Name: Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Scopri l'imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm mediante LAESI, una tecnica di spettrometria di massa a pressione atmosferica che non richiede preparazione del campione.

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Gli autori sono grati per il sostegno finanziario di questo lavoro dalla US National Science Foundation sotto Grant No. 0719232, dal Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti (DEFG02-01ER15129), e da Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Gli autori desiderano inoltre ringraziare Jessica A. Stolee per il suo aiuto durante la videoregistrazione del protocollo.

Il protocollo che segue descrive i passi principali della ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) esperimento e fornisce esempi rappresentativi per la laterale e tridimensionali (3D), immagini di animali e campioni di tessuti vegetali. Ulteriori dettagli sperimentali e tecniche può essere ottenuto da altre parti. 1-6 1. Preparazione e montaggio del tessuto <ol><li> Se sezionamento è necessario, utilizzare un cryomicrotome alla sezione del tessuto in 10-100 micron fette spesse a -10 a -20 ° C se non diversamente indicato per un tipo di tessuto particolare. </li><li> Monte sezioni su una superficie piana (ad esempio, chimicamente pre-pulito vetrino) direttamente, senza modificatori chimici. Per i tessuti sezionati, disgelo con montaggio delle sezioni e sicuro supporto del campione ad un Peltier di raffreddamento stadio subito dopo disgelo montaggio per mantenere il tessuto congelato in ogni momento durante l'analisi. Questo passaggio è necessario per ridurre al minimo / prevenire la migrazione molecolare della sezione. </li><li> Se necessario, utilizzare un dissipatore dotato di una ventola a basso consumo per facilitare la rimozione del calore dal Peltier stadio per mantenere il tessuto congelato. </li><li> In un ambiente umido per un lungo periodo di tempo (1-2 ore), per controllare condensazione di acqua o ghiaccio sulla superficie del tessuto. Condensa sul tessuto influenza negativamente le prestazioni di imaging in esperimenti LAESI 1. </li><li> Se necessario, utilizzare un deumidificatore stanza o posto il campione raffreddato in una camera climatica riempito con un gas inerte (ad esempio, gas azoto secco) per evitare la condensa 1. </li></ol> 2. Ottimizzazione della sorgente di ioni LAESI La sorgente di ioni LAESI consiste in un mid-laser infrarosso, una serie di elementi ottici per la direzione della luce e messa a fuoco così come i titolari campione supplementare, componenti di raffreddamento, le fasi di traduzione, e un sistema di erogazione del solvente. La Figura 1 mostra la disposizione tipica di questi elementi rispetto ai all'ingresso della pressione atmosferica sorgente ionica di uno spettrometro di massa. <ol><li> Come illustrato nella figura 1, la posizione del campione di 15-20 millimetri sotto l'orifizio del cono di campionamento spettrometro di massa (d O-FP). </li><li> Operare un mid-IR laser a lunghezza d'onda 2,94 micron e 10 Hz frequenza di ripetizione. Attenuare la potenza laser a ~ 100 μJ / impulsi di energia. </li><li> Utilizzare una combinazione di specchi d'oro e una lente di messa a fuoco trasparente alla lunghezza d'onda laser (per esempio, un piano-convessa CaF 2 o ZnSe lente) per accoppiare la energia dell'impulso laser nel campione di incidenza normale (vedi incidenza con angolo retto rispetto alla superficie del campione nella Figura 1). </li><li> Posizionare il medio infrarosso asse fascio 5-8 mm di fronte l'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa. </li><li> Regolare la posizione della lente di messa a fuoco e l'energia degli impulsi del raggio laser per ottenere la rimozione dei tessuti nel punto focale. Le dimensioni del volume ablato determinare il pixel (o voxel in immagini tridimensionali) dimensioni per l'applicazione di imaging. </li><li> Posizionare un emettitore nanospray in linea con l'asse di ingresso dello spettrometro di massa e in un orifizio a emettitore distanza punta di ~ 10 mm (vedi figura 1). </li><li> Per la electrospray, preparare una soluzione metanolo 50% con 0,1% di acido acetico o 0,1% di additivo acetato di ammonio per la modalità di ioni positivi o negativi, rispettivamente. A seconda del campione, altri solventi organici, quali acetonitrile, isopropanolo, ecc, può sostituire il metanolo a concentrazioni appropriate per l'attività di analisi. La stabilità del electrospray è cruciale per l'imaging di successo. In base alla selezione solvente, la portata e la tensione spruzzo devono essere adeguate per raggiungere spruzzo stabile. </li><li> Per reattivi LAESI 6 in applicazioni di imaging, la soluzione electrosprayed può contenere reagenti. </li><li> Utilizzare una pompa a siringa per fornire la soluzione electrospray attraverso l'emettitore electrospray ad una portata di circa 300 Nl / min. </li><li> Se l'orifizio spettrometro di massa viene mantenuta a bassa tensione (&lt;500 V misurato contro terra), generare electrospray applicando alta tensione direttamente al emettitore elettrospray (ad esempio, 3000 V) o attraverso un raccordo metallico. Altrimenti, terra direttamente l'emettitore electrospray o mediante l'unione di metallo per stabilire elettrospray. </li><li> Attivare la sorgente electrospray a cono-nebulizzazione modalità per la generazione di ioni più efficiente per LAESI. Per l'effetto di variabili operative sulle modalità di spruzzatura e il loro effetto sulla spettri di massa, vedi discussioni altrove. 5,7,8 </li><li> Regolare con cura le distanze relative del setup LAESI per ottimizzare rendimento LAESI ioni mantenendo il fascio laser, l'emettitore, e gli assi orifizio sullo stesso piano. Si prega di trovare le istruzioni dettagliate altrove 5. </li><li> Con un microscopio ottico, determinare le dimensioni laterali del cratere ablazione sul campione. </li><li> Per tridimensionale esperimenti di imaging LAESI, eseguire l'ablazione con impulsi individuali e di determinare la profondità di un voxel utilizzando, per esempio, lo z-stack mode in microscopia ottica 3. </li></ol> 3. Imaging molecolare e analisi dei dati Nell'esperimento di imaging, il campione di tessuto viene spostato nel piano focale del laser nelle direzioni X e Y con dimensioni passo maggiore o uguale alle dimensioni dello spot ablazione. La risoluzione spaziale è limitata dalla focalizzazione del fascio laser incidente. <ol><li> Selezionare l'area di interesse sulla superficie del campione e ottenere la (X, Y) coordinate dei confini corrispondente. </li><li> Ha scelto un algoritmo gridding (ad esempio, griglia adattiva, l'imaging regione selezionata, griglia rettangolare, modello a spirale, Z scansione, ecc) con cui raster superficie del campione selezionato con tempo di permanenza per ogni pixel sopra l'area da acquisire. </li><li> Utilizzare un tre assi fase di traduzione e software che è in grado di rastering il campione secondo la griglia predeterminata. </li><li> Calcolare il tempo totale richiesto per l'imaging. </li><li> Disabilitare il limite di acquisizione dati in tempo dello spettrometro di massa. Se questo non è possibile, impostare il limite di acquisizione dati in tempo al valore calcolato il tempo di imaging. </li><li> Avviare il medio infrarosso sorgente laser ad una frequenza di ripetizione corretta di produrre sufficiente rapporto segnale-rumore nello spettro di massa entro il tempo di permanenza per ogni pixel per eseguire un esperimento di imaging LAESI laterale. Per il 3D imaging molecolare, utilizzano una frequenza di acquisizione dello spettro superiore al tasso di ripetizione sorgente laser al successo di massa analizzare gli ioni generati all'interno di un singolo impulso laser. Attendere il segnale di START per avviare la sequenza di ablazione. </li><li> Accendere la sorgente electrospray. Assicurarsi che ci sia una soluzione sufficiente per il tempo pieno richiesto per l'imaging. </li><li> Contemporaneamente avviare l'acquisizione di spettri di massa, alla metà degli IR ablazione laser, e la scansione della superficie. </li><li> Quando la corsa di imaging ha finito, STOP la scansione della superficie, la metà degli IR laser, e l'acquisizione dei dati. </li><li> Disabilitare la sorgente laser. </li><li> Spegnere l'alta tensione. </li><li> Spegnere la pompa a siringa. </li><li> Impostare lo spettrometro di massa in modalità Standby. </li><li> Spegnere il Peltier di raffreddamento dell'elettronica. </li><li> Chiudere il flusso di gas inerte se usato. </li><li> Utilizzare un software di correlare le coordinate assolute dei pixel in immagini laterale o il voxel in analisi 3D con gli spettri corrispondenti. </li><li> Tracciare il segnale di intensità di ioni per un selezionato m / z valore contro le coordinate assolute di analisi per ottenere immagini molecolari laterale e 3D. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati La Figura 2 dà risultati rappresentativi per alcuni tipi di tessuti importanti e modalità di imaging. Un pannello descrive un caso di una sezione di tessuto animale che è stato congelato durante l'esperimento per prevenire la disidratazione. 1 In aggiunta, il campione si trovava in un ambiente asciutto gas azoto per evitare i vapori d'acqua ambiente da condensa sulla superficie del campione. Un 100-micron di spessore sezione coronale di un cervello di ratto (Rattus norvegicus) è stato ripreso con LAESI lateralmente. Le regioni anatomiche del cervello (vedi immagine ottico in pannello A) mostrano una buona correlazione con l'immagine molecolare ottenuto per il PC plasmalogeni (O-33: 3) e / o PE (O-36: 3) con m / z 728,559. Pannello B mostra l'imaging 3D LAESI di un impianto di Zebra (Aphelandra squarrosa) del tessuto fogliare. Perché lascia possedere un meccanismo naturale di difesa contro la disidratazione, il campione può essere interrogato per l'ambiente circostante. 3 Il ottenute immagini 3D molecolare ha rivelato una serie di modelli di distribuzione per i metaboliti primari e secondari. Tra gli altri, acacetin con m / z 285,076 è stato rilevato al conteggio di ioni superiore nei settori giallo degli strati secondo e il terzo dalla parte superiore con una distribuzione omogenea nelle altre. Questa distribuzione d'accordo con il modello della variegatura visto in ottica dell'immagine. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica del sistema LAESI (ES, punta emettitore electrospray; O, orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa, FL, concentrandosi lente, FP, punto focale, P, Peltier fase di raffreddamento; HS, dissipatore di calore). Una parte del materiale particolato espulso durante la metà degli IR ablazione (punti rossi) si fonde con la elettrospray per produrre gocce carica seminato con molecole e ioni del campione (punti verdi). Gli ioni liberati da queste gocce sono analizzati e registrati dal spettrometro di massa. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi per la laterale e 3D immaginario. LAESI ng con spettrometria di massa (A) Il pannello superiore mostra l'immagine ottica di un cervello di ratto (Rattus norvegicus) sezione coronale e l'immagine molecolare ottenuto per il PC plasmalogeni (O-33: 3) e / o PE (O-36 : 3) con m / z 728,559. La barra di scala bianca corrisponde a 1 mm. Adattato con il permesso (Riferimento 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Il pannello in basso mostra l'imaging 3D di una foglia da un variegato Zebra pianta (Aphelandra squarrosa). Acacetin con m / z 285,076 è stato rilevato al conteggio di ioni superiore nei settori giallo degli strati secondo e il terzo dalla parte superiore con una distribuzione omogenea nelle altre. Ristampato con il permesso (Riferimento 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Tipi di tessuto differenti mostrano diversi contenuto d&#39;acqua e resistenza alla trazione, che, a loro volta, possono influenzare le caratteristiche di ablazione dei campioni. 9 Per mitigare questi effetti, si desidera che i protocolli la fluenza laser, manipolazione del campione, analisi e revisione quando si passa da principali tipi di tessuto. Per singola cella o indagini ad alta risoluzione, il medio infrarosso della luce può essere accoppiato in una fibra ottica affilato invece di una lente di focalizzazione. 10 Con il posizionamento della punta della fibra nelle immediate vicinanze delle celle selezionate in un tessuto, LAESI analisi può essere eseguita su uno livello di singola cellula. Come un marchio senza sorgente di ioni per la spettrometria di massa a ionizzazione ambiente, 11 LAESI ha dimostrato un grande potenziale per lo studio dei processi biochimici nei tessuti. Con i benefici aggiunti di analisi diretta, l&#39;imaging laterale e 3D, LAESI è uno strumento emergente bioanalitici per il profiling così come le applicazioni di imaging.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>Laser a medio infrarosso</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

pressione atmosferica imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da laesi spettrometria di massa

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Metodi di ionizzazione ambiente in spettrometria di massa permettono indagini analitiche da effettuare direttamente su un tessuto o biofilm in condizioni sperimentali di tipo nativo. Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) ne è un esempio ed è particolarmente adatto per lo studio di acque contenenti i campioni. LAESI utilizza un medio infrarosso raggio laser (lunghezza d&#39;onda 2,94 micron) per eccitare le molecole d&#39;acqua del campione. Quando la soglia fluenza ablazione viene superato, il materiale del campione viene espulsa sotto forma di particolato e di questi proiettili viaggio a decine di millimetri al di sopra della superficie del campione. In LAESI, questo pennacchio ablazione viene intercettato da goccioline molto carico per catturare una frazione del materiale del campione espulso e convertire i suoi costituenti chimici in fase gassosa ioni. Uno spettrometro di massa equipaggiato con un pressione atmosferica interfaccia sorgente ionica è utilizzata per analizzare e registrare la composizione degli ioni liberati provenienti dalla zona sondato (pixel) del campione. Un interrogatorio sistematico su un array di pixel apre una via per l&#39;imaging molecolare in modalità di analisi microsonda. Un aspetto unico di imaging LAESI spettrometria di massa è profiling profondità che, in combinazione con immagini laterali, consente tridimensionale (3D) l&#39;imaging molecolare. Con gli attuali risoluzioni laterali e la profondità di circa 100 micron e ~ 40 micron, rispettivamente, l&#39;imaging LAESI spettrometria di massa consente di esplorare la struttura molecolare dei tessuti biologici. Qui, passiamo in rassegna i principali elementi di un sistema LAESI e fornire linee guida per un esperimento di imaging di successo.

Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) è una pressione atmosferica sorgente di ioni per la spettrometria di massa. Nella modalità di imaging, un medio infrarosso sonde laser le distribuzioni delle molecole attraverso una sezione di tessuto o di un biofilm. Questa tecnica presenta un nuovo approccio per diversi studi bioanalitici effettuata sotto natale condizioni sperimentali.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

I metodi di ionizzazione ambientale nella spettrometria di massa consentono di eseguire indagini analitiche direttamente su un tessuto o un biofilm in condizioni simili a quelle native...

Per eseguire un esperimento di imaging mediante spettrometria di massa lazy su un tessuto biologico o su un biofilm, si prepara l'allestimento lazy per un funzionamento robusto. Il passo successivo consiste nel montare il campione su un portacampione e identificare le condizioni sperimentali necessarie per il campione in esame. Successivamente, si avvia l'esperimento di imaging molecolare lazy in senso laterale e si utilizzano i dati richiesti per ottenere le distribuzioni spaziali delle molecole.I risultati mostrano l'architettura molecolare di tessuti biologici e biofilm. Sono il dottor Peter Nemes del laboratorio di ricerca Vertus della George Washington University. Il vantaggio principale della tecnica lazy rispetto ad altri metodi, inclusi quelli di imaging confocale, ottico e di spettrometria di massa come Maldi e sims, è che l'analisi del campione può essere eseguita direttamente sul tessuto in condizioni di pressione atmosferica, senza necessità di trattamento del campione.Montare direttamente i preparati di tessuto di interesse su una superficie piana, come un vetrino in vetro preventivamente pulito chimicamente e privo di modificatori chimici. Fissare immediatamente il campione su un piatto di raffreddamento Peltier, se necessario, utilizzando un dissipatore di calore dotato di un ventilatore a bassa potenza per facilitare la rimozione del calore dal piatto Peltier. Successivamente, se si lavora in un ambiente umido per un periodo prolungato di circa una o due ore, verificare la presenza di condensa d'acqua o ghiaccio sulla superficie del tessuto.La condensazione dell'acqua sui tessuti influisce negativamente sulle prestazioni di imaging negli esperimenti lazy. Se necessario, utilizzare un deumidificatore ambientale oppure posizionare il campione chiamato in una camera ambientale riempita con un gas inerte, come azoto secco, per prevenire la condensazione. Dopo aver ottimizzato le condizioni per il mantenimento del campione, procedere a ottimizzare la sorgente ionica utilizzata nell'ablazione laser, nell'ionizzazione mediante elettrospruzzo o nella sorgente lazy iron, costituita da un laser a infrarossi medio, abbreviato mid ir, e da una serie di elementi ottici per la deviazione e la focalizzazione della luce.L'allestimento include anche portacampioni aggiuntivi, componenti di raffreddamento, piattaforme di traslazione e un sistema di elettrospruzzo. Una parte della materia particolata espulsa durante l'ablazione nell'infrarosso medio si aggrega con l'elettrospruzzo per produrre goccioline cariche contenenti molecole e ioni del campione. Gli ioni rilasciati da queste goccioline vengono analizzati e registrati dallo spettrometro di massa, il cui orifizio è mostrato qui.La configurazione lazy viene effettuata prima di iniziare l'esperimento. Sono necessari aggiustamenti precisi dei parametri sperimentali per adattare il campione scelto e ottimizzare la sorgente di ioni. Posizionare innanzitutto il campione a una distanza compresa tra 15 e 20 millimetri al di sotto dell'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa.Utilizzare il laser a medio IR a una lunghezza d'onda di 2,94 micrometri e una frequenza di ripetizione di 10 hertz. Attenuare l'uscita del laser a circa 100 microjoule per impulso. Utilizzare una combinazione di specchi d'oro e una lente focalizzante trasparente alla lunghezza d'onda del laser per accoppiare l'energia luminosa del laser al campione.In posizione di incidenza normale, posizionare l'asse B del mid-infrared, da cinque a otto millimetri davanti all'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa. Regolare la posizione della lente di focalizzazione e l'energia dell'impulso laser per ottenere la rimozione del tessuto nel punto focale alla profondità desiderata. Le dimensioni del volume ablato.Determinare la dimensione del pixel per l'applicazione di imaging. Posizionare un emettitore NanoESpray allineato con l'asse di ingresso dello spettrometro di massa, a una distanza di circa 10 millimetri tra l'orifizio e la punta dell'emettitore. Per l'elettrospray, preparare una soluzione al 50% di metanolo con 0,1% di acido acetico per la modalità a ioni positivi oppure 0,1% di acetato di ammonio.In modalità ioni negativi. La stabilità dell'elettrospruzzo è fondamentale per un'immagine di successo. A seconda della scelta del solvente, la portata e la tensione di spruzzo devono essere regolate per ottenere uno spruzzo stabile.Per applicazioni reattive, in modalità lazy e di imaging, la soluzione per l'elettrospruzzo può contenere reagenti. Utilizzare una pompa per siringa per erogare la soluzione per l'elettrospruzzo attraverso l'emettitore di elettrospruzzo a una portata di circa 300 nanolitri al minuto. Se l'orifizio dello spettrometro di massa è mantenuto a bassa tensione, ad esempio inferiore a circa 500 volt misurati rispetto a massa, generare l'elettrospruzzo applicando una tensione elevata, ad esempio 3000 volt, direttamente all'emettitore di elettrospruzzo o attraverso un raccordo metallico.Utilizzare la sorgente elettrospray in modalità di spruzzo a getto conico per una generazione ionica più efficiente; regolare con attenzione le distanze relative dell'allestimento lazy per ottimizzare il rendimento ionico, mantenendo allo stesso tempo il fascio laser, l'emettitore e gli assi dell'orifizio sullo stesso piano mediante un microscopio ottico. Determinare le dimensioni laterali del cratere di ablazione sul campione per esperimenti di imaging tridimensionale lazy. Eseguire l'ablazione con impulsi singoli e determinare la profondità di un voxel utilizzando, ad esempio, la modalità stack Z in microscopia ottica.Ora che le condizioni di montaggio del tessuto e la sorgente di ionizzazione sono state ottimizzate, procedere all'imaging molecolare nell'esperimento di imaging. Il campione di tessuto viene spostato nel piano focale del laser nelle direzioni x e y con dimensioni di passo maggiori o uguali alle dimensioni del punto di ablazione. La risoluzione spaziale è limitata dal focalizzazione del fascio laser incidente.Selezionare un'area di interesse sulla superficie del campione e ottenere le coordinate XY dei relativi confini. Scegliere un algoritmo di grigliatura per scandire la superficie del campione con un tempo di permanenza selezionato in ogni pixel sull'area da immaginare. Utilizzare un piatto di traslazione XYZ e un software in grado di muovere il campione secondo la griglia predeterminata.Quindi calcolare il tempo totale necessario per l'acquisizione delle immagini. Avviare la sorgente laser a medio infrarosso a una frequenza di ripetizione adeguata a produrre un rapporto segnale-rumore sufficiente per gli ioni selezionati nello spettro di massa all'interno del tempo di permanenza in ogni pixel. Per eseguire un esperimento di imaging laterale in modalità lazy, accendere la sorgente di elettrospruzzo.Assicurarsi che ci sia una quantità sufficiente di soluzione per l'intero tempo necessario all'acquisizione delle immagini. Avviare contemporaneamente l'acquisizione degli spettri di massa, l'ablazione con il laser a media IR e la scansione della superficie, quindi raccogliere i dati. Al termine della sessione di imaging, arrestare la scansione della superficie, il laser a media IR e l'acquisizione dei dati.Disattivare la sorgente laser, spegnere l'alta tensione, spegnere la pompa per siringa e impostare lo spettrometro di massa in modalità stand-by. Inoltre, spegnere l'elettronica di raffreddamento del palt e chiudere il flusso di gas inerte. Se utilizzato.Infine, tracciare il segnale di intensità ionica per un valore MZ selezionato in funzione delle coordinate assolute di analisi per ottenere immagini molecolari laterali o tridimensionali. Queste sono immagini rappresentative ottenute da un'acquisizione laterale in modalità lazy di una sezione coronale di cervello di ratto di 100 micrometri di spessore. La sezione è stata congelata durante l'esperimento e mantenuta in un'atmosfera di azoto gassoso secco.Le regioni anatomiche del cervello mostrano una buona correlazione con l'immagine molecolare ottenuta per due plasmodi con MZ 2 78 0,59. Si tratta di un esperimento di imaging molecolare in 3D mediante tessuto fogliare di pianta zebra analizzato in ambiente ambiente tra altri metaboliti primari e secondari. ASCE con MZ 2 85 0,076 è stato rilevato con un numero maggiore di ioni nelle aree gialle del secondo e terzo strato a partire dall'alto, con una distribuzione omogenea.Negli altri casi, questa distribuzione concordava con il modello di variazione osservato nell'immagine ottica. H dopo il suo sviluppo. La tecnica lazy ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'analisi e della chimica B per lo studio della composizione molecolare e dell'organizzazione spaziale di tessuti e biofilm con contenuto d'acqua apprezzabile.Non dimenticare che lavorare con un laser a infrarossi medio e una sorgente elettrica per aerosol può essere estremamente pericoloso. Segui sempre i protocolli standard di sicurezza per i laser e applica una schermatura adeguata a tutte le connessioni elettriche durante questa procedura.

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Biologia

Analisi di singola cellula viene effettuata mediante spettrometria di massa su cellule animali e vegetali a pressione atmosferica, utilizzando una fibra ottica affilato per assaggiare le cellule per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Secondaria elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (SESI-MS) permette la rilevazione di composti organici volatili (COV) senza la necessità di alcun pre-trattamento del campione. Questo protocollo fornisce le istruzioni per il rapido (pochi minuti) caratterizzazione di COV batterica utilizzando SESI-MS.

Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all'interno di sezioni di tessuto.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Spettroscopia laser ripartizione indotta eseguita su organi sottile e tessuto tumorale rilevato con successo elementi naturali e gadolinio artificialmente iniettato (Gd), emessi da nanoparticelle a base di Gd. Immagini di elementi chimici raggiunto una risoluzione di 100 micron e sensibilità quantitativa sub-mM. La compatibilità del setup con la microscopia ottica standard sottolinea la sua capacità di fornire immagini multiple di uno stesso tessuto biologico.

Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

Qui, presentiamo i protocolli per eseguire sia l'imaging con spettrometria di massa ambientale (MSI) dei tessuti che l'analisi in situ di MS a singola cellula viva (SCMS) utilizzando la sonda singola, che è un dispositivo multifunzionale miniaturizzato per l'analisi MS.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Una sorgente di imaging per spettrometria di massa (MSI) operata a pressione atmosferica è stata sviluppata accoppiando il desorbimento laser nel medio infrarosso e la post-ionizzazione elettrospray. La matrice di ghiaccio esogena è stata utilizzata come matrice di assorbimento dell'energia per facilitare il desorbimento risonante del materiale correlato ai tessuti. Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per l'esecuzione dell'IR-MALDESI MSI di topo neonatale di tutto il corpo.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Un protocollo per la caratterizzazione di composizione chimica di respiro esalato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiato ad alta risoluzione in spettrometria di massa è dimostrata.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla preparazione del campione quando si pianificano esperimenti utilizzando MALDI MSI per massimizzare il rilevamento metabolico e molecolare in campioni biologici.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Scopri l'imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm mediante LAESI, una tecnica di spettrometria di massa a pressione atmosferica che non richiede preparazione del campione.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

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