Name: Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per lesame di danno neuronale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Impara a generare colture di fette ippocampali organotipiche per studiare il danno neuronale. Questo metodo consente di quantificare la morte cellulare nelle regioni CA1, CA3 e dentata con ioduro di propidio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finanziato dal NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Preparazione Prima di iniziare, montare gli strumenti chirurgici necessari, dissezione e terreni di coltura, e 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo. Il protocollo è lo stesso per il mouse e preparati ratto. (I) Materiali e attrezzature <ul><li> Forbici operativo (dritto lunghezza 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissezione forbici, (lunghezza 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Acciaio al carbonio Dumont Pinzetta (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Modificato vetro "trasferimento" pipette (in fondo alla pipetta Pasteur rimosso e levigato bordo) </li><li> Aclar pellicola di plastica tagliata a 2 "in x 2" nelle piazze (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Copertura spugne 4 in da 3 a (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 millimetri inserti membrana Millicell (0,4 micron; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain chopper tessuto a doppio taglio con lama di rasoio (chopper tessuto McIlwain, Società Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscopio invertito con telecamera CCD e software di analisi dell'immagine </li></ul> (Ii) Medio Dissection (DM; 1 litro a pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Sale bilanciata di Hank </td><td> 1 flacone (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mm) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glucosio (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) di media cultura (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Hank Salt Balance (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Siero di cavallo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES tampone (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Aggiungere 12,8 g di glucosio a Salt Balance 500 ml di Hank prima di fare un terreno di coltura </td></tr></tbody></table> (Iv) gli animali 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo postnatale, in genere una cucciolata per esperimento. 2. In occasione della Giornata della Cultura <ol><li> Tutti gli strumenti di dissezione e film Aclar devono essere immersi nel 70% ETOH per 30 minuti prima dell'inizio. La superficie del cofano dissezione, lama, e chopper di tessuto devono essere disinfettate con etanolo. </li><li> Preparare diversi (3-4) 6 pozzetti coltura tissutale; aggiungere 1 ml terreno di coltura per bene, e inserire una membrana permeabile Millipore in ciascun pozzetto. Posto a 6 pozzetti nel 37 ° incubatore fino al momento di trasferire fette. </li><li> Preparare diversi (4-6) 60 mm con piastre di DM e posto sul ghiaccio. </li><li> Rapidamente decapitare con le forbici e tuffo nel 70% ETOH, e rapidamente esporre il cervello con un incisione sagittale del cranio. Rimuovere con cura il cervello e il posto immediatamente a freddo DM. Separato in due emisferi e porre ogni lato mediale emisfero in giù su una spugna copertina per 2-3 secondi. </li><li> Sollevare delicatamente e luogo nell'emisfero sulla piazza pellicola Aclar e luogo l'elicottero del tessuto; tagliare il cervello coronale in 350 sezioni micron. Al termine, dolcemente prendere la piazza Alcar con l'emisfero sezionato e immergere in acqua fredda DM. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, separare le sezioni dell'ippocampo. Per ratto, ci dovrebbe essere 5 sezioni di ippocampo spanning rostrale caudale, e per il mouse ci dovrebbe essere sezioni 3-4. </li><li> Estrarre il 6-pozzetti con inserti membrana dal 37 ° tessuto cultura incubatore. Trasferimento fettine di ippocampo individualmente sulle membrane permeabili con la pipetta di trasferimento di vetro. Se troppo DM viene rilasciato sulla membrana, DM rimuovere l'eccesso con una pipetta Pasteur. Luogo cinque fettine di ippocampo su ogni membrana. Lasciare almeno 3 pozzi per condizione o 15 fette. </li><li> Incubare le piastre di coltura a 37 ° in un incubatore CO 5% umidificata per 12-14 giorni prima di iniziare l'esperimento tossicità. Il terreno di coltura può essere cambiato due volte la settimana. </li></ol> 3. Indurre e Quantificare ippocampale danno neuronale nella cultura Slice <ol><li> Dopo 12-14 giorni di cultura, aggiungere 5 mg / ml di ioduro di propidio (PI) per terreni di coltura. Questo passo permetterà la visualizzazione e la quantificazione della morte delle cellule basali. </li><li> Il giorno seguente, quantificare PIfluorescenza nella subregione CA1 (e / o CA3 dentato o se lo si desidera) di ogni fetta e dell'ippocampo significa ottenere le misure PI fluorescenza rappresenta la morte delle cellule basali (indicato come tempo = 0 ore, o T 0). Per l'acquisizione delle immagini e quantificazione, si usa il software OpenLab (improvvisazione, Regno Unito), ma l'acquisizione di immagini e altri software di analisi può essere utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza. </li><li> Immediatamente dopo l'acquisizione di immagini del T 0 PI fluorescenza, indurre danno neuronale dal metodo di scelta (abbiamo utilizzato 10 micron NMDA, deprivazione di ossigeno e glucosio, o LPS per un'ora per indurre tossicità neuronale 2,5). Dopo lo stimolo tossico, sostituire media con terreno fresco contenente 5 mg / ml PI e mantenere fette di notte. </li><li> Il giorno 3, significa quantificare PI fluorescenza della condizione sperimentale in 24 ore, o T 24. </li><li> Dopo questa acquisizione delle immagini, cambiare immediatamente medio e aggiungete 10 micron NMDA e 5 mg / ml PI e fette incubare una notte per raggiungere la massima morte neuronale. </li><li> Il giorno 4, significa quantificare fluorescenza PI massima di morte neuronale, definita come T max. Calcolare la morte delle cellule per cento come segue: (T 24 - T 0) / (T max T-0). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Linea Tempo per la generazione di dell'ippocampo e successive lesioni sperimentali e di acquisizione delle immagini. (B) immagini Rappresentante di fettine di ippocampo basale (T 0), 24 ore dopo una esposizione 1 ora per mM NMDA 10 (T 24), e dopo ulteriori 24 ore o 10 mM NMDA di ottenere la massima lesione neuronale (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono due punti importanti da seguire per garantire risultati riproducibili e coerenti quando si replica esperimenti. In primo luogo, è importante lasciare che l&#39;età dell&#39;ippocampo fette per 12-14 giorni prima della sperimentazione. Con isolamento fetta, vi è una significativa risposta della microglia, e microglia rimangono attivi per un certo tempo, con un ritorno ad uno stato di riposo ramificata che si verificano di giorno 10 in vitro 3,6. In secondo luogo, intensità media PI fluorescenz...

il organotipica ippocampale cultura modello slice per l&#39;esame di danno neuronale

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotipica cultura fetta ippocampo è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale, in cui l&#39;architettura di base e la composizione dell &#39;ippocampo è relativamente preservata 1. Il sistema di coltura organotipica consente l&#39;esame degli effetti neuronali, astrociti e microglia, ma come preparazione ex vivo, non affronta gli effetti del flusso sanguigno, o reclutamento di cellule infiammatorie periferiche. A tal fine, questo metodo cultura viene spesso utilizzato per esaminare lesioni eccitotossico e ipossia ai neuroni piramidali dell&#39;ippocampo, ma è stato utilizzato anche per esaminare la risposta infiammatoria. Qui si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta dell&#39;ippocampo dal cervello di roditori dopo la nascita, l&#39;amministrazione stimoli tossici per indurre danno neuronale, e il saggio e la morte dei neuroni dell&#39;ippocampo quantificare.

Il organoptypic dell&#39;ippocampo modello cultura fetta è un<em&gt; In vitro</emModello&gt; utilizzato per esaminare danno neuronale in una varietà di paradigmi. In questo articolo, si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta e quantificare danno neuronale.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

La coltura di sezioni ippocampali organotipiche è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale in cui l'architettura e la composizione di base di...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture organotipiche di fette ippocampali che possono essere utilizzate per modellare il danno neuronale in risposta a una varietà di stimoli, tra cui NMDA, eccitotossicità, deprivazione di ossigeno e glucosio, o stimoli infiammatori come il lipopolisaccaride o il peptide amiloide beta. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il cervello postnatale e sezionando ogni emisfero per generare fette coronali. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare le regioni ippocampali e coltivarle su inserti di membrana in piastre a sei pozzetti. Dopo la coltura delle sezioni, queste vengono colorate con ioduro di propidio e viene calcolato il livello di morte neuronale spontanea.Infine, le sezioni vengono trattate con un agente neurotossico e ristainate per misurare la risposta tossica al trattamento. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la percentuale di morte neuronale nelle regioni CA1, CA3 e del giro dentato dell'ippocampo attraverso le diverse condizioni sperimentali, mediante quantificazione della fluorescenza del propidio ioduro tramite microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.

Organotipica Culture Slice ippocampale

Questo video mostra un metodo per preparare colture organotipiche di fette di ippocampo dal cervello di un cucciolo di ratto. Delinea le fasi coinvolte nella dissezione dell'ippocampo, nel taglio e nelle condizioni di coltura necessarie per promuovere la vitalità cellulare e la crescita nelle fette dell'ippocampo, generando infine colture di fette organotipiche.

Preparazione di colture organotipiche di fette dall'ippocampo di un cucciolo di ratto

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l'infortunio.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Qui descriviamo la preparazione di fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. Sotto una graduale e controllata privazione del siero, queste fette raffigurano eventi epilettici in evoluzione e possono essere considerate un modello ex vivo di epileptogenesi. Questo sistema rappresenta un ottimo strumento per monitorare la dinamica dell'attività spontanea, nonché per valutare la progressione delle caratteristiche neuroinfiammatorie durante tutto il corso dell'epileptogenesi.

Un modello di epileptogenesi nelle culture delle fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Impara a generare colture di fette ippocampali organotipiche per studiare il danno neuronale. Questo metodo consente di quantificare la morte cellulare nelle regioni CA1, CA3 e dentata con ioduro di propidio.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l'esame di danno neuronale

Esplora altri video