Targeting di strutture cerebrali profonde con microiniezioni di consegna dei farmaci, vettori virali, o trapianti di cellule
1 dicembre 2010
In questo articolo, mostriamo un metodo per fare gli aghi capillare di vetro con un 50-micron lumen. Questa tecnica riduce in modo significativo il danno al cervello, riduce al minimo la diffusione passiva di farmaci e permette una mira precisa nel cervello dei roditori.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire microiniezioni altamente precise in strutture cerebrali profonde per la somministrazione di farmaci, vettori virali o trapianti cellulari. Questo risultato si ottiene innanzitutto producendo aghi capillari di vetro con un lume di 50 micrometri. Il secondo passaggio della procedura consiste nel riempire per il 50% l'ago con olio minerale per capillarità e inserire lo stantuffo dall'estremità più larga del tubo.
Il terzo passaggio della procedura consiste nel caricare l'ago con la sostanza o la sospensione cellulare che si desidera iniettare. L'ultimo passaggio della procedura è introdurre la punta dell'ago e iniettare la sostanza a un flusso molto basso in una struttura cerebrale profonda. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un indirizzamento molto preciso di sostanze nel cervello mediante microiniezioni con un capillare di vetro.
Ciao, sono Oscar Gonzalez del Laboratorio di Neuroscienze della Scuola di Psicologia dell'Università di Colima, Messico. Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire microiniezioni mediante un capillare di vetro al fine di somministrare farmaci nel cervello del topo. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le cellule staminali neurali adulte.
Iniziamo. L'uso di aghi capillari in vetro con un lume di 50 micrometri per microiniezioni nel cervello riduce significativamente i danni cerebrali, minimizza la diffusione passiva dei farmaci e consente un indirizzamento preciso nel cervello del roditore. Prima di poter effettuare le microiniezioni, è necessario costruire gli aghi in vetro.
Iniziare posizionando il tubo capillare in vetro all'interno di un elettrodo ad alta resistenza di un estrattore di micropipette. Successivamente accendere l'elettrodo dell'estrattore di micropipette. Per riscaldare la parte centrale del tubo di vetro e ammorbidirlo localmente, allungare il tubo di vetro lungo il suo asse longitudinale di una distanza iniziale compresa tra tre e cinque millimetri, sufficiente a provocare una riduzione del diametro del tubo di vetro nell'area localizzata.
Continuare a tirare il tubo di vetro fino a quando non si spezza. Ripetere questi passaggi per creare due aghi identici a singolo becco. Posizionare ora gli aghi di vetro in un microfornello.
Un angolo di 30 gradi è sufficiente per smussare la punta. Infine, posizionare gli aghi sotto il microscopio e verificare che entrambi abbiano il diametro interno corretto. Per la maggior parte dei farmaci idrofili, un diametro interno compreso tra 30 e 50 micrometri è ideale con gli aghi costruiti.
Vediamo come utilizzarli per microiniezioni. Per iniziare, riempire l'ago costruito con olio minerale dall'estremità più larga. Lasciare che l'olio minerale entri per capillarità fino a raggiungere circa il 50% della lunghezza del tubo capillare.
Mettere del grasso da vuoto ad alto vuoto intorno all'estremità più larga dell'ago e inserire lo stantuffo attraverso di essa. Spingere delicatamente l'olio minerale finché una piccola goccia fuoriesce dalla punta dell'ago di vetro. A questo punto fissare l'ago nel supporto del microiniettore e iniziare a preparare l'animale per l'iniezione.
Prima di tutto, posizionare un tappetino riscaldante sul supporto stereotassico per animali per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius. Rasare la testa del topo anestetizzato, quindi posizionarlo e fissarlo al dispositivo stereotassico. Utilizzando i supporti per le orecchie e un sostegno per i denti, praticare un'incisione cutanea dalla linea delle orecchie fino alla linea del Lambda del cranio con una lama chirurgica.
Lucidare il cranio con un bastoncino di cotone per asciugarlo ed estrarre la pelle dal campo chirurgico. Successivamente, utilizzare la punta dell'ago di vetro per individuare il vertice della sutura bgma e impostare in quel punto la posizione iniziale dell'iniezione. Ora impostare il punto sul cranio da trapanare spostando gli assi X e Y del dispositivo stereotassico sopra il cranio.
Utilizzando un microtrapano da ricerca, praticare con attenzione dei fori alle coordinate selezionate con pinzette fini. Rimuovere con cura lo strato più profondo dell'osso e rompere la membrana dura madre. Si osserverà fuoriuscire del liquido cerebrospinale.
Per verificare che l'ago possa passare attraverso i fori praticati, abbassare lentamente l'ago di vetro utilizzando l'asse Z del dispositivo stereotassico. Prelevare ora un microlitro del farmaco da iniettare e depositarlo su un piccolo pezzo di parafilm. Posizionare il parafilm sul cranio.
Aspirare il farmaco ruotando la rotella del microiniettore, controllando al microscopio che il liquido salga all'interno dell'ago di vetro. Rimuovere la pellicola di parafilm e reimpostare la coordinata zero. Spostare ora l'ago alle coordinate selezionate e abbassare il supporto finché la punta dell'ago di vetro tocca delicatamente la superficie del cervello, quindi impostare la coordinata Z a zero.
Introdurre l'ago di vetro nel parenchima cerebrale alla profondità desiderata. Iniettare il farmaco lentamente a una velocità di circa un nanolitro al secondo. Una volta iniettato il volume desiderato, lasciare diffondere il farmaco nel parenchima per due minuti, quindi procedere a rimuovere l'ago in modo regolare e lento.
Infine incollare la ferita chirurgica e rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico. Posizionare l'animale in una gabbia preriscaldata per il recupero dall'anestesia. Ora mostreremo alcuni risultati della microiniezione.
La lisofosfatidilcolina o lyin è stata iniettata nel corpo calloso, inducendo una demielinizzazione dei tratti della sostanza bianca, al fine di ridurre al minimo il danno cerebrale provocato dall'ago di vetro. È stata iniettata soltanto una quantità di 20 µL di lyin. La demielinizzazione è indicata dall'assenza dell'espressione della proteina basica della mielina nei tratti della sostanza bianca; si ottiene così una iniezione molto precisa e un tratto d'ago estremamente ristretto, che minimizza il danno cerebrale.
Abbiamo appena mostrato come costruire aghi di vetro per eseguire microiniezioni in strutture cerebrali profonde. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di avere tutti gli strumenti e i materiali pronti per l'uso in sala operatoria. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la creazione di aghi in capillare di vetro con un lume di 50-μm, che consente microiniezioni precise in strutture cerebrali profonde. Questa tecnica minimizza i danni cerebrali e riduce la diffusione passiva dei farmaci, permettendo un rilascio mirato nei modelli di roditore.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di microiniezione
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
Sfondo
- Le microiniezioni sono essenziali per somministrare sostanze direttamente nel cervello.
- I metodi tradizionali possono causare danni cerebrali significativi e una somministrazione inefficace dei farmaci.
- Gli aghi in capillare di vetro offrono una soluzione per un indirizzamento preciso.
- Questo studio si concentra sul miglioramento del processo di microiniezione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la creazione di aghi in capillare di vetro con un lume di 50-μm.
- Migliorare la precisione della somministrazione del farmaco in strutture cerebrali profonde.
- Minimizzare i danni cerebrali durante il processo di iniezione.
Metodi Utilizzati
- Produzione di aghi in capillare di vetro con un lume di 50 μm.
- Riempimento dell'ago con olio minerale per facilitare l'iniezione.
- Caricamento dell'ago con la sostanza desiderata o con sospensione cellulare.
- Iniezione della sostanza a bassa velocità di flusso in aree cerebrali mirate.
Risultati principali
- Il metodo consente un indirizzamento preciso di sostanze nel cervello.
- Riduzione significativa dei danni cerebrali rispetto ai metodi tradizionali.
- Consegna efficiente di farmaci, vettori virali o trapianti cellulari.
- Efficacia dimostrata in modelli rodentici.
Conclusioni
- La tecnica sviluppata migliora la precisione delle microiniezioni.
- Fornisce un metodo affidabile per la somministrazione di farmaci nella ricerca neuroscientifica.
- Questo approccio può essere applicato a diverse sostanze, migliorando i risultati sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'erogazione precisa di agenti terapeutici a strutture cerebrali profonde rimane una sfida fondamentale nello sviluppo farmacologico in neuroscienze, in particolare nei modelli animali di piccola taglia in cui il trauma procedurale può alterare i risultati. Questo metodo di microiniezione migliora la fedeltà dell'interazione con la regione bersaglio riducendo i danni tissutali indotti dall'iniezione e la diffusione passiva, aumentando così l'affidabilità degli studi di intervento farmacologico e genetico. L'approccio consente una riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta, permettendo un'erogazione riproducibile e a basso volume di farmaci, vettori virali o trapianti cellulari con una minore variabilità biologica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette un'analisi accurata delle ipotesi terapeutiche nei nuclei cerebrali profondi riducendo gli effetti fuori bersaglio causati dal trauma da iniezione.
- Valore operativo: Consente una somministrazione costante di composti o strumenti genetici tra diversi studi, migliorando la riproducibilità nei protocolli di validazione del bersaglio.
- Conferma predittiva: Riduce al minimo la variabilità procedurale che potrebbe oscurare le vere risposte farmacologiche o biologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati con carico lesionale minimo per lo screening di composti successivi in vie del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Permette iniezioni standardizzate e a basso volume (20–100 nl), adatte a formati saggio ad alta precisione che richiedono un rigoroso controllo farmacocinetico.
- Riutilizzo della piattaforma: Adattabile a diverse sostanze (farmaci, vettori virali, cellule) modificando la dimensione del lume dell'ago, supportando campagne di screening multimodali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Migliora la fedeltà del modello di malattia riducendo le lesioni confondenti causate dalle procedure di iniezione, aumentando la rilevanza traslazionale.
- Valore operativo: Consente interventi ripetibili in studi longitudinali, supportando regimi di somministrazione cronica o di trapianto cellulare.
- Progresso basato sulla valutazione del rischio: Aumenta la fiducia nei dati sull'interazione con il bersaglio, facilitando decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del target all'ottimizzazione del composto attivo, in cui una somministrazione precisa al sistema nervoso centrale è essenziale per valutare la modulazione del target e l'attivazione del percorso.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi nelle strutture cerebrali profonde consentendo un’erogazione precisa di sonde farmacologiche o genetiche.
- Screening: Permette dosaggi quantitativi e riproducibili per la valutazione di composti in vivo, fondamentali per studi di relazione dose-risposta e di occupazione del bersaglio.
- Analisi: Genera letture chiare riducendo al minimo il rumore indotto dalla procedura, migliorando il rilevamento del segnale nelle misurazioni di biomarcatori o di efficacia.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta a quella preclinica assicurando un’erogazione costante e a basso trauma in tutte le fasi dello studio.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità standardizzata e adattabile per l’erogazione al sistema nervoso centrale, applicabile a più progetti e modalità.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica derivante da artefatti di iniezione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori e studi attraverso parametri definiti di preparazione dell'ago e di iniezione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo studi falliti a causa di variabilità procedurali o effetti fuori bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione più affidabile di bersagli del sistema nervoso centrale sulla base di dati farmacologici e genetici più puliti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, coordinamento stereotassico e fabbricazione di aghi mediante un estrattore per pipette e un microforgiatore.
- Presuppone l'accesso a strumentazione specializzata, inclusi un telaio stereotassico, un microiniettore e un microscopio per la visualizzazione dell'ago.
- Necessita della standardizzazione della dimensione del lume dell'ago (50 µm) e del protocollo di riempimento (olio minerale al 50%) per garantire prestazioni costanti tra diversi utilizzatori.
- L'adattamento a diversi sistemi modello potrebbe richiedere l'aggiustamento delle coordinate e la validazione della profondità di penetrazione dell'ago.
- I limiti pratici includono l'abilità tecnica richiesta per l'estrazione e la smussatura degli aghi, nonché la bassa produttività intrinseca della microiniezione manuale.
