Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l'ingegneria tissutale miocardica
20 dicembre 2010
Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio In vivo Sono descritti.
I gel di matrice prodotti da tessuti pericardici e miocardici descelularizzati conservano componenti native della matrice extracellulare, inclusi diversi proteine, peptidi e glicosaminoglicani. Queste matrici tessutali possono essere utilizzate nell'ingegneria tissutale. In questo video, i gel di matrice sono ottenuti descelularizzando tessuto pericardico per produrre una matrice extracellulare acellulare.
La matrice extracellulare viene quindi processata per creare una versione liquida solubilizzata. Successivamente, la matrice solubilizzata viene testata in un modello animale di piccole dimensioni per determinarne la fattibilità come scaffold iniettabile. L'analisi istologica e immunoistochimica dimostra che in vivo il materiale iniettato forma uno scaffold fibroso poroso che permette l'infiltrazione di cellule vascolari.
Ciao, mi chiamo Sonia Zeki. Sono una studentessa laureata nel laboratorio della dottoressa Karen Chrisman presso l'Università della California di San Diego. Oggi prepareremo una matrice extracellulare solubilizzata a partire da tessuto descelularizzato e illustreremo i test in vivo per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci.
Queste tecniche sono importanti per lo sviluppo di una terapia a base di biomateriali iniettabili per il trattamento dell'insufficienza cardiaca. Dopo l'infarto miocardico, si dimostra la procedura chirurgica eseguita da Pam, riprese di McGuffin, un neurochirurgo veterinario del nostro laboratorio. Cominciamo dunque.
Iniziare questo protocollo decellularizzando il tessuto per lasciare solo la matrice extracellulare o ECM: posizionare per prima cosa il pericardio suino in un becher contenente acqua deionizzata e lavarlo mescolando per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, collocare il tessuto in PBS 1X contenente SDS 1% e penicillina-streptomicina 1%, mescolando continuamente per 24 ore a temperatura ambiente. Il giorno successivo, riposizionare il tessuto in acqua deionizzata e mescolare continuamente per cinque ore, agitando in un tubo da 50 millilitri finché tutte le bolle non scompaiono.
La colorazione con ematina ed eosina dovrebbe rivelare l'assenza di nuclei nel tessuto descellularizzato. Collocare il tessuto descellularizzato rimanente in un tubo conico da 15 a 50 millilitri. Successivamente, posizionare il tessuto nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Liofilizzare i campioni congelati mediante essiccazione a freddo sotto pressione molto bassa e temperatura molto bassa fino a completa asciugatura. A seconda del sistema utilizzato e del contenuto di acqua dei campioni, questo processo può richiedere da 12 a 72 ore. Una volta che il tessuto descellularizzato è completamente secco, trasferirlo in un mulino Wiley Minim.
Utilizzando un setaccio con maglia da 40, macinare il tessuto in una polvere fine. Una volta che la maggior parte del campione è passata attraverso il filtro, rimuovere il barattolo di raccolta. Questo campione viene ora indicato come matrice extracellulare o polvere di ECM.
È possibile eseguire in questo momento un secondo passaggio di liofilizzazione, qualora non si proceda immediatamente al passaggio successivo. Ciò garantisce l'accuratezza del peso registrato per solubilizzare la matrice extracellulare (ECM). Pesare la quantità desiderata di polvere di ECM in un vial sterile.
Aggiungere una soluzione sterile di acido cloridrico filtrata contenente un milligrammo per millilitro. Pepcid al vial da scintillazione con la polvere di ECM in modo che l'ECM raggiunga una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Aggiungere una barretta magnetica e posizionare il vial sulla piastra magnetica.
Mescolare continuamente per 48-60 ore, raschiando periodicamente i lati del vial con un cucchiaio o una spatola sterili WHE. Per garantire la digestione di tutta la polvere di ECM. Mentre l'ECM viene digerito, andrà in soluzione.
Dopo che la matrice extracellulare (ECM) è stata solubilizzata, posizionare il campione sul ghiaccio e regolare il pH a 7,4 utilizzando idrossido di sodio e acido cloridrico. Una volta regolato il pH, aggiungere PBS 10 volte per ottenere una concentrazione finale della soluzione pari a PBS 1 volta. Ad esempio, se si hanno 900 microlitri di soluzione di ECM, dopo la regolazione del pH, si devono aggiungere 100 microlitri di PBS 10 volte.
Determinare la concentrazione della soluzione di MEC solubilizzata sommando i volumi aggiunti per la neutralizzazione e sottraendo i volumi rimossi per il test del pH. Quindi aggiungere PBS 1x per raggiungere la concentrazione finale desiderata qui. Sei milligrammi per millilitro.
Il giorno dell'intervento chirurgico, preparare un'iniezione di 75 microlitri di ECM solubilizzata in una siringa da 0,1 millilitro con ago da 30 gauge. Mantenere l'anestesia in una ratto femmina Harlan Dolly intubato con il 2,5% di fluoruro di isoflurano. Applicare un collirio protettivo agli occhi, quindi verificare l'anestesia eseguendo una compressione del dito del piede.
Somministrare tre millilitri di soluzione di Ringer lattato mediante iniezione sottocutanea nella regione addominale inferiore per l'idratazione. Successivamente, posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio e fissare delicatamente gli arti con del nastro adesivo. Utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere il pelo dall'addome e aspirare i peli liberi.
Eseguire una serie di iniezioni da 50 microlitri di lidocaina al 2% lungo una diagonale che va dal processo xifoidi al lato inferiore destro dell'addome. Quindi eseguire tre passate con Betadine partendo dal centro e muovendosi verso l'esterno. Ripetere la detersione con alcol isopropilico.
Quindi coprire l'animale utilizzando un campo operatorio con una finestra circolare preformata. Fissare con un campo operatorio. Utilizzando un bisturi numero 10.
Eseguire un'incisione lunga da tre a quattro centimetri dal processo xifoideo fino al lato inferiore destro dell'addome. Individuare il processo xifoideo e dissezionare verticalmente in basso attraverso il muscolo verso destra, avendo cura di evitare il grosso vaso situato a destra. Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare lateralmente attraverso il muscolo, esponendo il diaframma.
Si abbia cura di evitare il fegato utilizzando un filo di sutura Vicryl tre zero lungo 36 pollici e una paio di emostatici. Si infilzi un ago attraverso il processo xifoideo e si tiri il filo a metà strada. Si uniscano con del nastro le estremità del filo e si fissino a un punto sopra e dietro l'animale, sollevando il processo xifoideo ed esponendo il diaframma con un altro filo di sutura Vicryl tre zero lungo 36 pollici.
Infilare un ago nel muscolo più vicino al processo xifoidale e, nuovamente, tirare e fissare l'estremità a un altro punto a destra del tavolo operatorio, esponendo completamente la cavità chirurgica. Successivamente, utilizzando una piccola pinzetta microforza a dente di ratto, afferrare il centro del diaframma, tirarlo verso l'esterno ed eseguire un'incisione molto piccola con forbici smussate. Una volta praticato questo foro, i polmoni si ritrarranno.
Eseguire un'incisione verticale di due o tre centimetri attraverso il diaframma per visualizzare il cuore. Inserire quindi un batuffolo lungo tre pollici a sinistra della cavità e spostare i polmoni. Fissare il batuffolo in posizione utilizzando una pinza emostatica.
Utilizzando un altro tampone, spostare il polmone destro per individuare la sacca pericardica. Quindi, con una pinzetta microforza e una pinzetta grande seghettata, lacerare la sacca pericardica, esponendo l'apice del cuore. Afferrare l'apice del cuore con la pinzetta microforza dentata destra e inserire l'ago per iniettare la matrice solubilizzata con il bordo smussato rivolto verso sinistra.
A un terzo della distanza rispetto all'apice, parallelo alla superficie epicardica. Assicurarsi di evitare la vena cardiaca magna. Iniettare il gel di matrice solubilizzato e attendere qualche secondo prima di rimuovere l'ago.
Il tessuto deve diventare bianco nel sito di iniezione; tamponare il sangue nella cavità ed eliminare la pinza emostatica e il tampone che trattengono il polmone destro utilizzando emostatici microcurvi, quindi eseguire un nodo iniziale con un filo di sutura in polipropilene cinque zero lungo 30 pollici. Successivamente, utilizzare pinze microforzute a denti di ratto per chiudere il diaframma con una sutura continua e un ago conico, prima di completare la chiusura. Inserire un tubo di aspirazione PE 160 e chiudere intorno ad esso utilizzando una siringa da 10 millilitri per aspirare la cavità toracica.
Stringendo il punto di sutura, il diaframma deve risultare concavo. Ridurre l'ossido di fluoro al 1%. Rimuovere entrambi i punti di sutura in Vicryl 3-0 che mantengono aperta la cavità. Idratare il muscolo asportando l'eccesso con un tampone o una garza sterile.
Utilizzare un nuovo filo di sutura 3-0 per chiudere il piano muscolare con punti separati. Quindi spegnere l'isoflurano. Pulire la zona e utilizzare punti metallici per chiudere la cute.
Applicare quindi un unguento a base di antibiotico triplo sulla sede dell'incisione. Lasciare che il ratto si riprenda sotto ossigeno al 100%. Quando l'animale inizia a respirare autonomamente attorno al ventilatore, rimuovere il tubo tracheale.
Una volta che l'animale è tornato in piedi, somministrare un'iniezione sottocutanea di 0,05 milligrammi per chilogrammo di analgesico cloridrato di buprenorfina e riportarlo nella gabbia di mantenimento su un asciugamano sterile. Il tessuto cardiaco di ratti iniettati con gel di matrice solubili è stato sezionato e colorato con ematossilina, eosina e EOIN per l'analisi macroscopica del tessuto in diversi punti temporali. Dopo l'intervento chirurgico, in punti temporali precoci, la regione iniettata appare come una rete fibrosa rosa che si è diffusa interstizialmente in punti temporali successivi.
Si osserva un afflusso cellulare dopo due settimane. Si nota la degradazione della matrice iniettata. Se la matrice extracellulare è stata marcata con biotina prima dell'iniezione, può essere visualizzata in modo più diretto mediante colorazione della biotina con streptavidina coniugata a HRP, per osservare la crescita e la formazione di vasi nella regione di iniezione della matrice.
Le diapositive qui sono state colorate contemporaneamente con un coniugato FITC di selectina, che si lega alle cellule endoteliali mostrate in verde, e con un anticorpo anti-actina delle cellule muscolari lisce mostrato in rosso. Le cellule staminali possono inoltre essere identificate nelle vicinanze della regione di iniezione.
Qui sono stati visualizzati mediante una colorazione immunoistochimica per C kit. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare una matrice extracellulare solubilizzata a partire da tessuto descellularizzato e testarla in vivo per applicazioni di ingegneria del tessuto cardiaco. Non dimenticare che, sebbene utilizziamo tessuto pericardico, questa procedura generale può essere modificata per essere utilizzata con qualsiasi fonte di tessuto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta la preparazione di idrogeli iniettabili a partire da tessuti descellularizzati e la loro applicazione nel miocardio di ratto in vivo. Lo studio evidenzia la conservazione di componenti native della matrice extracellulare negli idrogeli, fondamentali per l'ingegneria tissutale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Ricerca cardiovascolare
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- I tessuti descelularizzati conservano componenti essenziali della matrice extracellulare.
- I gel di matrice possono fungere da impalcature per la rigenerazione dei tessuti.
- Comprendere le proprietà di questi gel è fondamentale per la loro applicazione in vivo.
- Studi precedenti hanno dimostrato il potenziale delle matrici acellulari nel promuovere la riparazione dei tessuti.
Scopo dello studio
- Realizzare idrogeli a partire da tessuto pericardico descellularizzato.
- Valutare la fattibilità di questi idrogeli come scaffold iniettabili.
- Valutare il comportamento in vivo del materiale iniettato in un modello animale di piccola taglia.
Metodi Utilizzati
- Decellularizzazione del tessuto pericardico per produrre una matrice extracellulare acellulare.
- Trasformazione della matrice extracellulare in una forma liquida solubilizzata.
- Iniezione della matrice solubilizzata nel miocardio di ratto.
- Analisi istologica e immunoistochimica per valutare le proprietà dello scaffold.
Risultati principali
- Il materiale iniettato ha formato in vivo un impalcatura fibrosa porosa.
- È stata osservata l'infiltrazione di cellule vascolari all'interno dell'impalcatura.
- Il gel della matrice ha mantenuto componenti chiave della matrice extracellulare.
- Lo studio ha dimostrato il potenziale del gel come impalcatura per l'ingegneria tissutale.
Conclusioni
- I gel di matrice derivati da tessuti descelularizzati sono promettenti per applicazioni cardiache.
- Studi in vivo ne supportano l'uso come scaffold iniettabili.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzarne le proprietà per l'uso clinico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo protocollo consente la generazione di scaffold di matrice extracellulare (ECM) iniettabili a partire da tessuti descellularizzati, per l'ingegneria del tessuto miocardico, rispondendo alla necessità di biomateriali che supportino la vascolarizzazione e l'integrazione tissutale post-infarto. Il metodo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per produrre gel di ECM solubilizzati che mantengono il contenuto nativo di proteine e glicosaminoglicani, facilitando la valutazione preclinica delle interazioni tra scaffold e ospite in vivo. Permettendo l'iniezione intramurale e il tracciamento istologico in modelli rodentici, l'approccio supporta la riduzione meccanicistica dei rischi associati a terapie basate su ECM nella fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle risposte dell'ospite mediate dalla matrice extracellulare e dell'infiltrazione vascolare in un microambiente cardiaco fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Fornisce un sistema standardizzato di impalcature derivate da tessuto per test in vivo riproducibili tra diversi gruppi di studio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output istologici quantificabili, come la formazione di reti fibrose e la crescita di vasi, per lo screening comparativo di biomateriali.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante volumi di iniezione definiti, solubilizzazione con pH regolato e marcatura con biotina per il rilevamento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la continuità dalla produzione di ECM acellulare alla persistenza dello scaffold in vivo e al rimodellamento del tessuto ospite.
- Valore operativo: Consente la valutazione longitudinale della degradazione, dell'infiltrazione cellulare e della vascolarizzazione in punti temporali definiti dopo l'iniezione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta fornendo uno scaffale di origine biologica per la validazione in fase iniziale di terapie basate sulla matrice extracellulare, prima dell'ottimizzazione del composto leader e degli studi preclinici sull'efficacia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo agli effetti della composizione della matrice extracellulare sull'infiltrazione cellulare e l'integrazione tissutale.
- Screening: Permette la preparazione riproducibile di gel iniettabili per il confronto diretto tra diverse fonti tissutali o variabili di lavorazione.
- Analisi: Produce risultati istologici e immunoistochimici (ad esempio, colorazione DAB, CD31, α-SMA) per quantificare la formazione di tessuto vascolare e fibroso.
- Ricerca traslazionale: Collega le proprietà del biomateriale a esiti funzionali come la formazione di vasi, favorendo l'allineamento dei biomarcatori traslazionali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro compatibile con piattaforme, adattabile a diverse fonti tissutali (ad esempio, pericardiche, miocardiche), per un'ampia applicazione nella medicina rigenerativa cardiovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva dimostrando il mantenimento dei componenti nativi della matrice extracellulare e la promozione della formazione di reti vascolari in vivo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di descellularizzazione, liofilizzazione, digestione enzimatica e aggiustamento del pH.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze precoci della biocompatibilità dello scaffold e della sua capacità di integrazione tissutale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione, corretta in base al rischio, di candidati basati sulla matrice extracellulare, sulla base della validazione istologica della porosità fibrosa e dell'infiltrazione vascolare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella decellularizzazione dei tessuti, nelle procedure sterili e nelle tecniche chirurgiche su piccoli animali.
- È dipendente da attrezzature per la liofilizzazione, macinatori di precisione per la produzione di polvere e sistemi di digestione con controllo del pH.
- Necessita di infrastrutture standardizzate per istologia e immunohistochemica per una visualizzazione e analisi coerenti dello scaffold.
- L'adattamento a diverse fonti di tessuto richiede la validazione della ritenzione della matrice extracellulare e dell'efficienza di solubilizzazione.
- I limiti pratici includono la variabilità nell'esaurimento della decellularizzazione e possibili differenze tra lotti nel rendimento della matrice extracellulare.
