Name: Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Scopri come studiare l'eterogeneità delle cellule gliali e il loro impatto sulla crescita assonica utilizzando un sistema di co-coltura in vitro con neuroni DRG di ratto. Questo metodo permette di analizzare le interazioni gliali-neuronali.

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1. Glia colture cellulari Cellule gliali possono essere coltivate provenienti da diverse regioni del sistema nervoso centrale. L'intero processo è mostrato in figura processo. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Processo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Processo 1"> Giorno 1 cultura piastra di rivestimento e coprioggetto <ol><li> Sterilizzati a secco tondo microscopio vetro coprioggetto in autoclave. </li><li> Targhetta del coprioggetto sterilizzati sterilizzato in 24 pozzetti cultura. </li><li> Rivestire il coprioggetto con poli-lisina e incubare per 2 ore a temperatura radice. </li><li> Cappotto da 6 pozzetti cultura allo stesso modo il punto 3. </li><li> Lavare i coprioggetti e 6-bene piastra di coltura per due volte con acqua distillata e aria secca nella cappa della cultura. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di media DMEM (con 10% FBS) in ciascun pozzetto a 24-pozzetti e 2 ml di ogni bene in 6 pozzetti e metterle in incubatrice sotto 37 gradi con il 5% di CO 2 </li></ol> Giorno 2 corteccia di isolamento e coltura di cellule gliali <ol><li> Sterilizzare il positivo cofano dissezione flusso. </li><li> Accendere la luce UV per 20 minuti. </li><li> Spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo e attendere 15 minuti prima dell'uso. </li><li> cambiamento teso: cuccioli di ratto Anestetizzare (P2-P6) per ipotermia, e decapitare alla base della magnum framen con le forbici operativo. </li><li> Aprire il cranio lungo la sutura sagittale con un forbice iride e staccare il cranio. </li><li> Rimuovere il proencefalo e metterle in fresco L15 media, sotto stereomicroscopio, pulire accuratamente la membrana dura e pia con i vasi sanguigni, isolare la corteccia e lavare più volte con L15 media. </li><li> Tagliare la corteccia in piccoli pezzi con forbice microchirurgia. </li><li> Aggiungi 0,125% tripsina-EDTA preparati con L15 medio a pezzi corteccia e incubare a 37 gradi per 15 min. </li><li> Trasferire blocchi di tessuto in 20 mL medium DMEM con 20% FBS in 50mL tubo, aggiungere soluzione madre DNasi per 10ug/mL concentrazione finale, aspirare la soluzione di tessuto su e giù per 20 volte con lucido vetro fuoco Pasteure pipetta, raccogliere la sospensione singole cellule. </li><li> Lavare la sospensione cellulare una volta con DMEM medio, risospendere le cellule in DMEM con 10% FBS, contare le cellule al microscopio le cellule con un emocitometro, seme a 5000-10000/cm 2. Mantenere le cellule in grado incubatore 37 5%, cambiare la metà della media 2 volte alla settimana. </li></ol> 2. Gangli della radice dorsale neuroni isolamento, la cultura e purificazione Giorno 1 Preparare Cultura Materiale <ol><li> Rivestire il coprioggetto sterilizzati con poli-lisina, coprioggetto lavare due volte con distillare l'acqua e l'aria secca, metterle in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Aggiungi 100μL medio Neurobasal con il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / mL), messo piastra in 37 CO grado 5% 2. </li></ol> Giorno 2 Isolare DRG da embrioni <ol><li> Sterilizzato la cappa a flusso nello stesso modo come la cultura delle cellule gliali. </li><li> Euthanize un ratto in gravidanza (E15) per overdose di CO 2, addome sterilizzati con etanolo al 70%, gli embrioni sono stati isolati da utero e messo in fresco L15 media. </li><li> Isolare i cavi collegati spinale con i gangli spinali sotto stereomicroscopio e trasferimento a piatti da 35 mm con refrigerata L15 media. </li><li> Raccogliere sospensione singola cella e lavare una volta con NBF medio (medio Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / ml)). </li></ol> 3 ° giorno Purify neuroni DRG <ol><li> 18h-24h dopo la semina neurone, aggiungere una soluzione concentrata di mm 1 magazzino FUDR alla cultura neurone ad una concentrazione finale di 20 micron e un volume finale di 200 ul. </li><li> 72h dopo, sostituire la metà della media con media Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50ng/mL) senza FUDR. Dopo di che, cambiare il medium a giorni alterni. </li></ol> 3. Co-coltura neuroni DRG con le cellule gliali <ol><li> Quando la cultura di cellule gliali raggiunto confluenza (circa 20 giorni dopo la semina), erano pronti per la co-coltura con i neuroni. </li><li> 24 ore prima di aggiungere i neuroni purificate, le cellule gliali media sono stati modificati e medie Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / ml). </li><li> Neuroni purificati sono stati raccolti dai pozzi cultura, singolo sospensione le cellule sono state ottenute facendo passare meccanico attraverso pipetta Pasteure fuoco lucido. </li><li> Dopo il conteggio del numero, i neuroni sono stati seminati a 500/cm 2 sul confluenti cellule gliali nel medio Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50ng/mL). </li><li> Adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti delle cellule gliali potrebbero essere registrati e analizzati in diversi momenti da un software di analisi delle immagini e immunocitochimica utilizzando anticorpi tipo specifico di cellule. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <ol><li> Coltura delle cellule gliali: Dopo la semina, le cellule gliali diventerà confluenti circa 20 giorni. Sotto microsc contrasto di faseOPE, è stato facilmente identificato che diverse sottopopolazioni morfologica delle cellule gliali formate diverse sottostrutture modello di crescita e la astrociti GFAP positivi rappresentato più del 90%, come indicato dalla tecnica immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2). </li><li> DRG cultura neuroni: Nel nostro metodo, dopo 72 FUDR trattamento ore, la purezza dei neuroni DRG raggiungerà più in alto del 99% entro 6 giorni, i neuroni DRG hanno mostrato la loro morfologia unica e con una crescita dei neuriti alta densità (Figura 3, Figura 4). </li><li> Co-coltura delle cellule gliali e neuroni: i neuroni DRG adesione e crescita dei neuriti verificato facilmente sulle cellule gliali entro 4 ore dopo la semina, attente osservazioni hanno mostrato che l'adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti sono stati influenzati da sottopopolazioni di cellule gliali che formano speciale sottostrutture modello di crescita, questo potrebbe essere facilmente identificati al microscopio a contrasto di fase e mediante immunocitochimica (Figura 5, Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Morfologia delle cellule gliali confluenti. Corticale cellule gliali sono stati placcati in polilisina coprioggetto patinata e in coltura per 20 giorni, notare le differenze nello sviluppo di cellule gliali, le cellule sulla sinistra disposti in modo irradiata. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Confluenti cellule gliali etichettati da proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) anticorpale. Noti la disposizione irradiata di GFAP (rosso), le cellule positive sul lato destro. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Neuroni dei gangli dorsali è cresciuto in vitro senza trattamento FUDR. Le cellule contaminanti formata DRG sfondo neuroni '. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Neuroni dei gangli dorsali è cresciuto in vitro dopo il trattamento FUDR. Le cellule sfondo contaminanti erano stati eliminati completamente. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Neuroni dei gangli dorsali coltivati ​​su cellule gliali. Adesione neuroni e la crescita dei neuriti sono stati inibiti sulle cellule irradiate organizzato e limitato sul lato destro cellule gliali. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Neuroni dei gangli dorsali crescono sulle cellule gliali etichettati da anticorpi neurofilamenti. La neurite (verde) sono stati inibiti sul irradiata celle disposte a sinistra gliali e limitato sul lato destro, tutte le cellule gliali sono stati etichettati da anticorpi GFAP (rosso).

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo esperimento è stato progettato per raggiungere due obiettivi per studiare le cellule gliali, l&#39;influenza di eterogeneità soprattutto astrociti sulla adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti. Il primo obiettivo era quello di mantenere l&#39;eterogeneità astrociti il ​​più possibile, in questo esperimento, la confluenza delle cellule gliali cultura astrociti arricchito è stato mixato cultura primaria senza alcun trattamento chimico e la propagazione digestione, che possono ulteriormente dannegg...

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucosio ad alta concentrazione)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>poli-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>grado per colture cellulari</td></tr><tr><td>NGF (2,5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-neurofilamento</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

studio gliali eterogeneità influenza sulla crescita cellulare axon utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Nel sistema nervoso centrale di tutti i mammiferi, gli assoni interrotto dopo l&#39;infortunio non sono in grado di rigenerare i propri obiettivi di originale e di recupero funzionale è molto povera 1. Il fallimento della rigenerazione assonale è il risultato combinato di diversi fattori tra cui l&#39;ambiente ostile di cellule gliali, inibitori delle molecole legate mielina dei neuroni e una diminuzione intrinseca capacità rigenerativa 2. Astrociti sono il tipo più predominante delle cellule gliali nel sistema nervoso centrale e svolgono un ruolo importante nelle funzioni dell&#39;assone in fisiologia e le condizioni di patologia 3. Contrasto con l&#39;omologo oligodendrociti, gli astrociti sono una popolazione cellulare eterogenea composta da diverse sottopopolazioni astrociti con morfologie diverse e l&#39;espressione genica 4. Il significato funzionale di questa eterogeneità, come ad esempio le loro influenze sulla crescita degli assoni, è in gran parte sconosciuto. Per studiare le cellule gliali, in particolare la funzione di eterogeneità astrociti nel comportamento dei neuroni, abbiamo stabilito un nuovo metodo di co-colture di neuroni alta radice purificata gangli dorsali con le cellule gliali ottenuto dalla corteccia di ratto. Con questa tecnica, siamo stati in grado di confrontare direttamente l&#39;adesione e la crescita degli assoni dei neuroni in diverse sottopopolazioni astrociti nelle stesse condizioni. In questo rapporto, diamo il protocollo dettagliato di questo metodo per l&#39;isolamento astrociti e la cultura, i neuroni dei gangli dorsali isolamento e la purificazione, e la co-coltura di neuroni DRG con astrociti. Questo metodo potrebbe essere esteso anche ad altre regioni del cervello per studiare cellulare o regionali specifici di interazione tra i neuroni e cellule gliali.

In questo protocollo, abbiamo descritto un nuovo metodo per studiare l&#39;influenza delle eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni con un<em&gt; In vitro</em&gt; Di co-cultura di sistema. Rat cellule corticali gliali sono state coltivate a confluenza e cocultured con altamente purificato topo neuroni dei gangli dorsali. Diversi influenza delle cellule gliali sull&#39;adesione neuroni e la crescita degli assoni è stato confrontato direttamente nella stessa cultura. Questo metodo fornisce un nuovo modo di studiare direttamente la eterogeneità delle cellule gliali influenza sulla adesione dei neuroni e la crescita degli assoni.

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Nel sistema nervoso centrale di tutti i mammiferi, gli assoni recisi a seguito di un danno non sono in grado di rigenerarsi verso i loro target originali e il recupero funzionale è...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'influenza dell'eterogeneità gliale sulla crescita degli assoni del ganglio della radice dorsale (DRG) e sulla deionizzazione cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto trasformando le cellule gliali dal cortex di ratto neonato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel coltivare e purificare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) di embrione di ratto.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere i neuroni del ganglio radicolare purificati sulle cellule glio. L'ultimo passaggio della procedura è osservare la crescita degli assoni nelle cellule nervose ed eseguire la colorazione cellulare e l'analisi di quantificazione. Alla fine, è possibile ottenere i risultati.Questo studio dimostra che la crescita dei neuroni dei gangli delle radici dorsali è influenzata da cellule gliali eterogenee mediante registrazione con microscopia a tempo-lampo e microscopia a immunofluorescenza. Ciao, sono del laboratorio di neuroimmagini del Dipartimento di Neurologia dell'UCRA. Oggi vi mostreremo un procedimento per studiare l'influenza eterogenea delle cellule G sulla crescita in un nuovo metodo di coltura cellular

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Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo video illustra un metodo per stabilire una co-coltura indiretta neurone-astrocita utilizzando un approccio compartimentato. In questa configurazione, i neuroni e gli astrociti sono spazialmente separati ma condividono un mezzo condizionato. I fattori neurotrofici rilasciati dagli astrociti promuovono la differenziazione dei neuroni e la formazione di connessioni sinaptiche, suggerendo interazioni neurone-glia.

Una tecnica di co-coltura indiretta neurone-astrocita per lo studio delle interazioni neurone-glia

Questo video mostra il modello di cocoltura di un espiante di ganglio della radice dorsale e cellule di Schwann. In condizioni di cocoltura, l'acido ascorbico promuove la differenziazione delle cellule di Schwann in forme mielinizzanti. Le cellule mielinizzanti di Schwann avvolgono gli assoni più volte per creare una guaina mielinica, essenziale per la funzione nervosa.

Co-coltura di un espiante di ganglio della radice dorsale con cellule di Schwann per la mielinizzazione dei neuroni

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Qui presentiamo un saggio di co-coltura facile da usare per analizzare la migrazione del glioblastoma (GBM) sui neuroni modellati. Abbiamo sviluppato una macro nel software FiJi per una facile quantificazione della migrazione cellulare GBM sui neuroni, e abbiamo osservato che i neuroni modificano la capacità invasiva delle cellule GBM.

Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

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Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

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