li><li> Per far sì che inoculi non siano annullate subito dopo l'instillazione, topi dovrebbero essere privati ​​di acqua per almeno 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia generale. Un'altra manovra chiave è quello di indurre la minzione prima dell'induzione dell'anestesia da scruffing topi e spingendo delicatamente la abdom inferioreit. Due al 2,5% isoflurano è una dose di induzione sicuro per 8-12 settimana di vita topi femmina CBA, seguita da mantenimento con anestesia 1,8-2% isoflurano. </li><li> Una volta che l'anestesia è raggiunto, i topi sono posti in posizione supina con la testa inserita in un collegato alla nosecone isoflurano contenenti ossigeno. Basso addome viene massaggiato per evacuare l'urina dalla vescica. Se la vescica è relativamente vuota, questa manovra non può produrre l'urina. Basso addome e perineo è imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Una sterile 1 siringa senza ago cc viene usato per redigere l'inoculo desiderato batterica. Poi, un catetere uretrale sterile è asettico posto sulla siringa. Il tubo in eccesso viene tagliato il catetere con un paio di forbici in modo che solo 1-2 millimetri di tubi rimangono distale rispetto alla punta dell'ago. Poi, la siringa è sfruttato e lo stantuffo depresso con la siringa in posizione verticale per rimuovere tutte le bolle. Un ciuffo di lubrificante batteriostatico gelatina è schizzato su una piastra di Petri sterile o l'interno della confezione di siringa sterile. La punta del catetere (con siringa allegato) è immerso nella gelatina. Se più ceppi batterici sono in fase di test nello stesso esperimento, fare attenzione a non utilizzare la stessa goccia di gelatina per lubrificare cateteri contenenti ceppi diversi. </li><li> Utilizzando un microscopio stereo (0,8 x per gamma di zoom 5x) per l'ingrandimento, il cappuccio del clitoride anestetizzato del mouse viene delicatamente colto nella mano non dominante con un paio di pinze a denti fini e cresciuto cranialmente esporre il profondo meato uretrale rosa ( Figura 1). La siringa (con catetere allegato) è colto nella mano dominante con una presa matita e la punta del catetere è impegnata nel meato uretrale con un angolo di 45 gradi. Il cappuccio del clitoride è allungato lungo l'asse della siringa, in modo efficace "carico" l'uretra sul catetere. Questa manovra è fondamentale perché l'uretra del mouse è ridondante. Il catetere deve scorrere facilmente in vescica (fino al mozzo, Figura 2), e può essere leggermente arricciati per navigare le pieghe ridondanti dell'uretra. Una volta che il catetere è hubbed, la siringa può essere abbassato fino a quando non è parallelo con l'asse longitudinale del mouse. La mano non dominante può scendere la pinza per contribuire a stabilizzare la posizione del catetere e la siringa come la mano dominante è usata per iniettare lentamente l'inoculo (almeno 5 secondi). Se il liquido è visto che scorre intorno al catetere durante l'iniezione, sia la vescica è piena o il catetere è nella vagina (appena caudalmente per l'uretra). Iniezione deve essere immediatamente interrotto e la posizione del catetere attentamente esaminato. Se il catetere è stato nell'uretra, il mouse dato non deve essere incluso nell'esperimento. D'altra parte, un catetere fuori luogo nella vagina può essere riposizionata e il tentativo di ri-iniezione. Dopo l'iniezione, il catetere e la siringa è lentamente ritirato dal mouse. </li><li> Per ridurre la probabilità del primo post-inoculazione minzione, che possono evacuare batteri somministrati, e quindi portare a livelli di infezione variabile, alcuni ricercatori mantenere topi sotto anestesia per 30 minuti dopo transuretrale inoculation10. Dopo l'intervento chirurgico, i topi dovrebbe recuperare su una coperta riscaldamento pulito, con osservazione continua a confermare ritorno della respirazione e attività normali. Una volta che gli animali hanno completamente recuperato la capacità di strisciare, possono essere restituiti a letto contenenti gabbie. </li></ol> III. CFU misura in tessuto infetto <ol><li> Varie pubblicazioni del mouse UTI hanno riferito sui risultati della cultura da 6 ore ad una settimana o più dopo l'inoculazione. I punti di tempo ottimali devono essere determinati empiricamente per ogni combinazione ceppo batterico / mouse. Urine emesse si ottiene per la cultura da scruffing del mouse su una piastra di Petri sterile. Urine raccolte devono essere tenuti in ghiaccio in ogni momento. Più tentativi di ottenere l'urina annullate molte ore può essere necessario, dato che lo svuotamento del mouse è frequente, a basso volume (30-100 microlitri per nulla), e lo stress-dipendente. </li><li> Dopo aver ottenuto i campioni di urina annullata, sacrifichiamo topo, utilizzando dislocazione isoflurano e cervicale. L'addome è aperto in modo asettico. Se un campione di urina non è stata annullata con successo ottenuto in precedenza, una piccola quantità di urina può spesso essere aspirato attraverso la parete della vescica con un ago da 30 gauge e siringa. </li><li> Uno o entrambi i reni sono stati rimossi, tritati in almeno 4 pezzi (ogni pezzo deve essere inferiore a 50 microgrammi) su una piastra di Petri sterile, e messo in zirconio tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. La vescica viene rimosso, tritati in almeno 4 pezzi, e messo in acciaio inox tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. Il tessuto / perla / PBS contenenti cryovials sono posti in un proiettile omogeneizzatore Blender e dei tessuti vengono omogeneizzati utilizzando l'impostazione "8" di velocità per un minuto. E 'comune per alcuni frammenti di tessuto a restarvi dopo omogeneizzazione. Finché 50-100 microlitri di omogenato liquido può essere pipettati, frammenti solidinon sono necessariamente un problema. Se il tempo di omogeneizzazione è aumentato per alcuni campioni, è importante farlo per tutti i tessuti al fine di mantenere la coerenza di omogeneizzazione. Utilizziamo un proiettile Blender omogeneizzatore perché evita la possibilità di contaminazione incrociata, è più rapida elaborazione singoli campioni uno dopo l'altro utilizzando un omogeneizzatore standard, e non in modo significativo il calore dei campioni viene omogeneizzato. </li><li> Almeno due o tre dieci volte diluizioni di urina raccolte e omogenati di tessuto deve essere fatta in una micropiastra. Per gli esperimenti preliminari può essere prudente fare almeno sette dieci volte diluizioni. Cultura fino a 100 microlitri di urina, vescica e / o omogenati di rene su agar appropriato. Dal momento che i campioni di urina possono essere volume limitato, può essere necessario per portare i loro volumi da 100 microlitri prima di eseguire dieci volte diluizioni. Se questo è richiesto, la diluizione iniziale (prima diluizione decimale) dovrà essere preso in considerazione in calcoli finali dei rendimenti batterica. Noi preferiamo UPEC colture sulla eosina-blu di metilene o agar MacConkey (notte di incubazione a 37 ° C), dal momento che questi media sono selettivi per i batteri Gram-negativi. Ceppi UPEC crescono su agar MacConkey come centrale ombelicate, colonie grazie alla loro capacità di fermentare il lattosio rosso-rosa. </li><li> Dopo la cultura durante la notte, contare le CFU per ogni piatto. Per i campioni diluiti serialmente, la diluizione piatto contenente 50-100 colonie è considerato il conteggio più accurato. "Indietro" calcolare ufc per tessuto, per ogni milligrammo di tessuto, o per ml. </li></ol> IV. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Meato uretrale (scuro tessuto rosa) esposti sollevando cappuccio del clitoride cefalica con una pinza (al di là in alto nella foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cateterizzati uretra. Il clitoride bifido può essere visto appena sopra il catetere. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Vescica cfu conta 2 giorni dopo l'infezione transuretrale di 8 settimane di età femminile CBA / J topi con uropatogeni E. coli. Vesciche sono stati omogeneizzati e ufc / ml determinato dalla placcatura di diluizione in serie su agar MacConkey. Diamanti indicare ufc / ml per i singoli topi, barra orizzontale indica la mediana ufc / ml.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Induzione di infezioni del tratto urinario del mouse tramite l&#39;inoculazione di batteri transuretrale è una procedura ormai consolidata, ma tecnicamente impegnativo 11. Hung e Hultgren recentemente pubblicato un eccellente rassegna di tecniche transuretrale di infezione del tratto urinario del mouse 13. In questo lavoro, cerchiamo di illustrare ulteriormente i punti più fini di questo approccio sperimentale. I novizi possono praticare la loro tecnica eseguendo una la...

<table><tbody><tr><td>Provette criogeniche, 2,0 ml in polipropilene (senza cappucci)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Cappucci per provette criogeniche, con anello &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Perle di ossido di zirconio (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Perle in acciaio inossidabile (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di perle in acciaio inossidabile (0,9-2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Topi CBA/J, femmine di 8-12 settimane</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3 mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4 mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brodo LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Loop per inoculazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di agar eosina-metilene blu (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di agar MacConkey</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di agar LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione in polietilene non radiopaca Intramedic, PE10 [diametro interno 0,28 mm (0,011 pollici); diametro esterno 0,61 mm (0,024 pollici)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 30 gauge, 1/2 pollice</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Siringa tubercolina da 1 ml con attacco Slip-Tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml con attacco Luer-Lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropatogeni ceppi batterici di interesse vengono coltivate su agar. In generale, uropatogeni<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivate pernottamento a Luria-Bertani (LB) agar a 37 ° C nell&#39;aria ambiente. Ceppi UPEC crescere come colonie traslucido bianco-giallastro su agar LB. In seguito alla conferma della morfologia delle colonie del caso, singole colonie vengono poi raccolte per essere coltivate in brodo. LB brodo può essere utilizzato per i ceppi batterici più uropatogeni. Due porte seriali, pernottamento culture brodo LB può essere impiegato per migliorare l&#39;espressione di tipo I pili, un ben definito fattore di virulenza dei batteri uropatogeni. Culture brodo sono diluiti alla concentrazione desiderata in tampone fosfato (PBS). Da otto a 12 settimane i topi vecchi femminile sono posti sotto anestesia isoflurano e transurethrally inoculato con batteri utilizzando tubi di polietilene coperto di siringhe 30 gauge. Inoculi tipico, che deve essere empiricamente determinato per ogni combinazione ceppo batterico / mouse, sono 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; Ufc per mouse in 10-50 microlitri di PBS. Dopo il periodo di infezione desiderato (un giorno a diverse settimane), i campioni di urina e la vescica ed entrambi i reni vengono raccolte. Ogni organo è tritato, posto in PBS, e omogeneizzato in un omogeneizzatore proiettile blu. Omogenati di urina e di tessuto sono serialmente diluiti in PBS e coltivate su agar appropriato. Il giorno successivo, unità formanti colonie sono contate.

Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l&#39;entità delle infezioni che ne derivano.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

I ceppi batterici uropatogeni di interesse vengono coltivati su agar. Generalmente, l'E. coli uropatogeno (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivati overnight su...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un'infezione del tratto urinario nei topi mediante inoculazione transuretrale. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando i ceppi batterici di interesse e diluendo le colture alla concentrazione desiderata. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'inoculare transuretralmente la vescica del topo con i ceppi batterici di interesse.Il terzo passaggio della procedura consiste nel raccogliere campioni di urina e nel prelevare reni e vesciche. L'ultimo passaggio della procedura è l'inoculazione di piastre ad auger con campioni di urina e di reni e vesciche omogeneizzati. Alla fine, è possibile ottenere risultati che dimostrano un'infezione riuscita del tratto urinario sulla base della presenza di colonie batteriche nei campioni piastrati.Ciao, sono Michael Shea e benvenuti nel mio laboratorio del Dipartimento di Urologia della Stanford University School of Medicine. Sono Annu ti, anch'io del laboratorio Shea. Oggi vi mostreremo una procedura di cateterizzazione transuretrale nel topo.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'induzione di infezioni del tratto urinario nei topi. Cominciamo. In una cappa a flusso laminare, tagliare un pezzo di tubo in polietilene lungo 30 centimetri e fissare un ago da 30 gauge su una siringa sterile da tre centimetri cubi.Utilizzare pinze sterili per prendere un'estremità del tubo tagliato e farlo scivolare sull'ago fino a raggiungere il raccordo. Tagliare il tubo in modo che circa due centimetri sporgano oltre la punta dell'ago. Questo aiuta a prevenire lesioni nei topi durante la cateterizzazione.Rimuovere il catetere dalla siringa e posizionarlo in una piastra di Petri sterile. Preparare un catetere per ogni topo da infettare. Sterilizzare i cateteri mediante irradiazione ultravioletta per almeno 30 minuti.Sigillare una piastra con del profilato per mantenere il catetere sterile durante la conservazione a lungo termine. Seminare in striscia una piastra di agar appropriata con un'inoculo di ceppo batterico congelato di interesse. Qui, un'inoculo di *Escherichia coli* patogenica urinaria o UPEC viene seminato in striscia per una crescita notturna a 37 gradi Celsius.Selezionare singole colonie con la morfologia appropriata, che nel caso di UPEC sono colonie solide di colore giallastro e traslucide su agar LB, e collocarle in almeno cinque millilitri di brodo liquido per una coltura notturna a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto. Aggiungere il 10% della prima coltura di brodo a un mezzo fresco e far crescere nuovamente per tutta la notte. Ancora una volta, al fine di potenziare l'espressione delle fimbrie di tipo 1, associata alla patogenesi in vivo di UPEC, misurare l'OD 600 della coltura per determinare il numero di unità formanti colonie.CFU abbreviato per millilitro di coltura. Diluire la coltura con PBS sterile in modo che la concentrazione finale sia compresa tra 10 alla sesta e 10 alla ottava CFU in 10-50 microlitri, per garantire che gli inocoli non vengano espulsi immediatamente. Dopo l'installazione, privare i topi dell'acqua per 30 minuti prima dell'anestesia, afferrare il topo per la nuca e premere delicatamente sull'addome inferiore per favorire la minzione.Posizionare il topo anestetizzato supino, con la testa inserita in un cono nasale collegato all'isoflurano contenente ossigeno. Massaggiare l'addome per svuotare l'eventuale urina residua dalla vescica. Utilizzare un flacone spray per inumidire l'addome inferiore e il perineo con etanolo al 70%.Successivamente, utilizzare una siringa sterile da un millilitro per aspirare l'inoculo batterico. Fissare un catetere sterile preparato sulla siringa. Utilizzare delle forbici per tagliare il tubo in modo che sporga soltanto da uno a due millimetri oltre la punta dell'ago.Questo aiuta a prevenire lesioni nei topi durante la cateterizzazione; battere leggermente sulla siringa e premere lo stantuffo. Per rimuovere le bolle d'aria, lubrificare il catetere immergendolo in una piccola quantità di gel lubrificante batteriostatico. Assicurarsi di utilizzare una quantità distinta di gel per ciascun ceppo batterico che verrà testato al microscopio stereoscopico da dissezione.Utilizzare pinzette fini con la mano non dominante per afferrare delicatamente il prepuzio clitorideo e sollevarlo per esporre l'ATU uretrale di colore rosa intenso nella mano dominante. Afferrare la siringa con il catetere applicato. Con una presa a matita, inserire la punta del catetere nell'ATU uretrale formando un angolo di 45 gradi rispetto all'addome del topo.Nel piano sagittale mediano. Allungare il cappuccio clitorideo lungo l'asse longitudinale della siringa. Caricare efficacemente l'uretra sul catetere.Il catetere dovrebbe scivolare agevolmente nella vescica, se necessario. Ruotare delicatamente il catetere per aiutare a superare le pieghe sovrabbondanti dell'uretra. Quando il catetere è inserito fino al connettore, abbassare la siringa in posizione parallela all'addome del topo.Lasciare cadere la pinzetta e utilizzare la mano non dominante per stabilizzare il catetere e la siringa. Iniettare lentamente l'inoculo per almeno cinque secondi. Se durante l'iniezione si osserva del liquido che scorre attorno al catetere, la vescica è piena o il catetere si trova nella vagina.Interrompere l'iniezione ed esaminare la posizione del catetere. Riposizionare il catetere nell'uretra se necessario. Dopo l'iniezione, ritirare lentamente il catetere.Mantenere il topo sotto anestesia per mezz'ora dopo l'inoculazione. Per ridurre il rischio di minzione dopo l'intervento chirurgico, permettere al topo di riprendersi su una coperta riscaldata pulita con osservazione continua per confermare il ritorno di schemi respiratori normali e di attività. Una volta completamente ripresosi, quando ha riacquistato la capacità di strisciare, restituire il topo a una gabbia contenente lettiera.A seconda della combinazione di ceppi batterici e di topo, può essere necessario un periodo compreso tra sei ore e una settimana per un'infezione completa. Per procedere, posizionare una piastra di Petri sterile su ghiaccio per ogni topo infetto nell'arco di diverse ore. Afferrare il topo per la nuca sopra la piastra per raccogliere l'urina da coltivare.50 microlitri di urina dovrebbero essere sufficienti. Pipettare l'urina in una provetta da microcentrifuga, chiuderla con il cappuccio e mantenere l'urina sul ghiaccio. Sotto la lente stereoscopica, posizionare un topo eutanasizzato supino su un vassoio da dissezione.Spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Utilizzare forbici per praticare un'incisione di tre-quattro centimetri nella cute e nella parete addominale sottostante. Se necessario, utilizzare perni per retrarre la parete addominale dai contenuti addominali.Se tentativi precedenti di raccolta dell'urina non sono andati a buon fine, utilizzare un ago da 30 gauge e una siringa per aspirare direttamente l'urina attraverso la parete della vescica. Utilizzare pinze e forbici per rimuovere i reni. Trasferirli in una piastra di Petri sterile e tritarne ciascuno in almeno quattro pezzi, ciascuno di dimensioni comprese tra due e tre millimetri.Trasferire ogni frammento renale in una provetta criogenica contenente da cinque a sei sfere sterili di ossido di zirconio da 0,5 millimetri e 400 microlitri di PBS sterile. Mantenere i campioni di rene sul ghiaccio. Utilizzare pinze e forbici per rimuovere la vescica.Trinciare la vescica utilizzando lo stesso metodo impiegato per i reni. Trasferire ogni frammento di vescica in una provetta criogenica contenente sfere di acciaio inossidabile da 1,6 millimetri e 200 microlitri di PBS sterile, mantenendo le provette sul ghiaccio. Posizionare le provette nel bullet blender omogeneizzatore e omogeneizzare il tessuto alla velocità otto per almeno un minuto.È comune che alcuni frammenti di tessuto rimangano dopo l'omogeneizzazione. Tutti i campioni devono essere omogeneizzati per lo stesso periodo di tempo in una piastra micrometrica. Eseguire diluizioni seriali di ordine dieci del campione di urina raccolto e dell'omogeneato tissutale con ghiaccio.PBS freddo distribuito. Diluizione terminata. Piastrare con la quantità appropriata e far crescere durante la notte a 37 gradi Celsius.Le UFC per organo o per milligrammo di tessuto o per millilitro di urina possono essere calcolate a ritroso a partire dal numero di colonie su ciascuna piastra. Stiamo utilizzando queste tecniche per studiare come le mutazioni nelle risposte allo stress batterico influenzino la capacità dell'UPEC di causare infezioni del tratto urinario in vivo, nonché la resistenza agli antibiotici somministrati ai topi infetti. Questa tabella mostra la capacità dell'UPEC di tipo selvaggio di infettare la vescica del topo dopo inoculazione transuretrale.Abbiamo appena mostrato come indurre in modo trasversale infezioni del tratto urinario nei topi. Durante questa procedura, è importante cateterizzare i topi con delicatezza. Una tecnica corretta consente una cateterizzazione agevole, ma potrebbe richiedere pratica.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Generazione di un modello di infezione del tratto urinario: una tecnica per somministrare batteri uropatogeni nel topo per sviluppare un modello di infezione del tratto urinario

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Instillazione transuretrale è una procedura difficile e non è stato ben descritto nella letteratura. Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere una tecnica per transuretrale inserzione di un catetere per consegna intravescicale di liquidi con sostanze attive nella vescica urinaria e/o della prostata nei topi del maschio adulto.

Procedura transuretrale instillazione in di topo maschio adulto

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Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Impara a indurre infezioni del tratto urinario nei topi mediante inoculazione transuretrale di ceppi batterici e quantificazione delle colonie. Questo metodo fornisce risultati riproducibili per studiare la patogenesi delle ITU.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

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