Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura
6 settembre 2010
In questo protocollo, abbiamo descritto un nuovo metodo per studiare l'influenza delle eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni con un In vitro Di co-cultura di sistema. Rat cellule corticali gliali sono state coltivate a confluenza e cocultured con altamente purificato topo neuroni dei gangli dorsali. Diversi influenza delle cellule gliali sull'adesione neuroni e la crescita degli assoni è stato confrontato direttamente nella stessa cultura. Questo metodo fornisce un nuovo modo di s
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'influenza dell'eterogeneità gliale sulla crescita degli assoni del ganglio della radice dorsale (DRG) e sulla deionizzazione cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto trasformando le cellule gliali dal cortex di ratto neonato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel coltivare e purificare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) di embrione di ratto.
Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere i neuroni del ganglio radicolare purificati sulle cellule glio. L'ultimo passaggio della procedura è osservare la crescita degli assoni nelle cellule nervose ed eseguire la colorazione cellulare e l'analisi di quantificazione. Alla fine, è possibile ottenere i risultati.
Questo studio dimostra che la crescita dei neuroni dei gangli delle radici dorsali è influenzata da cellule gliali eterogenee mediante registrazione con microscopia a tempo-lampo e microscopia a immunofluorescenza. Ciao, sono del laboratorio di neuroimmagini del Dipartimento di Neurologia dell'UCRA. Oggi vi mostreremo un procedimento per studiare l'influenza eterogenea delle cellule G sulla crescita in un nuovo metodo di coltura cellulare.
Nel nostro laboratorio, utilizziamo questo nuovo metodo per studiare l'interazione tra neuroni e cellule ggl. Quindi, eseguiamo lo studio. Per stabilire una coltura co-coltura di cellule gliali e neuroni del ganglio della radice dorsale o DRGs, inizieremo coltivando le cellule gliali sotto una cappa da coltura tissutale. Rivestire i fondi di piastre da coltura pre-sterilizzate da 24 pozzetti con coprioggetti circolari di vetro sterilizzati, ricoprire i coprioggetti nei pozzetti di una piastra da coltura a sei pozzetti con polilisina e incubare per due ore a temperatura ambiente.
Lavare le lamelle e le piastre per colture due volte con acqua distillata e lasciare asciugare all'aria. Successivamente, pipettare 200 microlitri o due millilitri di mezzo di Eagle modificato con dcos o DMEM contenente 10% di siero fetale bovino o FBS in ciascuna piastra da 24 pozzetti o da 6 pozzetti, rispettivamente. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente 5% di anidride carbonica il giorno successivo.
Sterilizzare la cappa a flusso laminare. Accendere la luce UV per 20 minuti, quindi spruzzare tutte le superfici all'interno della cappa con etanolo al 70% e attendere 15 minuti prima dell'uso. Iniziare con le teste di due cuccioli di ratto da P2 a P6 che sono stati anestetizzati mediante ipotermia.
Quindi decapitare alla base del forame magno con forbici chirurgiche. Aprire il cranio lungo la sutura sagittale utilizzando forbici da iridectomia e rimuovere la calotta cranica. Rimuovere il proencefalo e posizionarlo in Leibovitz L-15 freddo ed eseguire la stessa operazione con il secondo cranio.
Quindi, lavorare sotto un microscopio stereoscopico. Rimuovere con attenzione la dura madre, le membrane e i vasi sanguigni che ricoprono il cervello. Isolare la corteccia e lavarla più volte con mezzo L 15.
Utilizzare forbici da microchirurgia per tagliare la corteccia in piccoli pezzi. Quindi incubare un mezzo L 15 contenente tripsina 0,125% in EDTA a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, trasferire i blocchi di tessuto in un tubo da 50 millilitri contenente 20 millilitri di DMEM con FBS al 20%.
Aggiungere DS fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Quindi utilizzare una pipetta di vetro flame-polished per agitare la soluzione tissutale circa 20 volte al fine di separare le cellule. Infine, lavare le cellule una volta con DMEM contenente il 10% di FBS e determinare il numero di cellule mediante emocitometro.
Quindi seminare le cellule a una densità di 5.000-10.000 cellule per centimetro quadrato e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo due volte alla settimana per isolare, purificare e coltivare i gangli della radice dorsale. Preparare innanzitutto delle piastre a 24 pozzetti con coprivetri rivestiti di polilisina, come dimostrato in precedenza.
Aggiungere 100 microlitri di mezzo NVF a ciascun cover slip e incubare le piastre a 37 gradi Celsius il giorno seguente. Sterilizzare l'incubatore a flusso laminare positivo come in precedenza. Procedere quindi con embrioni di ratto da E12 a E15 isolati dall'utero di un ratto gravido eutanizzato con anidride carbonica sotto il microscopio stereoscopico.
Isolare i midolli spinale con i gangli delle radici dorsali collegati e trasferirli in piatti da 35 millimetri contenenti mezzo L-15 freddo. Utilizzando pinzette da microchirurgia, dissezionare con cura i GDRC collegati dai midolli spinali nel mezzo L-15 freddo senza danneggiare i GDRC, recidendo gli assoni collegati.
Di solito vengono isolati da 20 a 30 gangli della radice dorsale da un midollo spinale quando tutti i gangli della radice dorsale sono stati isolati dai midolli spinali. Tutti i gangli della radice dorsale isolati in tripsina 0,125% in EDTA vengono incubati per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; quindi si lavano le cellule una volta con DMEM contenente 20% di siero bovino fetale, si aggiunge DNA e si pipetta diverse volte utilizzando una pipetta di vetro levigata a fiamma per ottenere una sospensione cellulare uniforme, come dimostrato con le cellule gliali. Eseguire un secondo lavaggio nel mezzo MBF, contare le cellule, quindi seminare le cellule su coprivetri preparati in piastre a 24 pozzetti a 5.000 cellule per pozzetto e incubare tutta la notte per purificare i neuroni del ganglio della radice dorsale.
18-24 ore dopo la semina. Sostituire il mezzo con mezzo neurobasale contenente 20 micromolari di cinque fluoro due doxi uridina dopo 72 ore. Sostituire metà del mezzo con mezzo neurobasale privo di FUDR.
Il mezzo viene quindi sostituito ogni due giorni. Circa 20 giorni dopo la semina delle cellule gliali, queste raggiungeranno la confluenza e saranno pronte per essere co-coltivate con i neuroni, 24 ore prima della combinazione dei due tipi cellulari.
Sostituire il mezzo delle cellule gliali con mezzo MBF. Preparare una sospensione monocellulare di DRG purificati come dimostrato in precedenza. Determinare la densità cellulare.
Quindi seminare i neuroni a una densità di 500 cellule per centimetro quadrato sulle cellule gliali. L'assone dei neuroni e la fuoriuscita dei neuriti sulle cellule gliali possono essere analizzati in diversi punti temporali utilizzando software di analisi delle immagini e immunochimica con anticorpi specifici per il tipo cellulare. Di seguito sono riportati esempi di cellule gliali e neuroni del ganglio della radice dorsale coltivati separatamente e in co-coltura: le cellule gliali diventano confluenti dopo 20 giorni.
In coltura. Al microscopio a contrasto di fase, era evidente che diverse sottopopolazioni di cellule gliali formano pattern di crescita e morfologie distinti. E mediante immunocitochimica si è osservato che gli astrociti positivi per GFAP rappresentavano oltre il 90% della coltura.
Utilizzando il nostro metodo di trattamento con FUDR per 72 ore, la purezza dei neuroni dei gangli della radice dorsale raggiungerà valori fino al 99% entro sei giorni e mostrerà le loro morfologie uniche con un'elevata densità di crescita dei neuriti in una coltura co-coltivata di neuroni e cellule gliali. L'attecchimento dei neuroni dei gangli della radice dorsale e la fuoriuscita dei neuriti si verificano facilmente sulle cellule gliali entro quattro ore dal seeding; l'attecchimento neuronale e la crescita dei neuriti sono influenzati da sottopopolazioni di cellule gliali, che formano strutture subordinarie di modelli di crescita speciali facilmente identificabili al microscopio a contrasto di fase. E mediante immunoistochimica vi mostrerò semplicemente come coltivare cellule dei gangli della radice dorsale con cellule chiare per studiare l'influenza dell'eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita neuronale.
Durante questa sessione, è molto importante ricordare di manipolare il tessuto con grande delicatezza e mantenere le cellule nel mezzo. Non esporle mai all'aria, né farle seccare. È tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per studiare l'influenza dell'eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni mediante un sistema di co-coltura *in vitro*. Le cellule gliali corticali di ratto vengono co-coltivate con neuroni purificati dei gangli delle radici dorsali di ratto per confrontare i loro effetti sull'adesione neuronale e sulla crescita degli assoni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Neurobiologia
Sfondo
- Le cellule gliali svolgono un ruolo cruciale nel sistema nervoso.
- L'eterogeneità tra le cellule gliali può influenzare il comportamento neuronale.
- Comprendere queste interazioni è fondamentale per la ricerca neurobiologica.
- I modelli in vitro forniscono un ambiente controllato per lo studio di questi effetti.
Scopo dello studio
- Studiare come diversi tipi di cellule gliali influenzano la crescita degli assoni.
- Valutare l'impatto dell'eterogeneità delle cellule gliali sull'adesione neuronale.
- Sviluppare un sistema di co-coltura affidabile per studi futuri.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule gliali dal cervello di ratti neonati.
- Coltura e purificazione di neuroni dai gangli della radice dorsale di embrioni di ratto.
- Cocultura di neuroni DRG purificati con cellule gliali.
- Osservazione della crescita dell'assone e dell'adesione cellulare mediante colorazione e quantificazione.
Risultati principali
- Sono state osservate differenze nella crescita degli assoni in base al tipo di cellula gliale.
- Le cellule gliali hanno influenzato in modo significativo l'adesione dei neuroni.
- Il sistema di co-coltura si è rivelato efficace per lo studio delle interazioni gliale-neuronali.
- I risultati forniscono informazioni sul ruolo dell'eterogeneità gliale nello sviluppo neuronale.
Conclusioni
- Questo metodo consente lo studio diretto degli effetti delle cellule gliali sui neuroni.
- I risultati migliorano la comprensione delle interazioni tra cellule gliali e neuroni.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo modello per esplorare applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Comprendere l'eterogeneità delle cellule gliali è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione di bersagli neuroterapeutici, poiché sottopopolazioni di astrociti influenzano in modo differenziale la crescita degli assoni e il comportamento neuronale. Questo metodo di co-coltura consente lo screening meccanicistico delle interazioni gliale-neuronali, sostenendo la previsione precoce nelle fasi di scoperta identificando microambienti permissivi o inibitori. L'approccio fornisce un sistema rilevante per le malattie, utile per valutare come la variabilità gliale influisce sul potenziale rigenerativo, informando le decisioni di portafoglio nei programmi di riparazione del sistema nervoso centrale e di neurodegenerazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche confrontando la crescita assonica su sottopopolazioni distinte di astrociti in condizioni identiche.
- Valore operativo: Fornisce un sistema purificato e riproducibile per isolare gli effetti specifici della glia sull'adesione neuronale e sulla fuoriuscita dei neuriti.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio associato ai bersagli rivelando come l'eterogeneità gliale moduli le risposte neuronali, fornendo indicazioni sulla sicurezza meccanicistica nella selezione dei percorsi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera monocapati gliali standardizzati con oltre il 90% di astrociti GFAP+, consentendo un'agevole semina neuronale e un'analisi temporale della crescita assiale.
- Output quantitativo: Permette la colorazione immunoistochimica e la quantificazione basata su immagini della lunghezza e del ramificarsi dei neuriti, supportando schermature dose-risposta o comparative.
- Scalabilità: Compatibile con il formato a piastre a 24 pozzetti, consentendo test paralleli di diverse condizioni gliali per l'ottimizzazione del saggio e la schermatura di reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Pertinenza per le malattie: Modella l'eterogeneità gliale del sistema nervoso centrale osservata in seguito a lesioni e malattie, dove la variabilità degli astrociti influenza il fallimento della rigenerazione.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo una piattaforma umanamente rilevante per lo studio delle interazioni gliali-neuronali utile al test di composti promettenti.
- Progressione con valutazione del rischio: Consente l'identificazione precoce di effetti inibitori mediati dalle cellule gliali, riducendo l'abbandono in fase avanzata dei programmi di neuro-rigenerazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto guida, in cui i dati sulle interazioni gliale-neuronali forniscono informazioni sugli effetti dei composti sulla crescita dell'assone in un sistema rilevante per la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla modulazione mediata dai glia della crescita assonale, chiarificando le risposte neuronali specifiche per via.
- Screening: Fornisce letture quantitative e standardizzate della crescita dei neuriti, consentendo il confronto tra diverse condizioni gliali o candidati terapeutici.
- Analisi: Genera metriche misurabili della crescita assonale e dell'adesione mediante immunofluorescenza e imaging a intervalli di tempo, supportando il confronto statistico tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Modella la variabilità dei glia rilevante per la patologia del sistema nervoso centrale umano, consentendo la valutazione preclinica di bersagli in un microambiente eterogeneo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di co-coltura riutilizzabile applicabile a diversi bersagli del sistema nervoso centrale, tipi di glia e fonti neuronali per programmi di scoperta sostenuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando sottopopolazioni gliali a esiti differenziali della crescita assonale.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la purificazione standardizzata delle cellule gliali, la semina neuronale e tempistiche di coltura definite.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando le condizioni gliali che supportano o inibiscono la rigenerazione, ottimizzando la selezione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi in base alla compatibilità con il microambiente gliale, aumentando l'efficienza del capitale negli investimenti nel sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule neurali e gliali primarie, nella coltura sterile dei tessuti e nella microscopia a immunofluorescenza.
- È dipendente da coprivetrini rivestiti con polilisina, mezzo neurobasale, FUDR e sistemi di imaging a contrasto di fase/fluorescenza.
- Necessita di standardizzazione nella preparazione delle cellule gliali, nella purificazione dei neuroni e nei tempi della coltura mista per garantire riproducibilità tra diversi gruppi di ricerca.
- L'adattamento a cellule gliali o neuroni derivati da iPSC umane potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei protocolli di maturazione e purezza.
- È limitato dalla variabilità del tessuto primario di roditore e dall'assenza di sottogruppi di microglia o oligodendrociti nelle preparazioni gliali corticali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
1:34
Establishing a Glial Cell Culture
4:29
Isolation, Purification, and Cuturing of Dorsal Root Ganglion Neurons (DRGs) and Coculturing of DRGs with Glial Cells
7:29
Representative Cultures of Glial Cells, DRG Neurons, and Cocultures of Both Cell Types
8:36
Conclusion
1:03
Introduction
