Name: RhoC GTPasi attivazione di analisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Impara a quantificare i livelli di RhoC GTPasi attiva nelle cellule utilizzando il pull down assay. Questo metodo fornisce dati quantitativi affidabili per studiare la funzione di RhoC nella biologia cellulare.

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Dipartimento della Difesa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 e W81XWH-08-1-0356

1. Preparare GST-fusione delle proteine <ol><li> Le scorte di glicerolo di batteri competenti JM109 contenenti il ​​primo N-terminale di 90 amminoacidi di Rho rhotekin dominio di legame (RBD) subcloned nel pGEX3x BamH1/EcoR1 vettore sono fatti. Al fine di garantire alta efficienza Le seguenti operazioni devono essere eseguite per ogni esperimento. Nella nostra esperienza, preparati al momento GST-RBD è la chiave per un test GTPasi robusto e preciso di attivazione. </li><li> Aggiungere 50 microlitri (approssimativo, senza scongelare) di brodo glicerolo a 50 mL di amplificatore LB e far crescere a 37 ° C durante la notte con agitazione. </li><li> Diluire 1:10 in 500 ml LB-amp e crescere per 1 h. </li><li> Indurre GST-produzione di proteine ​​con 0,1 mM IPTG per 2 ore. </li><li> Distribuire uniformemente in bottiglie da centrifuga e centrifugare, Sorval GSA3 rotore a 5000 giri 4 ° C per 20 min. </li><li> Risospendere le sfere in bottiglie di centrifuga, 10 ml di tampone di lisi *. * Buffer di lisi batterica: 20% di saccarosio, 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Aggiungi fresca PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina. </li><li> Sonicare 2-3 minuti (dipende dal tipo di ultrasuoni. Usiamo un Fischer di Sonic Dismembranator modello 500 fissato a segno 6, ciclo 50%). </li><li> Centrifuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. A questo punto una piccola aliquota può essere estratto e gestito da SDS-PAGE. Il gel può essere colorato Coomassie e una band dovrebbe essere evidente a 46 kDa. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di 50% di glutatione-Sepharose liquami 4B. </li><li> Incubare per 30 minuti a 4 ° C con rotazione. Lavare 3 volte con tampone di lisi. </li><li> Risospendere le sfere GST-RBD/glutatione-Sepharose ad un impasto 50% (circa 1 mL) con GST-pesce tampone **. ** GST-Fish Buffer: 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Aggiungere fresco PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina </li></ol> 2. Fusione GST-pull down assay <ol><li> Usa 5-10 x 10 6 cellule / test </li><li> Lavare le cellule una volta nel ghiaccio PBS freddo, tenere le piastre in ghiaccio (usiamo un piatto di vetro piano riempito di ghiaccio) e lisare con 0,5 ml di GST-pesce buffer. </li><li> Incubare 5 minuti in ghiaccio, le cellule raccolta con un poliziotto in gomma o scrapper piatto, trasferimento in microcentrifuga tubo e centrifugare 20.000 rpm 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta per microcentrifuga fresca. Prendere 50 microlitri per determinare totale Rho (cioè il PIL + GTP legato). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di perline GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubare a 4 ° C, durante la notte con la rotazione. </li><li> Lavare 6x con GST-pesce buffer. </li><li> Perline Risospendere in 40 microlitri 2x-Laemelli tampone campione A questo punto la concentrazione del totale aliquota proteina Rho preso in 2.4 deve essere determinata e 30 mcg pronto per essere eseguito sul gel con il campione di attivazione corrispondenti. </li><li> Campioni bollire a 90 ° C per 5 minuti, centrifugare brevemente e prendere surnatante (cioè evitare le perline), caricare ed eseguire su un 12-ben pendenza 4-20% SDS-PAGE gel. </li><li> Esegui gel senza tensione superiore a 150, il trasferimento alla membrana utilizzando tampone Towbin e costante corrente di 100 W. </li><li> Blocco della membrana con 5% di latte / TBST soluzione e sonda con RhoC-specfic anticorpi. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Buoni risultati dovrebbero produrre una singola banda di circa 22 kDa. Cattivi risultati producono bande multiple o fondo elevato. Questo è indicativo di degradazione delle proteine, lavaggio incompleta di campioni o l'utilizzo di vecchi GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Tre linee di cellule distinte che esprimono diversi livelli di RhoC GTPasi sono mostrati per dimostrare bassi livelli di RhoC attivo e totale, alti livelli di RhoC attivo e totale o nessuna RhoC. La macchia è stato poi spogliato e reprobed con un anticorpo alla actina house keeping gene per servire come un controllo di carico per la proteina RhoC totale. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Bande multiple o risultati di elevato background dalla degradazione delle proteine, lavaggio incompleto dei campioni o l'uso di vecchie GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La fase più critica della procedura è la generazione di nuove GST-RBD. Il mancato prestare molta attenzione a questo passo è motivo principale per il fallimento. Tutte le fasi, dalla generazione del GST-RBD (1,2) per la notte di incubazione con il lisato cellulare (2,5), dovrebbe essere fatto in un solo giorno. Un altro passo fondamentale è quello di rendere certo che ci sono cellule sufficienti per produrre la lisati cellulari. Questo è di particolare importanza quando si guarda RhoC GTPasi, che tende ad essere present...

<table><tbody><tr><td>Perle di Glutatione-sefarosio 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel Criterion 4-20% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpasi attivazione di analisi

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPasi ha il 91% di omologia RhoA GTPasi. A causa della sua diffusione nelle cellule, reagenti e tecniche per molti RhoA GTPasi sono stati sviluppati. Tuttavia, RhoC GTPasi è espressa nelle cellule tumorali metastatiche a livelli relativamente bassi. Quindi, pochi RhoC reagenti specifici sono stati sviluppati. Abbiamo adattato un test per rilevare l&#39;attivazione Rho GTPasi RhoC. Questa tecnica utilizza un GST-Rho legame proteina di fusione del dominio a tirare fuori attivo GTPasi RhoC. Inoltre, siamo in grado di raccogliere proteine ​​totali all&#39;inizio del test per determinare i livelli di totale (GTP e PIL legato) GTPasi RhoC. Questo permette la determinazione di principi attivi rispetto al totale delle GTPasi RhoC nella cella. Diverse versioni commerciali di questa procedura sono stati sviluppati tuttavia, i kit commerciali sono ottimizzati per RhoA GTPasi e di solito non funzionano bene per RhoC GTPasi. Parti del test sono stati modificati, nonché lo sviluppo di una RhoC-anticorpo specifico.

Questo protocollo utilizza un pull down di analisi per determinare i livelli di attivo GTPasi RhoC all&#39;interno delle cellule.

RhoC GTPasi attivazione di analisi

La GTPasi RhoC presenta un'omologia del 91% con la GTPasi RhoA. A causa della prevalenza di quest'ultima nelle cellule, sono stati sviluppati numerosi reagenti e tecniche per la GTPasi RhoA. ...

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Il metodo qui presentato descrive un saggio per seguire l'attivazione di specifici RhoA PIL / GTP Fattori di cambio (GEFs) in cellule coltivate facendo uso di una proteina di fusione GST RhoA mutante che ha un'elevata affinità per GEFs attivati. GEFs vengono precipitati da lisati cellulari, rilevati da Western blotting e quantificato mediante densitometria.

Affinità Precipitazioni di Active Rho-GEFs Utilizzo di un GST-tagged Mutant proteina Rho (GST-RhoA (G17A)) da lisati di cellule epiteliali

Questo video mostra un test di competizione per studiare i partner proteici leganti GTPasi. Utilizzando la proteina GTPasi legata ai nucleotidi immobilizzata su sfere magnetiche, il legame competitivo tra due partner proteici interagenti per lo stesso sito di legame sulla GTPasi può essere studiato per valutare le affinità di legame dei partner proteici.

Saggio di legame della competizione per studiare i partner proteici leganti la GTPasi in competizione

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Questo protocollo confronta le affinità relative dei partner di legame per le GTPasi della famiglia Rho, incluso Rac1. In vivo, le proteine leganti Rac1 competono per una singola interfaccia di legame, la cui conformazione è dettata da un nucleotide legato. Il nucleotide è importante e difficile da controllare sperimentalmente, a causa dell'alto tasso di idrolisi.

Confrontando l&#39;affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

L'adsorbimento di peptidi su plastica durante le tradizionali diluizioni seriali basate su puntali può avere un impatto significativo sulla determinazione della potenza e confondere la comprensione delle relazioni struttura-attività utilizzate per l'identificazione del piombo e le fasi di ottimizzazione del piombo della scoperta di farmaci. Qui vengono descritti i metodi per la diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto di campioni di peptidi.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

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Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell'immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

Questo rapporto descrive lo screening di diversi detergenti per la preparazione del GPCR visivo, rhodopsin, e il suo complesso con mini-Go. Sono dimostrati metodi biochimici che caratterizzano la qualità del complesso nelle diverse fasi durante la purificazione. Questo protocollo può essere generalizzato ad altri complessi proteici della membrana per i loro futuri studi strutturali.

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Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Impara a quantificare i livelli di RhoC GTPasi attiva nelle cellule utilizzando il pull down assay. Questo metodo fornisce dati quantitativi affidabili per studiare la funzione di RhoC nella biologia cellulare.

RhoC GTPasi attivazione di analisi

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