Targeting di strutture cerebrali profonde con microiniezioni di consegna dei farmaci, vettori virali, o trapianti di cellule
December 1st, 2010
In questo articolo, mostriamo un metodo per fare gli aghi capillare di vetro con un 50-micron lumen. Questa tecnica riduce in modo significativo il danno al cervello, riduce al minimo la diffusione passiva di farmaci e permette una mira precisa nel cervello dei roditori.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire microiniezioni altamente precise in strutture cerebrali profonde per la somministrazione di farmaci, vettori virali o trapianti di cellule. Ciò si ottiene producendo prima aghi capillari in vetro con un lume di 50 micrometri. Il secondo passo della procedura consiste nel riempire il 50% dell'ago con olio minerale per capillare e inserire lo stantuffo dall'estremità più larga del tubo.
Il terzo passo della procedura consiste nel caricare l'ago con la sostanza o la sospensione cellulare che si desidera iniettare. La fase finale della procedura consiste nell'introdurre la punta dell'ago e iniettare la sostanza a una velocità molto bassa in una struttura cerebrale profonda. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un targeting molto preciso delle sostanze nel cervello attraverso micro iniezioni con un tubo capillare di vetro.
Ciao, sono Oscar Gonzalez del Laboratorio di Neuroscienze della Scuola di Psicologia dell'Università di Colima, in Messico. Oggi vi mostreremo una procedura per eseguire la microiniezione con un tubo capillare di vetro per somministrare farmaci nel cervello del topo. Usiamo questa procedura in un laboratorio sufficiente per studiare le cellule staminali neurali adulte.
Quindi iniziamo. L'uso di aghi capillari in vetro con un lume di 50 micrometri per microiniezioni nel cervello riduce significativamente il danno cerebrale, minimizza la diffusione passiva dei farmaci e consente un targeting preciso nel cervello dei roditori. Prima di poter eseguire le microiniezioni, gli aghi di vetro devono essere costruiti.
Iniziare posizionando il tubo di vetro capillare in un elettrodo ad alta resistenza di trazione di un estrattore per micropipette. Quindi accendere l'elettrodo del micro estrattore per pipette. Per riscaldare la parte centrale del tubo di vetro per ammorbidire localmente il tubo di vetro, allungare il tubo di vetro lungo il suo asse longitudinale di una distanza iniziale da tre a cinque millimetri, sufficiente a causare una riduzione del diametro del tubo di vetro nell'area localizzata.
Continuare ad allungare il tubo di vetro fino a quando non si rompe. Ripeti questi passaggi per creare due aghi a canna singola identici. Ora posiziona gli aghi di vetro in una micro fucina.
Un angolo di 30 gradi è sufficiente per smussare la punta. Infine, posiziona gli aghi sotto il microscopio e controlla che entrambi abbiano il diametro interno corretto. Per la maggior parte dei farmaci idrofili, un diametro interno da 30 a 50 micrometri è l'ideale con gli aghi costruiti.
Vediamo come utilizzarli per le micro iniezioni. Per iniziare, riempire l'ago costruito con olio minerale dall'estremità più larga. Lasciare entrare l'olio minerale per capillare fino a raggiungere circa il 50% della lunghezza del tubo capillare.
Mettere il grasso ad alto vuoto attorno all'estremità più larga dell'ago e inserire lo stantuffo attraverso di esso. Spingere delicatamente l'olio minerale fino a quando una piccola goccia di scena esce dalla punta dell'ago di vetro. Ora fissa l'ago nel supporto del micro iniettore e inizia a preparare l'animale per l'iniezione.
Per prima cosa, metti un termoforo sul supporto stereotassico dell'animale per mantenere la temperatura corporea dell'animale. A 37 gradi Celsius, radere la testa del topo anestetizzato, quindi posizionarla e fissarla nel dispositivo stereotassico. Utilizzando le barre auricolari e un supporto per i denti, utilizzare una lama chirurgica per incidere la pelle dalle orecchie alla Lambda skull Line.
Lucidare il cranio con un batuffolo di cotone per asciugarlo ed estrarre la pelle dal campo chirurgico. Quindi, utilizzare la punta dell'ago di vetro per puntare il vertice della sutura bgma e impostare lì la posizione iniziale dell'iniezione. Ora imposta il punto sul cranio che deve essere perforato spostando gli assi x e Y del dispositivo stereotassico sul cranio.
Utilizzando un microtrapano da ricerca, praticare con cura i fori alle coordinate selezionate con una pinza fine. Rimuovere con cura lo strato più profondo dell'osso e rompere la membrana della dura dura. Vedrai fuoriuscire del liquido cerebrospinale che fuoriesce.
Per confermare che l'ago possa passare attraverso i fori praticati, abbassare lentamente l'ago di vetro utilizzando l'asse Z del dispositivo stereotassico. Ora pipetta un microlitro del farmaco da iniettare e posizionalo su un pezzetto di profumo. Posiziona il profumo sul teschio.
Aspirare il farmaco facendo girare la ruota del micro iniettore mentre si controlla attraverso il microscopio che il fluido stia salendo nell'ago di vetro. Rimuovere la pellicola para e reimpostare la coordinata zero. Ora sposta l'ago sulle coordinate selezionate e abbassa il supporto fino a quando la punta dell'ago di vetro tocca delicatamente la superficie del cervello e imposta la coordinata Z a zero.
Introdurre l'ago di vetro nel parenchima cerebrale alla profondità desiderata. Iniettare il farmaco lentamente a una velocità di circa un nanolitro al secondo. Quando viene iniettato il volume desiderato, lasciare che il farmaco si diffonda nel parenchima per due minuti, quindi procedere alla rimozione dell'ago senza intoppi e lentamente.
Infine incollare la ferita chirurgica e rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico. Metti l'animale in una gabbia prebellica per il recupero dall'anestesia. Ora mostreremo alcuni risultati della microiniezione.
La lisofosfatidilcolina o liina è stata iniettata nel corpo cossum che produce demielinizzazione dei tratti della sostanza bianca per ridurre al minimo la lesione cerebrale prodotta dall'ago di vetro. Sono stati iniettati solo 20 litri di liina. La demielinizzazione è rappresentata dall'assenza di espressione della proteina basica della mielina nei tratti della sostanza bianca, si ottiene un'iniezione molto precisa e un tratto dell'ago molto stretto riduce al minimo la lesione cerebrale.
Ti abbiamo appena mostrato come costruire aghi di vetro per eseguire micro iniezioni nelle strutture cerebrali profonde. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di avere tutte le attrezzature e i materiali pronti per essere utilizzati in sala operatoria. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per creare aghi capillari di vetro con un lume di 50-µm, consentendo micro iniezioni precise in strutture cerebrali profonde. Questa tecnica minimizza il danno cerebrale e riduce la diffusione passiva dei farmaci, permettendo una somministrazione mirata nei modelli di roditori.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di microiniezione
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
Sfondo
- Le micro iniezioni sono essenziali per somministrare sostanze direttamente nel cervello.
- I metodi tradizionali possono causare danni cerebrali significativi e un'inefficienza nella somministrazione dei farmaci.
- Gli aghi capillari di vetro offrono una soluzione per un targeting preciso.
- Questo studio si concentra sul miglioramento del processo di microiniezione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per creare aghi capillari di vetro con un lume di 50-µm.
- Migliorare la precisione della somministrazione dei farmaci nelle strutture cerebrali profonde.
- Minimizzare il danno cerebrale durante il processo di iniezione.
Metodi utilizzati
- Produzione di aghi capillari di vetro con un lume di 50 µm.
- Riempimento dell'ago con olio minerale per facilitare l'iniezione.
- Caricamento dell'ago con la sostanza desiderata o sospensione cellulare.
- Iniezione della sostanza a bassa velocità di flusso nelle aree cerebrali target.
Risultati principali
- Il metodo permette un targeting preciso di sostanze nel cervello.
- Riduzione significativa del danno cerebrale rispetto ai metodi tradizionali.
- Somministrazione efficiente di farmaci, vettori virali o trapianti cellulari.
- Efficacia dimostrata nei modelli di roditori.
Conclusioni
- La tecnica sviluppata migliora la precisione delle micro iniezioni.
- Fornisce un metodo affidabile per la somministrazione dei farmaci nella ricerca neuroscientifica.
- Questo approccio può essere applicato a varie sostanze, migliorando i risultati sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Precise delivery of therapeutic agents to deep brain structures remains a critical challenge in neuroscience drug development, particularly in small animal models where procedural trauma can confound results. This microinjection method enhances target engagement fidelity by minimizing injection-induced tissue damage and passive diffusion, thereby improving the reliability of pharmacological and genetic intervention studies. The approach supports mechanistic de-risking in early discovery by enabling reproducible, low-volume delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants with reduced biological variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables accurate interrogation of therapeutic hypotheses in deep brain nuclei by reducing off-target effects from injection trauma.
- Operational Value: Supports consistent delivery of compounds or genetic tools across studies, improving reproducibility in target validation workflows.
- Predictive Confidence: Minimizes procedural variability that could obscure true pharmacological or biological responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with minimal lesion burden for downstream compound screening in CNS pathways.
- Operational Value: Enables standardized, low-volume (20–100 nl) injections suitable for high-precision assay formats requiring tight pharmacokinetic control.
- Platform Reuse: Adaptable to various substances (drugs, viral vectors, cells) by adjusting needle lumen size, supporting multi-modal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease model fidelity by reducing confounding injury from injection procedures, improving translational relevance.
- Operational Value: Facilitates repeatable interventions in longitudinal studies, supporting chronic dosing or cell transplant regimens.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves confidence in target engagement data, aiding go/no-go decisions in preclinical programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where precise CNS delivery is essential for assessing target modulation and pathway engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in deep brain structures by enabling accurate delivery of pharmacological or genetic probes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible dosing for compound evaluation in vivo, critical for dose-response and target occupancy studies.
- Analytics: Generates clean readouts by minimizing procedure-induced noise, improving signal detection in biomarker or efficacy measurements.
- Translational Research: Promotes continuity from discovery to preclinical by ensuring consistent, low-trauma delivery across study phases.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable capability for CNS delivery applicable across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from injection artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and studies through defined needle preparation and injection parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed studies due to procedural variability or off-target effects.
- Portfolio Impact: Enables more reliable prioritization of CNS targets based on cleaner pharmacological and genetic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, stereotactic coordination, and needle fabrication using a pipette puller and micro forge.
- Depends on access to specialized instrumentation including a stereotactic frame, microinjector, and microscope for needle visualization.
- Necessitates standardization of needle lumen size (50 µm) and filling protocol (50% mineral oil) for consistent performance across users.
- Adaptation to different model systems may require coordinate adjustment and validation of needle penetration depth.
- Practical limitations include the technical skill needed for needle pulling and beveling, and the low throughput inherent to manual microinjection.
