Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Per eseguire un esperimento di imaging con spettrometria di massa pigra su un tessuto biologico o un biofilm, la configurazione pigra è preparata per un funzionamento robusto. Il passo successivo consiste nel montare il campione in una fase di campionamento e identificare le condizioni sperimentali necessarie per il campione in esame. Quindi viene avviato l'esperimento di imaging molecolare pigro laterale e i dati richiesti vengono utilizzati per ottenere distribuzioni molecolari spaziali.

I risultati mostrano l'architettura molecolare dei tessuti biologici e dei biofilm. Sono il Dr.Peter Nemes del Vertus Research Laboratory della George Washington University. Il vantaggio principale della tecnica lazy rispetto ad altri metodi, inclusi i metodi di imaging confocale, ottico e di spettrometria di massa come Maldi e sims, è che l'analisi del campione può essere eseguita direttamente sul tessuto in condizioni di pressione atmosferica e non è necessario alcun trattamento del campione.

Monta le sezioni di tessuto di interesse direttamente su una superficie piana, come un vetrino pre-pulito chimicamente senza modificatori chimici. Fissare il campione allo stadio di raffreddamento immediatamente dopo il montaggio, se necessario, utilizzare un dissipatore di calore dotato di una ventola a bassa potenza per facilitare la rimozione del calore dallo stadio di pelt. Quindi, se si lavora in un ambiente umido per un periodo di tempo prolungato per circa una o due ore, ispezionare la presenza di condensa di acqua o ghiaccio sulla superficie del tessuto.

La condensa dell'acqua sul tessuto influisce negativamente sulle prestazioni di imaging negli esperimenti pigri. Se necessario, utilizzare un deumidificatore per ambienti o posizionare il campione chiamato in una camera ambientale riempita con un gas inerte, come l'azoto gassoso secco per evitare la condensa. Dopo aver ottimizzato le condizioni per il mantenimento del campione, il lavoro per ottimizzare la sorgente ionica utilizzata, l'ablazione laser, la ionizzazione elettrospray o la sorgente di ferro pigro sono costituite da un laser a medio infrarosso, abbreviato in mid ir, e da una serie di elementi ottici per l'orientamento e la messa a fuoco della luce.

La configurazione include anche portacampioni aggiuntivi, componenti di raffreddamento, stadi di traslazione e un sistema di spruzzatura elettro. Una parte del particolato espulso durante l'ablazione a infrarossi medio si fonde con l'elettrospray per produrre goccioline cariche seminate con molecole e ioni del campione. Gli ioni rilasciati da queste goccioline vengono analizzati e registrati dallo spettrometro di massa, il cui orifizio è mostrato qui.

La configurazione differita viene configurata prima di iniziare l'esperimento. Sono necessarie regolazioni precise dei parametri sperimentali per accogliere il campione scelto per ottimizzare la sorgente ionica. Iniziare posizionando il campione da 15 a 20 millimetri sotto l'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa.

Utilizzare il laser a medio infrarosso a una lunghezza d'onda di 2,94 micrometri e una frequenza di ripetizione di 10 hertz. Attenuare l'uscita del laser a circa 100 micro joule per energia dell'impulso. Utilizzare una combinazione di specchi dorati e una lente di messa a fuoco trasparente alla lunghezza d'onda del laser per accoppiare l'energia della luce laser nel campione.

In caso di incidenti normali posizionare l'asse B nel medio infrarosso, da cinque a otto millimetri davanti all'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa. Regolare la posizione della lente di messa a fuoco e l'energia dell'impulso laser per ottenere la rimozione del tessuto nel punto focale alla profondità desiderata. Le dimensioni del volume ablato.

Determinare la dimensione dei pixel per l'applicazione di imaging. Posizionare un emettitore di spray nanos in linea con l'asse di ingresso dello spettrometro di massa e in un orifizio per emettere una distanza della punta di circa 10 millimetri. Per l'elettrospray, preparare una soluzione di metanolo al 50% con acido acetico allo 0,1% per la modalità ionica positiva o allo 0,1% di acetato di ammonio.

Per la modalità ioni negativi. La stabilità dell'elettrospray è fondamentale per il successo dell'imaging. A seconda della scelta del solvente, la portata e la tensione di spruzzatura devono essere regolate per ottenere una spruzzatura stabile.

Per applicazioni reattive, pigre e di imaging, la soluzione spray per elettroni può contenere reagenti. Utilizzare una pompa a siringa per erogare la soluzione elettrospray attraverso l'elettro emettitore spray a una portata di circa 300 nanolitri al minuto. Se l'orifizio dello spettrometro di massa viene mantenuto a bassa tensione, ad esempio al di sotto di circa 500 volt misurati contro il suolo, generare elettrospray applicando un'alta tensione, ad esempio 3000 volt direttamente all'emettitore dell'elettrospray o attraverso un raccordo metallico.

Azionare la sorgente di spruzzatura elettro in modalità di spruzzatura a getto conico per la generazione di ioni più efficiente mediante pigrizia, regolare attentamente le distanze relative della configurazione pigra per ottimizzare la resa ionica pigra mantenendo il raggio laser, l'emettitore e gli assi dell'orifizio sullo stesso piano con un microscopio ottico. Determinare le dimensioni laterali del cratere di ablazione sul campione per esperimenti di imaging pigro tridimensionale. Eseguire l'ablazione con impulsi individuali e determinare la profondità di un voxel utilizzando, ad esempio, la modalità stack Z nella microscopia ottica.

Ora che le condizioni di montaggio del tessuto e la sorgente di ionizzazione sono ottimizzate, procedere all'imaging molecolare nell'esperimento di imaging. Il campione di tessuto viene spostato sul piano focale del laser nelle direzioni x e y con passi di dimensioni maggiori o uguali alle dimensioni del punto di ablazione. La risoluzione spaziale è limitata dalla focalizzazione del raggio laser incidente.

Selezionare un'area di interesse sulla superficie del campione e ottenere le coordinate XY dei contorni corrispondenti. Scegliete un algoritmo di grigliatura con cui rasterizzare la superficie campione con il tempo di permanenza selezionato in corrispondenza di ciascun pixel sull'area da riprendere. Utilizzare un tre stadi di traslazione XS e un software in grado di eseguire la traslazione del campione secondo la griglia predeterminata.

Quindi calcola il tempo totale necessario per l'imaging. Avviare la sorgente laser nel medio infrarosso a una frequenza di ripetizione adeguata per produrre un rapporto segnale/rumore sufficiente per gli ioni selezionati nello spettro di massa entro il tempo di permanenza in ciascun pixel. Per eseguire un esperimento di imaging laterale pigro, accendere la sorgente di elettrospruzzo.

Assicurarsi che ci sia una soluzione sufficiente per il tempo pieno necessario per l'imaging. Ora inizia contemporaneamente l'acquisizione degli spettri di massa, l'ablazione laser nel medio infrarosso e la scansione della superficie e raccogli i dati. Al termine dell'esecuzione dell'imaging, arrestare la superficie, la scansione del laser a medio infrarosso e l'acquisizione dei dati.

Disabilitare la sorgente laser, spegnere l'alta tensione, spegnere la pompa a siringa e impostare lo spettrometro di massa in modalità stand by. Inoltre, spegnere l'elettronica di raffreddamento palt e chiudere il flusso di gas inerte. Se utilizzato.

Infine, tracciare il segnale di intensità ionica per un valore MZ selezionato rispetto alle coordinate assolute dell'analisi per ottenere immagini molecolari laterali o 3D. Si tratta di immagini rappresentative dell'imaging pigro laterale di una sezione coronale spessa 100 micrometri di un cervello di ratto. La sezione è stata congelata durante l'esperimento e conservata in un ambiente secco di azoto gassoso.

Le regioni anatomiche del cervello mostrano una buona correlazione con l'immagine molecolare ottenuta per due plasmodium con MZ 2 78 0.59. Si tratta di un esperimento di imaging molecolare in 3D che utilizza tessuto fogliare di pianta zebra interrogato nell'ambiente ambientale tra altri metaboliti primari e secondari. ASCE con MZ 2 85 0,076 è stato rilevato a un numero di ioni più elevato nei settori gialli del secondo e del terzo strato dall'alto con una distribuzione omogenea.

Nelle altre, questa distribuzione concordava con il modello della variazione vista nell'immagine ottica. H Dopo il suo sviluppo. La tecnica pigra ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'analisi e della chimica B per studiare la composizione molecolare e l'organizzazione spaziale di tessuti e biofilm con un contenuto d'acqua apprezzabile.

Non dimenticare che lavorare con un laser a medio infrarosso e una fonte di spruzzo elettrica può essere estremamente pericoloso. Seguire sempre i protocolli di sicurezza laser standard e applicare una schermatura adeguata a tutti i collegamenti elettrici durante questa procedura.