Name: Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per lesame di danno neuronale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Impara a generare colture di fette ippocampali organotipiche per studiare il danno neuronale. Questo metodo consente di quantificare la morte cellulare nelle regioni CA1, CA3 e dentata con ioduro di propidio.

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1. Preparazione Prima di iniziare, montare gli strumenti chirurgici necessari, dissezione e terreni di coltura, e 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo. Il protocollo è lo stesso per il mouse e preparati ratto. (I) Materiali e attrezzature <ul><li> Forbici operativo (dritto lunghezza 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissezione forbici, (lunghezza 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Acciaio al carbonio Dumont Pinzetta (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Modificato vetro "trasferimento" pipette (in fondo alla pipetta Pasteur rimosso e levigato bordo) </li><li> Aclar pellicola di plastica tagliata a 2 "in x 2" nelle piazze (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Copertura spugne 4 in da 3 a (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 millimetri inserti membrana Millicell (0,4 micron; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain chopper tessuto a doppio taglio con lama di rasoio (chopper tessuto McIlwain, Società Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscopio invertito con telecamera CCD e software di analisi dell'immagine </li></ul> (Ii) Medio Dissection (DM; 1 litro a pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Sale bilanciata di Hank </td><td> 1 flacone (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mm) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glucosio (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) di media cultura (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Hank Salt Balance (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Siero di cavallo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES tampone (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Aggiungere 12,8 g di glucosio a Salt Balance 500 ml di Hank prima di fare un terreno di coltura </td></tr></tbody></table> (Iv) gli animali 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo postnatale, in genere una cucciolata per esperimento. 2. In occasione della Giornata della Cultura <ol><li> Tutti gli strumenti di dissezione e film Aclar devono essere immersi nel 70% ETOH per 30 minuti prima dell'inizio. La superficie del cofano dissezione, lama, e chopper di tessuto devono essere disinfettate con etanolo. </li><li> Preparare diversi (3-4) 6 pozzetti coltura tissutale; aggiungere 1 ml terreno di coltura per bene, e inserire una membrana permeabile Millipore in ciascun pozzetto. Posto a 6 pozzetti nel 37 ° incubatore fino al momento di trasferire fette. </li><li> Preparare diversi (4-6) 60 mm con piastre di DM e posto sul ghiaccio. </li><li> Rapidamente decapitare con le forbici e tuffo nel 70% ETOH, e rapidamente esporre il cervello con un incisione sagittale del cranio. Rimuovere con cura il cervello e il posto immediatamente a freddo DM. Separato in due emisferi e porre ogni lato mediale emisfero in giù su una spugna copertina per 2-3 secondi. </li><li> Sollevare delicatamente e luogo nell'emisfero sulla piazza pellicola Aclar e luogo l'elicottero del tessuto; tagliare il cervello coronale in 350 sezioni micron. Al termine, dolcemente prendere la piazza Alcar con l'emisfero sezionato e immergere in acqua fredda DM. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, separare le sezioni dell'ippocampo. Per ratto, ci dovrebbe essere 5 sezioni di ippocampo spanning rostrale caudale, e per il mouse ci dovrebbe essere sezioni 3-4. </li><li> Estrarre il 6-pozzetti con inserti membrana dal 37 ° tessuto cultura incubatore. Trasferimento fettine di ippocampo individualmente sulle membrane permeabili con la pipetta di trasferimento di vetro. Se troppo DM viene rilasciato sulla membrana, DM rimuovere l'eccesso con una pipetta Pasteur. Luogo cinque fettine di ippocampo su ogni membrana. Lasciare almeno 3 pozzi per condizione o 15 fette. </li><li> Incubare le piastre di coltura a 37 ° in un incubatore CO 5% umidificata per 12-14 giorni prima di iniziare l'esperimento tossicità. Il terreno di coltura può essere cambiato due volte la settimana. </li></ol> 3. Indurre e Quantificare ippocampale danno neuronale nella cultura Slice <ol><li> Dopo 12-14 giorni di cultura, aggiungere 5 mg / ml di ioduro di propidio (PI) per terreni di coltura. Questo passo permetterà la visualizzazione e la quantificazione della morte delle cellule basali. </li><li> Il giorno seguente, quantificare PIfluorescenza nella subregione CA1 (e / o CA3 dentato o se lo si desidera) di ogni fetta e dell'ippocampo significa ottenere le misure PI fluorescenza rappresenta la morte delle cellule basali (indicato come tempo = 0 ore, o T 0). Per l'acquisizione delle immagini e quantificazione, si usa il software OpenLab (improvvisazione, Regno Unito), ma l'acquisizione di immagini e altri software di analisi può essere utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza. </li><li> Immediatamente dopo l'acquisizione di immagini del T 0 PI fluorescenza, indurre danno neuronale dal metodo di scelta (abbiamo utilizzato 10 micron NMDA, deprivazione di ossigeno e glucosio, o LPS per un'ora per indurre tossicità neuronale 2,5). Dopo lo stimolo tossico, sostituire media con terreno fresco contenente 5 mg / ml PI e mantenere fette di notte. </li><li> Il giorno 3, significa quantificare PI fluorescenza della condizione sperimentale in 24 ore, o T 24. </li><li> Dopo questa acquisizione delle immagini, cambiare immediatamente medio e aggiungete 10 micron NMDA e 5 mg / ml PI e fette incubare una notte per raggiungere la massima morte neuronale. </li><li> Il giorno 4, significa quantificare fluorescenza PI massima di morte neuronale, definita come T max. Calcolare la morte delle cellule per cento come segue: (T 24 - T 0) / (T max T-0). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Linea Tempo per la generazione di dell'ippocampo e successive lesioni sperimentali e di acquisizione delle immagini. (B) immagini Rappresentante di fettine di ippocampo basale (T 0), 24 ore dopo una esposizione 1 ora per mM NMDA 10 (T 24), e dopo ulteriori 24 ore o 10 mM NMDA di ottenere la massima lesione neuronale (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono due punti importanti da seguire per garantire risultati riproducibili e coerenti quando si replica esperimenti. In primo luogo, è importante lasciare che l&#39;età dell&#39;ippocampo fette per 12-14 giorni prima della sperimentazione. Con isolamento fetta, vi è una significativa risposta della microglia, e microglia rimangono attivi per un certo tempo, con un ritorno ad uno stato di riposo ramificata che si verificano di giorno 10 in vitro 3,6. In secondo luogo, intensità media PI fluorescenz...

il organotipica ippocampale cultura modello slice per l&#39;esame di danno neuronale

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotipica cultura fetta ippocampo è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale, in cui l&#39;architettura di base e la composizione dell &#39;ippocampo è relativamente preservata 1. Il sistema di coltura organotipica consente l&#39;esame degli effetti neuronali, astrociti e microglia, ma come preparazione ex vivo, non affronta gli effetti del flusso sanguigno, o reclutamento di cellule infiammatorie periferiche. A tal fine, questo metodo cultura viene spesso utilizzato per esaminare lesioni eccitotossico e ipossia ai neuroni piramidali dell&#39;ippocampo, ma è stato utilizzato anche per esaminare la risposta infiammatoria. Qui si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta dell&#39;ippocampo dal cervello di roditori dopo la nascita, l&#39;amministrazione stimoli tossici per indurre danno neuronale, e il saggio e la morte dei neuroni dell&#39;ippocampo quantificare.

Il organoptypic dell&#39;ippocampo modello cultura fetta è un<em&gt; In vitro</emModello&gt; utilizzato per esaminare danno neuronale in una varietà di paradigmi. In questo articolo, si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta e quantificare danno neuronale.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

La coltura di sezioni ippocampali organotipiche è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale in cui l'architettura e la composizione di base di...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture organotipiche di fette ippocampali che possono essere utilizzate per modellare il danno neuronale in risposta a una varietà di stimoli, tra cui NMDA, eccitotossicità, deprivazione di ossigeno e glucosio, o stimoli infiammatori come il lipopolisaccaride o il peptide amiloide beta. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il cervello postnatale e sezionando ogni emisfero per generare fette coronali. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare le regioni ippocampali e coltivarle su inserti di membrana in piastre a sei pozzetti. Dopo la coltura delle sezioni, queste vengono colorate con ioduro di propidio e viene calcolato il livello di morte neuronale spontanea.Infine, le sezioni vengono trattate con un agente neurotossico e ristainate per misurare la risposta tossica al trattamento. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la percentuale di morte neuronale nelle regioni CA1, CA3 e del giro dentato dell'ippocampo attraverso le diverse condizioni sperimentali, mediante quantificazione della fluorescenza del propidio ioduro tramite microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura primaria di neuroni, è che il meccanismo di danno neuronale viene esaminato in una preparazione in cui l'architettura di base dell'ippocampo è relativamente intatta.E il terzo tipo include l'esercizio. Le microglia e ROY vengono preservate prima di iniziare la dissezione. Inserire una membrana permeabile Millipore in ciascuna.Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura in ciascun pozzetto di diverse piastre per colture cellulari a sei pozzetti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius.Immergere brevemente la testa decapitata di un ratto di sette giorni in etanolo al 70% per disinfettarla. Utilizzare forbici da microdissezione per praticare un'incisione sagittale attraverso il cranio ed esporre il cervello. Rimuovere rapidamente il cervello con una pinzetta e trasferirlo in una piastra da 60 millimetri contenente mezzo di dissezione posta sul ghiaccio.Utilizzare una pinzetta per separare il cervello in due emisferi. Posizionare ciascun emisfero con il lato mediale verso il basso su una spugna asciutta per due o tre secondi, al fine di assorbire qualsiasi eccesso di umidità. Trasferire il cervello su un quadratino di pellicola trasparente e posizionarlo sulla piattaforma di un taglia tessuti, effettuando sezioni coronali di 350 micron a partire dal rostrale.E continuare delicatamente. Sollevare con cura il quadrato di A clar e immergere le sezioni in una nuova piastra contenente mezzo di dissezione ghiacciato. Al microscopio stereoscopico, identificare l'ippocampo, una struttura a forma di C che si trova al di sotto della corteccia cerebrale e adiacente al corpo striato.Utilizzare una pinzetta per isolare l'ippocampo da ciascuna sezione coronale. Utilizzare una pipetta di Pasteur modificata come descritto nel testo per trasferire cinque sezioni ippocampali su ciascuna membrana. Inserire nelle piastre a sei pozzetti preparate e riscaldate.Rimuovere qualsiasi eccesso di mezzo dalla superficie della membrana. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 12-14 giorni. Dopo 12-14 giorni di coltura, cambiare il mezzo come descritto nel testo allegato, sostituire il mezzo e aggiungere cinque microgrammi per millilitro per pum di ioduro di propidio, abbreviato pi, per consentire la visualizzazione e la quantificazione della morte cellulare basale.Incubare le sezioni durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica sotto un microscopio a fluorescenza invertito collegato a una telecamera CCD. Acquisire immagini della sezione a un ingrandimento di 40x in questo momento. Registrare la fluorescenza di PI corrispondente ai livelli basali di morte cellulare al tempo pari a zero ore o T zero immediatamente dopo l'acquisizione. Le sezioni vengono sottoposte a danno neuronale con il metodo preferito per l'esperimento in corso.Qui le fette vengono incubate con del mezzo fresco contenente 10 micromolar di NMDA per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo il trattamento neurotossico, sostituire il mezzo con del mezzo di coltura fresco contenente cinque microgrammi per millilitro di pi.Incubare le sezioni durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica immagine della fluorescenza del PI dopo il trattamento neurotossico. Le misurazioni medie della fluorescenza per questo punto temporale rappresentano i livelli di morte cellulare. Dopo 24 ore di lesione sperimentale, o T 24 ore, sostituire immediatamente il mezzo con un mezzo di coltura fresco contenente 10 micromolari di NMDA e cinque microgrammi per millilitro.Incubare le sezioni durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per ottenere la massima morte neuronale. Acquisire il set finale di immagini della fluorescenza del PI, effettuando le misurazioni della fluorescenza media per questo punto temporale. Tale valore rappresenta i livelli massimi di morte cellulare, ovvero Tmax.Quantificare la fluorescenza del PI nella regione di interesse utilizzando un software di analisi delle immagini, come descritto nel testo allegato. Questa è un'immagine rappresentativa della colorazione con PI della morte neuronale basale nella regione CA1 dell'ippocampo. Di seguito è mostrata un'immagine rappresentativa della morte neuronale colorata con PI.24 ore dopo un trattamento di un'ora con NMDA 10 micromolare, si osserva una colorazione più intensa, indicativa di un maggiore grado di morte cellulare. Questa immagine mostra la colorazione massimale con ioduro di propidio (PI) dopo un'incubazione notturna con NMDA 10 micromolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare fette organotipiche dell'ippocampo e di come misurare il livello di danno neuronale.

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Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.

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Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

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Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

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