Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco
14 agosto 2010
Questo protocollo comporta un non radioattivo In situ procedura che consente l'identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.
Ciao, sono un ricercatore postdottorato presso il laboratorio di AL all'Università di Rochester. Vi mostreremo il processo di ibridazione con digestione in sezioni cerebrali congelate fresche per rilevare simultaneamente due trascritti di MRN con risoluzione a singola cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle neuroscienze, come ad esempio quelle relative all'organizzazione anatomica, funzionale, molecolare e neurochimica di un circuito cerebrale.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla coagulazione genica nei neuroni del cervello AV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i roditori, nonché a diverse tipologie di tessuti neurali. Per iniziare questa procedura, idratare una quantità adeguata di polvere SDX G 50 con RNAs mediante acqua.
Mescolare brevemente la soluzione e conservarla a temperatura ambiente per due a cinque minuti. Questo passaggio separa le perle SDX dal destrosio presente nella polvere di sedex commerciale dopo la precipitazione con Sedex G 50. Rimuovere il sennet e ripetere il processo da tre a cinque volte; dopo il lavaggio finale, ri-sospendere la soluzione di SX G 50 in tampone TE in un rapporto di uno a uno tra volume di tampone e volume di perle, e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso.
Successivamente, preparare le colonne. Inserire della ovatta in vetro sterilizzata in una siringa sterile da un millilitro e comprimerla con lo stantuffo per formare uno strato compatto sul fondo. Quindi posizionare la siringa in un tubo falcon da 15 millilitri.
Riempire le colonne con soluzione Sedex G 50 mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per 30 secondi utilizzando una centrifuga Beckman dotata di rotore fisso angolato C 0 6 5 0. Dopo la centrifugazione, lavare ogni colonna applicando 200 microlitri di tampone per il lavaggio delle colonne e centrifugando per due minuti a 1000 giri al minuto.
Come in precedenza. Applicare infine 200 microlitri di buffer bloccante per colonna a ciascuna colonna e centrifugare per due minuti a 1000 giri al minuto. Ripetere questo passaggio da quattro a cinque volte per equilibrare la colonna.
Conservare le colonne preparate a quattro gradi Celsius fino a quando la sonda RIBA non viene etichettata e pronta per la purificazione per la doppia ibridazione fluorescente in C due ibridazione o procedura D FISH mostrata qui; vengono preparate due sonde RNA, una etichettata con digossigenina o DIG e l'altra con biotina. Iniziare l'etichettatura delle sonde preparando le soluzioni di etichettatura ribo sonda e incubando le reazioni di etichettatura in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione di due ore, aggiungere un microlitro di TRNA a 20 microgrammi per microlitro e 39 microlitri di tampone bloccante per colonna a ciascuna reazione di etichettatura.
Quindi preparare le colonne EDEX G 50 per la purificazione della sonda aggiungendo 50 microlitri di buffer bloccante in ciascuna colonna e centrifugando per tre minuti a 2000 giri al minuto. Ripetere questo passaggio da due a tre volte per equilibrare le colonne. Quando le colonne sono pronte, posizionare un nuovo tubo EEND orph alla base della colonna.
Applicare la soluzione della sonda sulla colonna Sedex G 50 e centrifugare per tre minuti a 2000 giri al minuto. Per ottenere i 50 microlitri purificati di soluzione della sonda Ribo, valutare la qualità e il rendimento della sonda ribosomiale etichettata e purificata. Prima di procedere all'ibridazione utilizzando un criostato, raccogliere due o tre sezioni cerebrali su vetrini charge super frost plus.
Lo spessore della sezione deve essere compreso tra 10 e 12 micron. I vetrini possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Incubare le sezioni in una soluzione fredda di paraformaldeide al 3% appena preparata per cinque minuti.
Quindi risciacquare brevemente le sezioni due volte in PBS. Successivamente, disidratare le sezioni mediante una serie standard di alcol al 70%, 95% e 100% per due minuti in ciascuna soluzione. Dopo la disidratazione, incubare le sezioni in una soluzione di acetilazione appena preparata per 10 minuti.
Quindi risciacquare le sezioni tre volte in SSPE 2x e disidratare nuovamente le sezioni dopo l'acetilazione mediante la serie standard di alcol come appena illustrato. Ora iniziare l'ibridazione con la sonda ribo. Applicare un volume adeguato della soluzione di ibridazione sul tessuto, coprire i vetrini con coprioggetti e posizionare i vetrini in un portavetrini metallico.
Immergere il portavetrini in un bagno di olio minerale impostato a 65 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, rimuovere con attenzione il portavetrini dal bagno di olio minerale e risciacquarlo brevemente in cloroformio per eliminare l'eccesso di olio dai vetrini.
Posizionare i vetrini in una soluzione SSPE 2x per cinque-dieci minuti al fine di rimuovere il coprioggetto. Dopo aver rimosso il coprioggetto, trasferire i vetrini in una nuova soluzione SSPE 2x e mantenerli per un'ora a temperatura ambiente. All'inizio di questo passaggio di incubazione, preriscaldare la soluzione SSPE 2x più 50% formammide alla stessa temperatura utilizzata per l'ibridazione. Procedere al termine dell'incubazione di un'ora.
Trasferire i vetrini nella soluzione SSPE due volte pre-riscaldata e incubare per 1,5 ore. All'inizio di questo passaggio di incubazione, preriscaldare una soluzione di SSPE 0,1 volte alla stessa temperatura utilizzata nel passaggio di ibridazione. Completare i lavaggi post-ibridazione trasferendo i vetrini nella soluzione SSPE 0,1 volte PREWARM e incubare per 30 minuti.
Ripetere questo lavaggio una volta. Le sezioni cerebrali sono ora pronte per la rilevazione e la visualizzazione delle sonde ribo ibridate: aggiungere 0,3% di perossido di idrogeno al tampone TNT e incubare i vetrini in questa soluzione per 10 minuti. Successivamente, lavare i vetrini nel tampone TNT tre volte per 10 minuti ciascuna utilizzando una penna decon.
Disegnare un pozzetto intorno all'area contenente le sezioni cerebrali. Applicare 150 microlitri di tampone TNB su ogni vetrino e incubare le sezioni in questa soluzione per 30 minuti. Assicurarsi che le sezioni non si secchino durante questo passaggio.
Successivamente, applicare 150 microlitri di soluzione TT NB contenente l'anticorpo anti-DIG coniugato con perossidasi e conservare i vetrini in una camera umida per due ore. Al termine dell'incubazione di due ore, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti. Applicare ogni volta 150 microlitri di soluzione lavorativa di T IDE coniugata con Alexa 594 su ciascun vetrino e conservare i vetrini in una camera umida per un'ora.
Trascorso un'ora, lavare le sezioni nel buffer TNT tre volte per 10 minuti ciascuna. Incubare ogni volta le sezioni in una soluzione di perossido di idrogeno al 0,3% in buffer TNT per 10-30 minuti. Il tempo di incubazione nella soluzione di perossido di idrogeno dipende dall'abbondanza di mRNA e deve essere ottimizzato prima del D fish.
Quindi lavare le sezioni in tampone TNT tre volte, per 10 minuti ogni volta. Applicare 150 microlitri di tampone TMB per ogni vetrino e mantenere i vetrini in una camera umida per 30 minuti. Rimuovere l'eccesso di soluzione TMB inclinando i vetrini.
Aggiungere 150 microlitri di soluzione TMB contenente anticorpo secondario coniugato con perossidasi e conservare le preparazioni in una camera umida per due ore. Successivamente, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti. Ogni volta, applicare 150 microlitri di soluzione working di acaro coniugato con Alexa 488 alle preparazioni e incubare le sezioni per un'ora.
Quindi lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti ogni volta. Ora che entrambi i sonde ribosomiali sono marcati con anticorpi, incubare le sezioni in 150 microlitri di soluzione ospite per due minuti. Successivamente, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per cinque minuti ogni volta, aggiungere un mezzo di montaggio compatibile con la fluorescenza, come Vector Shield o Prolonged Antifa, alle sezioni, coprire con un coprioggetto e osservare al microscopio a fluorescenza.
Queste microfotografie rappresentative provengono da un esperimento su pesce D con sezioni cerebrali di fringuello zebra, in particolare dalla regione NCM, l'analogo nei passeriformi della corteccia uditiva dei mammiferi. Le sezioni cerebrali sono state ibridate con due sonde: una sonda ribo marcativa con biotina diretta contro la parvalbumina, un marcatore per una sottopopolazione di neuroni inibitori, e una sonda ribo marcata con DIG diretta contro il gene dipendente dall'attività zinc, un marcatore affidabile per i neuroni attivati dal canto. Una sovrapposizione delle due immagini mostra una popolazione cellulare di neuroni inibitori attivati dall'esperienza uditiva.
Le frecce indicano cellule marcate esclusivamente con la sonda ribo per par. Le frecce dell'albumina indicano cellule marcate esclusivamente con la sonda RIBA per il neutrone rappresentativo dello zinco. Le cellule Coex che esprimono entrambi i trascritti di interesse sono contrassegnate con un asterisco. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il banco di lavoro pulito e di utilizzare soluzioni, materie plastiche e vetreria prive di contaminazioni.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare contemporaneamente due specie di MA, con risoluzione a singola cellula in sezioni cerebrali appena congelate, per studiare la co-regolazione genica nel cervello del ratto. Grazie per aver guardato il video. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo prevede una procedura di ibridazione in situ non radioattiva che consente l'identificazione simultanea di due specie di trascritti, con risoluzione a singola cellula, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande relative all'organizzazione anatomica, funzionale, molecolare e neurochimica dei circuiti cerebrali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi dell'espressione genica
- Tecniche di ibridazione in situ
Sfondo
- Questo metodo consente la rilevazione di più trascritti in un singolo esperimento.
- Può essere applicato a diversi tessuti neurali, inclusi quelli provenienti da roditori.
- Comprendere l'espressione genica nei neuroni è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- La tecnica fornisce informazioni sull'organizzazione molecolare dei circuiti cerebrali.
Scopo dello studio
- Rilevare contemporaneamente due trascritti di mRNA in sezioni cerebrali.
- Studiare la regolazione genica in popolazioni neuronali specifiche.
- Migliorare la comprensione dell'organizzazione funzionale del cervello.
Metodi Utilizzati
- Procedura di ibridazione in situ non radioattiva.
- Preparazione di sezioni cerebrali fresche congelate.
- Digestione ibrida simultanea dei trascritti.
- Visualizzazione dei trascritti a risoluzione cellulare singola.
Risultati principali
- Identificazione riuscita di due specie di trascritti in sezioni cerebrali.
- Dimostrata l'applicabilità del metodo a diversi tessuti neurali.
- Fornite informazioni sui modelli di espressione genica nei neuroni.
- Contribuito alla comprensione della base molecolare della funzione cerebrale.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per lo studio dell'espressione genica nel cervello.
- Può essere utilizzato in diversi contesti di ricerca all'interno delle neuroscienze.
- Questo metodo migliora la capacità di indagare circuiti neurali complessi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo dFISH consente la rilevazione simultanea di due trascritti di mRNA con risoluzione monocellulare in sezioni cerebrali fresche congelate, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi attraverso la rivelazione di modelli di co-regolazione genica in popolazioni neuronali definite. L'approccio fornisce un'elevata affidabilità predittiva per saggi successivi, stabilendo relazioni spaziali e funzionali tra trascritti nei circuiti sensoriali, orientando strategie di screening basate su ipotesi. La sua adattabilità attraverso specie vertebrate e tessuti non neurali migliora la continuità traslazionale e il riutilizzo della piattaforma nei flussi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche visualizzando la co-espressione di geni marcatore (ad esempio, parvalbumina e zinco) in neuroni inibitori attivati dall'esperienza sensoriale.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante l'osservazione diretta delle relazioni spaziali tra trascritti in tessuti freschi congelati, riducendo la dipendenza da inferenze indirette.
- Valore strategico: Supporta la selezione del portafoglio fornendo dati a risoluzione singola-cellula sull'espressione genica neurochimica e dipendente dall'attività in circuiti rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi confermando la specificità della sonda e l'efficienza di ibridazione in sezioni cerebrali.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso passaggi ottimizzati di marcatura, purificazione e ibridazione delle sonde, utilizzando colonne Sedex G 50 e condizioni controllate di tampone.
- Valore strategico: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma dimostrandone l'applicabilità in topi, ratti, uccelli canori e prevedendone l'estensione ad altre specie di vertebrati e a tessuti non neurali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza delle malattie esplorando l'organizzazione anatomica e le proprietà neurochimiche nei circuiti sensoriali centrali, collegando la co-regolazione genica agli esiti funzionali.
- Valore operativo: Descrive la continuità dal momento della scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo un'analisi longitudinale dell'impatto dell'esperienza sensoriale sull'espressione genica nello stesso tipo di tessuto.
- Valore strategico: Si concentra sul valore predittivo di riduzione del rischio fornendo approfondimenti meccanicistici su come gli stimoli sensoriali alterino i programmi trascrizionali in sottotipi neuronali definiti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery all'identificazione del composto leader, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei bersagli neurobiologici prima dello screening dei composti.
- Biologia della Scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi rilevando trascritti co-regolati (ad esempio, lo zinco dipendente dall'attività e il marcatore dei neuroni inibitori parvalbumina) in risposta all'esperienza sensoriale.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso passaggi riproducibili di purificazione e ibridazione delle sonde, che producono letture fluorescenti quantitative con risoluzione a singola cellula.
- Analisi: Evidenzia misurazioni come l'intensità del segnale fluorescente e i modelli di co-localizzazione (ad esempio, cellule co-esprimenti contrassegnate con asterisco) che permettono il confronto tra condizioni in diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica dimostrandone l'applicabilità in sezioni cerebrali fresche congelate provenienti da diverse specie, sostenendo la validazione interspecie dell'interazione con il bersaglio.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie alla sua adattabilità a diversi tessuti neurali e non neurali e al flusso di lavoro standardizzato di purificazione delle sonde basato su colonne.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici e riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi di co-regolazione genica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità grazie alla purificazione delle sonde su colonna e a tamponi di ibridazione/lavaggio definiti.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, confermando precocemente i modelli di co-espressione dell'obiettivo durante la fase di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati trascrittomici con risoluzione spaziale in circuiti cerebrali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in istologia molecolare, marcatura delle sonde e microscopia a fluorescenza.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi criostato, centrifuga, bagno a olio minerale e microscopio a fluorescenza con set di filtri appropriati.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per la preparazione delle sonde, le condizioni di ibridazione e le soglie di rilevamento del segnale.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, inclusi aggiustamenti per spessore del tessuto, permeabilizzazione e tempo di ibridazione in base alla specie e all'abbondanza della sequenza bersaglio.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura: il tempo di incubazione con perossido di idrogeno deve essere testato empiricamente prima della DISH in base all'abbondanza di mRNA per evitare un rilevamento eccessivo o insufficiente.
