Name: Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Scopri la doppia ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare due trascritti mRNA simultaneamente in sezioni di cervello fresco con risoluzione a singola cellula. Questo metodo aiuta a studiare l'organizzazione molecolare e neurochimica dei circuiti cerebrali.

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Lavoro sostenuto dalle concessioni di NIH / dell&#39;NIDCD e la Fondazione Schmitt a RP.

Questo protocollo è stato sviluppato e raffinato basato sullo standard radioattivi e non radioattivi in situ metodi di ibridazione, in precedenza sviluppato da noi e gli altri di individuare uno o due specie di trascrizione nel tessuto cerebrale 1-7. Il protocollo descritto di seguito ha una lunghezza totale di 2 o 3 giorni, a seconda del numero di interruzioni procedurale scelto dall'utente finale. Tutti i passaggi dettagliati di seguito sono essere condotte a temperatura ambiente, con l'eccezione della fase di ibridazione riboprobe e post-ibridazione lavaggi. Le soluzioni e buffer richiesto per tutti i passi necessari per questo metodo si possono trovare alla fine di questo protocollo. 1. Preparazione dei tessuti e di sezionamento <ol><li> Decapitare ed estrarre il cervello del soggetto rapidamente, e mettetelo in uno stampo di plastica di dimensioni adeguate. </li><li> Coprire con tessuto cerebrale-Tek mezzo di inclusione e rapidamente posto lo stampo di plastica in un bagno dry-ice/alcohol per il congelamento rapido. Tessuti congelati possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. </li><li> Utilizzando un criostato, raccogliere 2 o 3 sezioni di cervello per vetrino sul Superfrost carica Plus. diapositive. Spessore delle sezioni dovrebbe essere 10-12 micron. Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. </li></ol> 2. Preparazione di Sephadex G50 colonne per purificazione della sonda "Colonne Sephadex possono essere acquistati da fonti commerciali, però, mettiamo a disposizione di sotto di una alternativa a basso costo per la generazione di colonne, che sarà necessario per la purificazione della sonda. <ol><li> Idrato quantità adeguata di Sephadex G50 polvere con RNase-free, DEPC trattati con acqua (per esempio, 2 g di polvere in 100 ml di DEPC trattati con acqua), soluzione brevemente mescolare e conservare a temperatura ambiente per far precipitare l'eccesso Sephadex G50. </li><li> Rimuovere il surnatante (strato superiore di acqua) a seguito Sephadex G50 precipitazioni. </li><li> Ripetere la procedura sopra 3 - 5 volte. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la soluzione G50 Sephadex in TE buffer (rapporto 1:1), e conservare a 4 ° C fino all'uso. </li><li> Luogo in autoclave lana di vetro in una sterile siringa da 1 ml e comprimerlo con lo stantuffo di fare uno strato compatto sul fondo, quindi posizionare la siringa in una provetta da 15 ml Falcon. </li><li> Mescolare bene la soluzione di Sephadex G50 a TE. Riempire la siringa / colonna con questa soluzione. </li><li> Centrifugare la colonna per 30 sec a 1000 giri. </li><li> Ripetere questa procedura fino a quando la colonna è quasi completamente riempito di Sephadex G50 perline. </li><li> Applicare 200 l di tampone colonna di lavaggio alla colonna e centrifugare per 2 min a 1000 rpm. Gettare flow-through. </li><li> Applicare 200 l di tampone colonna blocco alla colonna e centrifugare per 2 min a 1000 rpm. Ripetere questo passo 4-5 volte per equilibrare colonna. Le colonne possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo se sigillati con parafilm. </li></ol> 3. L'etichettatura e la Purificazione di Riboprobes Di seguito dettaglio la generazione e la purificazione di un singolo riboprobe. Per dFISH, la preparazione di ciascuna sonda coinvolgerà la stessa metodologia, salvo che una delle due sonde sarà marcato con digossigenina (DIG)-tagged UTP, mentre l'altro con biotina-tagged UTP. <ol><li> Preparare un concentrato (&gt; 150 ng / mL) e purificate soluzione linearizzata cDNA di interesse sia per generare senso (controllo) o riboprobes antisenso. </li><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, aggiungere 0,5-1 mg di cDNA purificato modello, 2 ml di tampone 5X etichettatura sonda, 1 l di DIG 10X (o biotina)-etichettatura mix, 0,5 l di RNasin e 1 microlitri della polimerasi RNA appropriato , e portare il volume finale della soluzione a 10 microlitri con RNasi-free (DEPC-trattati) l'acqua. </li><li> Incubare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 1 ml di tRNA (magazzino; 20 mg / mL), e 39 ml di buffer di colonna di blocco per la soluzione. </li><li> Preparare il Sephadex G50 colonna per la purificazione della sonda. A tal fine, aggiungere 50 microlitri di buffer di blocco per la colonna e girare per 10 secondi a 1000 giri. Ripetere questa operazione 2-3 volte per equilibrare la colonna (cioè, il pieno 50 microlitri applicata alla colonna vengono recuperati dopo il ciclo di centrifugazione). </li><li> Applicare la soluzione della sonda alla colonna Sephadex G50, la posizione di una provetta per microcentrifuga nuovo sul fondo della colonna, e girare per 3 min a 1000 rpm per ottenere il purificata 50 ml di soluzione riboprobe. </li><li> Valutare la qualità e la resa di riboprobe etichettati utilizzando uno standard di formaldeide-agarosio RNA gel o uno spettrofotometro. </li></ol> 4. Post-fissazione, acetilazione e ibridazione <ol><li> Rimuovere sezioni dal freezer ° -80 C e permettere una temperatura ambiente per equilibrare. Successivamente, incubare sezioni di un freddo, appena reso soluzione paraformaldeide al 3% per 5 min. </li><li> Brevemente risciacquare sezioni in phosphate soluzione salina tamponata (PBS) due volte. </li><li> Disidratare sezioni attraverso una serie standard di alcool (70, 95, e 100%, 2 minuti ciascuna), e lasciarli asciugare all'aria. </li><li> Incubare le sezioni in una soluzione acetilazione per 10 minuti. </li><li> Sciacquare le sezioni 3 volte in 2X SSPE. </li><li> Disidratare sezioni ancora una volta attraverso la serie di alcol standard descritto in precedenza, e permettere loro di asciugare all'aria. </li><li> Preparare un adeguato volume di soluzione di ibridazione e aggiungere entrambi riboprobes alla soluzione (concentrazione di sonde: 1 ng / mL per ogni sonda). Volume totale della soluzione di ibridazione è determinato in base al numero di sezioni da ibridato (16 ml di soluzione di ibridazione per sezione). </li><li> Applicare un adeguato volume della soluzione di ibridazione alle diapositive tessuti e coprioggetto assicurando che nessun sovrapposizione bolle d'aria il tessuto. </li><li> Posizionare i vetrini in un portavetrini metallo. Titolare immergere in un bagno di olio minerale fissata a 65 ° C durante la notte. Assicurarsi che coprioggetto sono rivolto verso l'alto (cioè, l'aspetto laterale del supporto per diapositive devono essere a contatto con il fondo del contenitore olio minerale). </li></ol> 5. Post-ibridazione lava <ol><li> Il giorno seguente, rimuovere con attenzione il supporto diapositive dal bagno d'olio minerale e brevemente sciacquarlo in cloroformio per rimuovere l'olio in eccesso dal diapositive. </li><li> Posizionare i vetrini in una soluzione di 2X SSPE per 5-10 min. Coprioggetto dovrebbe staccarsi da diapositive, mentre in soluzione. </li><li> Trasferire i vetrini in una nuova soluzione 2X SSPE, e tenerli per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le sezioni in una soluzione contenente 2X SSPE più 50% formammide. La temperatura di questa soluzione dovrebbe corrispondere alla temperatura utilizzata nella procedura di ibridazione durante la notte. Tenere diapositive in questa soluzione per 1,5 ore. </li><li> Trasferimento sezioni per una soluzione di 0,1 X. SSPE preriscaldata alla stessa temperatura della fase di ibridazione. Incubare sezioni in questa soluzione per 30 min. Ripetere questo passaggio per altri 30 min. </li></ol> 6. Rilevazione e visualizzazione di Riboprobes <ol><li> Trasferimento diapositive a tampone TNT a cui perossido di idrogeno 0,3% è stato aggiunto, per 10 minuti. </li><li> Lavare le sezioni in TNT tampone, 3 volte (10 min ciascuna). </li><li> Utilizzando una penna DAKO, disegnare un bene intorno l'area che contiene le sezioni del cervello. Soprattutto, si deve usare cautela per garantire che le sezioni non si asciugano. </li><li> Applicare 150 ml di tampone TNB di ogni diapositiva, e incubare sezioni in questa soluzione per 30 minuti, in una camera umida. </li><li> Rimuovere la soluzione in eccesso TNB da diapositive inclinazione. </li><li> Applicare 150 ml di soluzione contenente TNB perossidasi-coniugato anticorpo anti-DIG, e conservare i vetrini in camera umida per 2 ore. Concentrazione anticorpale deve essere determinata individualmente per ogni trascrizione di interesse prima di effettuare dFISH. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min. </li><li> Applicare 150 ml di Alexa 594-coniugato soluzione tyramide lavorando per ogni diapositiva, e memorizzarli in una camera umida per 1 ora. Questa soluzione deve essere preparata secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min. </li><li> Sezioni incubare nel buffer TNT a cui perossido di idrogeno 0,3% è stata aggiunta per 10 - 30 min. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min. </li><li> Applicare 150 ml di tampone TNB per vetrino, e tenerli in camera umida per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione in eccesso TNB da diapositive inclinazione. </li><li> Aggiungere 150 ml di soluzione contenente TNB perossidasi-coniugato anticorpi anti-biotina, e conservare i vetrini in camera umida per 2 ore. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min. </li><li> Applicare 150 ml di uno Alexa 488-coniugato soluzione tyramide al lavoro per le diapositive e le sezioni incubare per 1 ora. Questa soluzione deve essere preparata secondo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min. </li><li> Aggiungere 150 ml di soluzione Hoechst (1:1000 in TNT buffer) per le sezioni e tenerli in camera umida per 2 minuti. </li><li> Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, 5 minuti ciascuno. </li><li> Sezioni coprioggetto con una fluorescenza compatibile mezzo di montaggio (ad esempio, Vectashield o prolungare Antifade). </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mostriamo qui i risultati ottenuti dFISH rappresentante nel cervello diamante mandarino. Vengono mostrati microfotografie ottenuti dal caudomedial nidopallium (NCM), l'analogo songbird della corteccia uditiva dei mammiferi. Sezioni di cervello sono stati ibridati con un riboprobe biotinilato diretta contro parvalbumina (A), un marker per una sub-popolazione di neuroni inibitori, e una DIG marcato ribosonde dirette contro l'attività del gene-dipendente Zenk (B), un marker affidabile per la canzone-driven neuroni. C) Sovrapposizione di (A) e (B) mostra una popolazione di neuroni inibitori che sono attivati ​​attraverso l'esperienza uditiva. Frecce e frecce indicano le cellule etichettate esclusivamente con ciascuno dei due riboprobes, e asterischi mostrano neuroni rappresentante co-esprimono entrambi trascrizioni di interesse. Barra di scala = 25 micron.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
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<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo usato questo protocollo per studiare come il cervello dei vertebrati è neurochemically e funzionalmente organizzato, e per determinare come comportamentale rilevante per l&#39;impatto sensoriale stimoli il meccanismo genomico dei neuroni nel cervello adulto 8-10. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma prevediamo che questo protocollo sarà facilmente adattabile alle sezioni del cervello ottenute da una serie di specie di vertebrati e, for...

Soluzioni <ol><li> Colonna del buffer di lavaggio: 10 mM Tris-HCl 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 mg / tRNA microlitri, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-acqua trattata. </li><li> Colonna tampone di bloccaggio: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-acqua trattata. </li><li> TNT buffer: 60 ml di 1 M Tris-HCl, 18 ml di NaCl 5 M e 1,8 ml di Triton X-100 in 600 ml di DEPC trattati con acqua. </li><li> TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 mg / microlitri BSA, 0,15 M di NaCl e il 3% Triton X-100 in DEPC trattati con acqua. </li><li> TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Acetilazione soluzione: 2,7 ml di trietanolammina più 0,5 ml di anidride acetica in 200 ml di DEPC trattati con acqua. </li><li> Ibridazione soluzione: il 50% formammide, 2X SSPE, 2 mg / tRNA microlitri, 1 mg / BSA microlitri e 1 mg / mL poli A in acqua DEPC-trattata. Ha bisogno di 16 l per sezione. </li></ol>

doppia fluorescenza in situ</emibridazione> nelle sezioni cervello fresco

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Qui si descrive una versione modificata di una fluorescenza doppio<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (dFISH) metodo ottimizzato per il rilevamento di due mRNA di interesse fresco sezioni cervello congelato. Il nostro gruppo ha utilizzato con successo questo approccio per lo studio genetico di co-regolamentazione. Più in particolare, abbiamo utilizzato questo metodo dFISH per esplorare l&#39;organizzazione anatomica, le proprietà neurochimiche, e l&#39;impatto dell&#39;esperienza sensoriale nel centro di circuiti sensoriali, a risoluzione singola cellula. Questo protocollo è stato convalidato nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma dovrebbe essere facilmente adattabile alle altre specie di vertebrati, come pure una serie di non-tessuti neurali. In questo film ci fornisce una dimostrazione dettagliata delle tappe principali di questa procedura.

Questo protocollo comporta un non radioattivo<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; procedura che consente l&#39;identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

In questo lavoro descriviamo una versione modificata di un metodo di ibridazione in situ a doppia fluorescenza (dFISH), ottimizzato per il rilevamento di due mRNA di interesse in campioni freschi di...

Ciao, sono un ricercatore postdottorato presso il laboratorio di AL all'Università di Rochester. Vi mostreremo il processo di ibridazione con digestione in sezioni cerebrali congelate fresche per rilevare simultaneamente due trascritti di MRN con risoluzione a singola cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle neuroscienze, come ad esempio quelle relative all'organizzazione anatomica, funzionale, molecolare e neurochimica di un circuito cerebrale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla coagulazione genica nei neuroni del cervello AV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i roditori, nonché a diverse tipologie di tessuti neurali. Per iniziare questa procedura, idratare una quantità adeguata di polvere SDX G 50 con RNAs mediante acqua.Mescolare brevemente la soluzione e conservarla a temperatura ambiente per due a cinque minuti. Questo passaggio separa le perle SDX dal destrosio presente nella polvere di sedex commerciale dopo la precipitazione con Sedex G 50. Rimuovere il sennet e ripetere il processo da tre a cinque volte; dopo il lavaggio finale, ri-sospendere la soluzione di SX G 50 in tampone TE in un rapporto di uno a uno tra volume di tampone e volume di perle, e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso.Successivamente, preparare le colonne. Inserire della ovatta in vetro sterilizzata in una siringa sterile da un millilitro e comprimerla con lo stantuffo per formare uno strato compatto sul fondo. Quindi posizionare la siringa in un tubo falcon da 15 millilitri.Riempire le colonne con soluzione Sedex G 50 mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per 30 secondi utilizzando una centrifuga Beckman dotata di rotore fisso angolato C 0 6 5 0. Dopo la centrifugazione, lavare ogni colonna applicando 200 microlitri di tampone per il lavaggio delle colonne e centrifugando per due minuti a 1000 giri al minuto.Come in precedenza. Applicare infine 200 microlitri di buffer bloccante per colonna a ciascuna colonna e centrifugare per due minuti a 1000 giri al minuto. Ripetere questo passaggio da quattro a cinque volte per equilibrare la colonna.Conservare le colonne preparate a quattro gradi Celsius fino a quando la sonda RIBA non viene etichettata e pronta per la purificazione per la doppia ibridazione fluorescente in C due ibridazione o procedura D FISH mostrata qui; vengono preparate due sonde RNA, una etichettata con digossigenina o DIG e l'altra con biotina. Iniziare l'etichettatura delle sonde preparando le soluzioni di etichettatura ribo sonda e incubando le reazioni di etichettatura in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione di due ore, aggiungere un microlitro di TRNA a 20 microgrammi per microlitro e 39 microlitri di tampone bloccante per colonna a ciascuna reazione di etichettatura.Quindi preparare le colonne EDEX G 50 per la purificazione della sonda aggiungendo 50 microlitri di buffer bloccante in ciascuna colonna e centrifugando per tre minuti a 2000 giri al minuto. Ripetere questo passaggio da due a tre volte per equilibrare le colonne. Quando le colonne sono pronte, posizionare un nuovo tubo EEND orph alla base della colonna.Applicare la soluzione della sonda sulla colonna Sedex G 50 e centrifugare per tre minuti a 2000 giri al minuto. Per ottenere i 50 microlitri purificati di soluzione della sonda Ribo, valutare la qualità e il rendimento della sonda ribosomiale etichettata e purificata. Prima di procedere all'ibridazione utilizzando un criostato, raccogliere due o tre sezioni cerebrali su vetrini charge super frost plus.Lo spessore della sezione deve essere compreso tra 10 e 12 micron. I vetrini possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Incubare le sezioni in una soluzione fredda di paraformaldeide al 3% appena preparata per cinque minuti.Quindi risciacquare brevemente le sezioni due volte in PBS. Successivamente, disidratare le sezioni mediante una serie standard di alcol al 70%, 95% e 100% per due minuti in ciascuna soluzione. Dopo la disidratazione, incubare le sezioni in una soluzione di acetilazione appena preparata per 10 minuti.Quindi risciacquare le sezioni tre volte in SSPE 2x e disidratare nuovamente le sezioni dopo l'acetilazione mediante la serie standard di alcol come appena illustrato. Ora iniziare l'ibridazione con la sonda ribo. Applicare un volume adeguato della soluzione di ibridazione sul tessuto, coprire i vetrini con coprioggetti e posizionare i vetrini in un portavetrini metallico.Immergere il portavetrini in un bagno di olio minerale impostato a 65 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, rimuovere con attenzione il portavetrini dal bagno di olio minerale e risciacquarlo brevemente in cloroformio per eliminare l'eccesso di olio dai vetrini.Posizionare i vetrini in una soluzione SSPE 2x per cinque-dieci minuti al fine di rimuovere il coprioggetto. Dopo aver rimosso il coprioggetto, trasferire i vetrini in una nuova soluzione SSPE 2x e mantenerli per un'ora a temperatura ambiente. All'inizio di questo passaggio di incubazione, preriscaldare la soluzione SSPE 2x più 50% formammide alla stessa temperatura utilizzata per l'ibridazione. Procedere al termine dell'incubazione di un'ora.Trasferire i vetrini nella soluzione SSPE due volte pre-riscaldata e incubare per 1,5 ore. All'inizio di questo passaggio di incubazione, preriscaldare una soluzione di SSPE 0,1 volte alla stessa temperatura utilizzata nel passaggio di ibridazione. Completare i lavaggi post-ibridazione trasferendo i vetrini nella soluzione SSPE 0,1 volte PREWARM e incubare per 30 minuti.Ripetere questo lavaggio una volta. Le sezioni cerebrali sono ora pronte per la rilevazione e la visualizzazione delle sonde ribo ibridate: aggiungere 0,3% di perossido di idrogeno al tampone TNT e incubare i vetrini in questa soluzione per 10 minuti. Successivamente, lavare i vetrini nel tampone TNT tre volte per 10 minuti ciascuna utilizzando una penna decon. Disegnare un pozzetto intorno all'area contenente le sezioni cerebrali. Applicare 150 microlitri di tampone TNB su ogni vetrino e incubare le sezioni in questa soluzione per 30 minuti. Assicurarsi che le sezioni non si secchino durante questo passaggio.Successivamente, applicare 150 microlitri di soluzione TT NB contenente l'anticorpo anti-DIG coniugato con perossidasi e conservare i vetrini in una camera umida per due ore. Al termine dell'incubazione di due ore, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti. Applicare ogni volta 150 microlitri di soluzione lavorativa di T IDE coniugata con Alexa 594 su ciascun vetrino e conservare i vetrini in una camera umida per un'ora.Trascorso un'ora, lavare le sezioni nel buffer TNT tre volte per 10 minuti ciascuna. Incubare ogni volta le sezioni in una soluzione di perossido di idrogeno al 0,3% in buffer TNT per 10-30 minuti. Il tempo di incubazione nella soluzione di perossido di idrogeno dipende dall'abbondanza di mRNA e deve essere ottimizzato prima del D fish.Quindi lavare le sezioni in tampone TNT tre volte, per 10 minuti ogni volta. Applicare 150 microlitri di tampone TMB per ogni vetrino e mantenere i vetrini in una camera umida per 30 minuti. Rimuovere l'eccesso di soluzione TMB inclinando i vetrini.Aggiungere 150 microlitri di soluzione TMB contenente anticorpo secondario coniugato con perossidasi e conservare le preparazioni in una camera umida per due ore. Successivamente, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti. Ogni volta, applicare 150 microlitri di soluzione working di acaro coniugato con Alexa 488 alle preparazioni e incubare le sezioni per un'ora.Quindi lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per 10 minuti ogni volta. Ora che entrambi i sonde ribosomiali sono marcati con anticorpi, incubare le sezioni in 150 microlitri di soluzione ospite per due minuti. Successivamente, lavare le sezioni in tampone TNT tre volte per cinque minuti ogni volta, aggiungere un mezzo di montaggio compatibile con la fluorescenza, come Vector Shield o Prolonged Antifa, alle sezioni, coprire con un coprioggetto e osservare al microscopio a fluorescenza.Queste microfotografie rappresentative provengono da un esperimento su pesce D con sezioni cerebrali di fringuello zebra, in particolare dalla regione NCM, l'analogo nei passeriformi della corteccia uditiva dei mammiferi. Le sezioni cerebrali sono state ibridate con due sonde: una sonda ribo marcativa con biotina diretta contro la parvalbumina, un marcatore per una sottopopolazione di neuroni inibitori, e una sonda ribo marcata con DIG diretta contro il gene dipendente dall'attività zinc, un marcatore affidabile per i neuroni attivati dal canto. Una sovrapposizione delle due immagini mostra una popolazione cellulare di neuroni inibitori attivati dall'esperienza uditiva.Le frecce indicano cellule marcate esclusivamente con la sonda ribo per par. Le frecce dell'albumina indicano cellule marcate esclusivamente con la sonda RIBA per il neutrone rappresentativo dello zinco. Le cellule Coex che esprimono entrambi i trascritti di interesse sono contrassegnate con un asterisco. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il banco di lavoro pulito e di utilizzare soluzioni, materie plastiche e vetreria prive di contaminazioni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare contemporaneamente due specie di MA, con risoluzione a singola cellula in sezioni cerebrali appena congelate, per studiare la co-regolazione genica nel cervello del ratto. Grazie per aver guardato il video. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

Fonte: Baleriola, J., et. al., Rilevamento di mRNA localizzati assonalmente in sezioni cerebrali utilizzando l'ibridazione in situ ad alta risoluzione.  J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra il rilevamento dell'mRNA all'interno degli assoni colinergici in fette fisse di ippocampo di topo utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ e la colorazione degli anticorpi. La microscopia a fluorescenza rivela la localizzazione spaziale degli mRNA marcati con sonda e della colina acetiltransferasi...

Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un'ampia varietà di applicazioni biologiche.

Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Questo studio presenta un protocollo semplificato per l'elaborazione dei tessuti che coinvolge la decapitazione, la fissazione, la criosezione, la colorazione a fluorescenza, l'immunocolorazione e l'imaging, che può essere esteso all'imaging confocale e multifotonico. Il metodo mantiene un'efficacia paragonabile alle dissezioni complesse, bypassando la necessità di capacità motorie avanzate. L'analisi quantitativa delle immagini offre un ampio potenziale di indagine.

Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Scopri la doppia ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare due trascritti mRNA simultaneamente in sezioni di cervello fresco con risoluzione a singola cellula. Questo metodo aiuta a studiare l'organizzazione molecolare e neurochimica dei circuiti cerebrali.

Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco

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