Name: Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri la microscopia ESR per mappare la concentrazione di ossigeno tridimensionale a livello di micron nelle cellule viventi. Questo metodo utilizza cianobatteri per studiare la produzione di ossigeno in condizioni di luce e buio.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla concessione nr. 213/09 dalla Science Foundation israeliano, non concede. 2005258 dalla fondazione BSF, non concede. 201665 dal Consiglio europeo della ricerca (CER), e dall &#39;Istituto Russell Berrie Nanotechnology presso il Technion. Riconosciamo l&#39;aiuto del Prof. Noam Adir e Faris Salame Schulich presso la Facoltà di Chimica presso il Technion per la fornitura e la gestione dei cianobatteri. L&#39;aiuto e il supporto di Svetlana Yoffis dalla Micro-Nano Fabrication Unità Technion è molto apprezzato.

1. Panoramica di ESR Micro-imaging In primo luogo, forniamo una breve spiegazione di ESR, microscopia ESR, e le varie componenti del nostro sistema, e quindi verranno descritti gli esperimenti di imaging attuale. Risonanza di spin elettronico è una tecnica spettroscopica in cui viene assorbita la radiazione elettromagnetica ad una specifica frequenza di molecole con spin di elettroni spaiati, vincolate ad un campo magnetico statico esterno (Figura 1). ESR è impiegato in ampie aree della scienza, come la chimica, la biologia, fisica e scienza dei materiali, per la rilevazione e l'identificazione dei radicali liberi e dei centri paramagnetici. Si tratta di un potente metodo per studiare l'ambiente di molecole paramagnetiche in specie dal vivo e fornisce informazioni su acidità (pH), viscosità, ossigeno, e specie reattive dell'ossigeno concentrazioni 3. Per i campioni eterogenei, informazioni spettrali ESR può essere ottenuto in modo risolta spazialmente (cioè, ottenendo un'immagine), attraverso l'uso di gradienti di campo magnetico 4. Questo è molto simile al metodo più comune di risonanza magnetica (MRI) che osserva principalmente gira protone. Fino ad ora, ad esempio tecniche di imaging ESR sono state applicate per gli esemplari vivi di dimensioni relativamente grandi di pochi centimetri e in mm scala risoluzione. (Per esempio vedi figura 2, tratta dal riferimento 5.) Uno sviluppo relativamente recente della VES imaging è l'estensione delle sue capacità di guardare i piccoli animali in millimetri scala risoluzione alle misure di campioni millimetrica e sub-millimetriche dimensioni con micron scala risoluzione. Questo campo è nota come microscopia ESR, che oggi in grado di fornire immagini 3D ESR con una risoluzione avvicina 1 micron 2 (vedi esempi rappresentativi in Figura 3). Un microscopio ESR è essenzialmente simile a uno spettrometro ESR convenzionale. E 'una calamita per la generazione del campo statico, un sistema a microonde per l'eccitazione di spin e la rilevazione del segnale, una sonda per la tenuta del campione, e una console computerizzata di controllare il processo di acquisizione e gestione dei dati. Altri componenti unica l'imaging ESR in generale ed esistenti anche in ESR microcopia sono fonti di gradiente di campo magnetico, che fanno parte del sistema elettronico, e bobine di gradiente che si trovano nella sonda imaging. Maggiori dettagli sul nostro sistema specifico vengono mostrati nel film protocollo e descritti in riferimento 2. 2. ESR micro-imaging Preparazione del campione Questa fase descrive il metodo per la preparazione dei campioni per la micro-imaging esperimento ESR. Al termine di questa fase le cellule sono immessi sul fondo di un contenitore appositamente preparato ESR campione di vetro microscopia insieme ad un radicale tritil 6 soluzione tampone. Questo protocollo descrive la misurazione delle cellule cianobatteri e, quindi, per altri tipi di cellule, aggiustamenti possono essere necessari in fase di preparazione del campione. <ol><li> In primo luogo, alcune piazze di carta assorbente con una dimensione di circa 400 400 micron vengono presi ed inseriti in una provetta Eppendorf che viene successivamente riempita con 1,2 ml di sospensione cianobatteri (ad una concentrazione di 40 mg / mL). </li><li> La sospensione è centrifugata per 2 minuti a 6000 RPM in una microcentrifuga. </li><li> A seguito di questa, il buffer surnatante viene completamente rimosso tranne che per ~ 50 microlitri che sono a sinistra per evitare la disidratazione cianobatteri. Come risultato di questo processo, la carta assorbente è ormai saturo dalle cellule cianobatteri. </li><li> Utilizzando una pinzetta sottile, alcune fibre vengono estratte dalla carta e posto sul fondo di una coppa come porta bicchiere appositamente preparati campione 7. Successivo a quello di 3 mm di tritil in BG-11 soluzione 8, 9 (vedi schema 1) viene aggiunto il supporto del campione con l'aiuto di una siringa sottile. Il titolare viene poi sigillato con colla curabili UV, lasciando una piccola presa d'aria aperta. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Magazzino 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Citrato ferrico di ammonio 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Acido citrico: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> CoCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Namoo 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Preparazione di BG-11 di media. </li></ol> 3. ESR micro-imaging Esperimenti <ol><li> Per iniziare l'esperimento di imaging, attivare la micro-sistema di imaging ESR e inserire il campione nel risonatore che va all'interno della sonda di imaging. </li><li> Ora, usando il software di controllo del computer, impostare il sistema in modalità "Tune" e trovare la frequenza di risonanza a microonde della sonda, che sarà utilizzato per le misurazioni ESR. </li><li> In seguito, impostare il campo magnetico statico sul valore che corrisponde alla frequenza delle microonde applicata, impostare i parametri di temporizzazione per la sequenza di impulsi e osservare il segnale ESR per assicurarsi che il sistema funziona bene e il campione è ben preparato. </li><li> Quindi, impostare i parametri di imaging, come ad esempio il numero di pixel, la forza dei gradienti, e la lunghezza degli impulsi gradiente ai valori richiesti. </li><li> A seguito di setup, raccogliere tre immagini 3D ESR da una sequenza eco Hahn di imaging cardiaco (Figura 4) con la separazione interpulso, i valori di  500, 600 e 700 ns. </li><li> Luce proiettata al campione è acceso o spento a seconda delle condizioni richieste sperimentali. </li><li> Durante l'acquisizione, i dati vengono salvati automaticamente. Tesi file raw dati vengono poi elaborati tramite script software Matlab per fornire immagini della concentrazione tritil radicale e il tempo di rilassamento T 2 mappa, che si traduce in una immagine concentrazione di ossigeno tramite pre-esistente di calibrazione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati I risultati dell'esperimento sono diversi tridimensionale ESR micro-immagini registrate a differenti valori di τ. Tipiche immagini di dati grezzi sono forniti in Figura 5. Le prime tre immagini, misurato in condizioni di oscurità, sono molto simili tranne per la riduzione dell'intensità del segnale. D'altra parte, il modello cambia immagine sotto irradiazione di luce a causa delle differenti tempi di rilassamento in diverse parti del campione. Questi dati possono essere trattati da 1 a ottenere un'immagine di ampiezza, come mostrato in figura 6 e anche le immagini del tempo di rilassamento, T 2 (Figura 7). T 2 immagini sono tradotti in valori concentrazione di ossigeno attraverso un pre-esistente curva di calibrazione che collega la concentrazione di ossigeno per il tempo di rilassamento tramite l'equazione: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> Qui, T 2 0 è la spin-spin tempo di rilassamento della sonda in condizioni anossiche (in funzione della concentrazione della sonda, C, e il suo coefficiente di diffusione, D), e k è una costante di proporzionalità. Nella maggior parte dei casi, il coefficiente di diffusione non varia molto per i campioni dal vivo (anche se, se necessario, può in linea di principio essere direttamente valutati anche da ESR 6, 10), e la concentrazione di spin si ottiene durante il processo di imaging. Pertanto, questa relazione può essere utilizzato per misurare direttamente la concentrazione di ossigeno. Tornando alla figura 6, è evidente dall'immagine ampiezza che le cellule cianobatteri si trovavano principalmente sul lato destro del supporto del campione. Inoltre, sulla base di Figura 7, è chiaro che la luce inizia la produzione di O 2 e provoca un aumento significativo nella soluzione di concentrazione di O 2, principalmente nel voxel vicino al cianobatteri. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: I livelli di energia a risonanza di spin elettronico. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Tipica immagine concentrazione di ossigeno di un mouse cuscinetto tumore. L'immagine a sinistra mostra le informazioni anatomiche, basata su un'immagine di risonanza magnetica. Un organico stabile radicali liberi è stata iniettata per il mouse e le sue caratteristiche ESR fornire la concentrazione di ossigeno al suo ambiente (a destra). ESR a base di risultati si sovrappongono alla risonanza magnetica immagine anatomica. Campo visivo è di 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Due esempi di alta risoluzione su scala micro-ESImmagini R del campione photolithographically generati con N @ C 60 in polvere (a sinistra) e cristalli paramagnetici LIPC (a destra) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Tipico Hahn immagine che mostra la sequenza di impulsi a microonde (MW) e di pendenza, G x, y G e G z impulsi. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Tipico dati grezzi ESR micro-immagini: a, b, c sono i dati grezzi del campione cianobatterio senza illuminazione luce misurata per τ = 500.600.700 ns, rispettivamente. Elementi d, e, e sono le stesse a, b, c, ma con illuminazione luce. L'intensità è tracciata in scala arbitraria (ma è coerente all'interno di ogni serie di tre immagini raw buio o luce di dati) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: immagine di ampiezza corrispondente alla concentrazione dei radicali nella soluzione (scala arbitraria). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: T 2 immagini e il corrispondente [O 2] valori sotto scuro (a sinistra) e leggero (a destra) condizioni.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
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<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo mostra come ESR micro-imaging può essere applicato a mappa della concentrazione di ossigeno vicino vivono piccoli campioni. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L&#39;uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà di facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere. Nel prossimo futuro abbiamo in programma su un ulteriore miglioramento di questa metodologia di fornire immagini di esempio dal vivo con una risoluzione di pochi micron, fornendo i parametri di contrasto come la concentrazione di ossido super, l&#39;acidità (pH), coefficiente di diffusione della sonda e, naturalmente, la concentrazione di ossigeno. Queste funzionalità sono complementari agli attuali ottici basati su metodologie sia in termini di tipo di contrasto e anche delle caratteristiche dei campioni (ad esempio, campioni di spessore non trasparente e, in alcuni casi, le misurazioni intracellulari vs extracellulare).

<table><tbody><tr><td>Centrifuga </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Radicale triarilmetile (tritile) perdeuterato</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Sintetizzato a Novosibirsk utilizzando il metodo descritto nella referenza &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Buffer BG-11</td><td></td><td></td><td>Per le istruzioni di preparazione, vedere lo Schema 1 e le referenze 8, 9.</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Polimerizzazione a ultravioletti</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 o NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

electron spin resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Questo protocollo descrive una risonanza di spin elettronico (ESR) micro-imaging metodo per la mappatura tridimensionale dei livelli di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con risoluzione micron scala 1. L&#39;ossigeno è una delle molecole più importanti nel ciclo della vita. Serve come accettore terminale di elettroni della fosforilazione ossidativa nei mitocondri ed è usato nella produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno. Misure di ossigeno sono importanti per lo studio delle funzioni mitocondriali e metaboliche, vie di segnalazione, gli effetti di vari stimoli, permeabilità della membrana, e la differenziazione della malattia. Il consumo di ossigeno è quindi un marcatore informativo del metabolismo cellulare, che è ampiamente applicabile ai vari sistemi biologici dai mitocondri alle cellule di organismi interi. Per la sua importanza, molti metodi sono stati sviluppati per le misure di ossigeno in sistemi live. Attuali tentativi di fornire immagini ad alta risoluzione di ossigeno si basano principalmente sulla fluorescenza ottica e metodi di fosforescenza che non riescono a fornire risultati soddisfacenti in quanto utilizzano sonde ad alta foto-tossicità e la sensibilità di ossigeno. ESR, che misura il segnale dalle sonde paramagnetiche esogeni nel campione, è nota per fornire misurazioni molto accurate della concentrazione di ossigeno. In un caso tipico, le misure ESR mappa LineShape ampliamento della sonda e / o di rilassamento tempo accorciamento che sono collegati direttamente alla concentrazione di ossigeno locale. (L&#39;ossigeno è paramagnetico, quindi, in caso di collisione con la sonda paramagnetica esogeni, è la sua brevità tempi di rilassamento.) Tradizionalmente, questo tipo di esperimenti siano condotti a bassa risoluzione, scala millimetrica ESR per l&#39;imaging piccoli animali. Qui mostriamo come ESR immagini possono anche essere effettuata nel micron scala per l&#39;esame di piccoli campioni dal vivo. ESR micro-imaging è una metodologia relativamente nuova che consente l&#39;acquisizione di spazialmente risolta segnali ESR con una risoluzione di 1 micron si avvicina a temperatura ambiente 2. L&#39;obiettivo principale di questo protocollo-paper è quello di mostrare come questo nuovo metodo, insieme con nuova concezione sensibili all&#39;ossigeno sonde, può essere applicato alla mappatura dei livelli di ossigeno in piccoli campioni dal vivo. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L&#39;uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà anche facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere.

Questo protocollo descrive un metodo per micron scala imaging tridimensionale della concentrazione di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con la microscopia elettronica risonanza di spin.

Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

Questo protocollo descrive un metodo di micro-imaging a risonanza paramagnetica elettronica (ESR) per la mappatura tridimensionale dei livelli di ossigeno nell'ambiente immediato...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere immagini tridimensionali su scala micrometrica della concentrazione di ossigeno nell'ambiente immediatamente circostante cellule vive mediante microscopia di risonanza di spin elettronico o ESR. Il protocollo verrà dimostrato su cianobatteri, che sono cellule fotosintetiche comuni. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un campione di cellule di cianobatteri all'interno del portacampione per microscopia ESR.Incorporato in una soluzione stabile di radicali organici. Il portacampioni viene posizionato all'interno della sonda di imaging, che viene inserita nell'elettromagnete statico del sistema di microscopia ESR. A questo punto, vengono acquisite diverse immagini microscopiche tridimensionali ESR della soluzione di radicali organici mediante il microscopio ESR.Questo viene eseguito per diverse varianti di sequenze d'impulso e spesso in varie condizioni esterne, come in condizioni di luce e di buio. Successivamente, le immagini dei dati grezzi vengono elaborate dal computer al fine di estrarre i tempi di rilassamento tridimensionali risolti spazialmente del radicale. Questi tempi di rilassamento forniscono una misura diretta della concentrazione di ossigeno attraverso una calibrazione preesistente, portando a mappe tridimensionali complete di ossigeno dei campioni misurati in diverse condizioni esterne.Si ottengono risultati che mostrano chiaramente l'assenza di produzione di ossigeno da parte dei cianobatteri in assenza di luce. Inoltre, si osserva che sotto irradiazione luminosa si creano un gradiente significativo di ossigeno e un'eterogeneità dell'ossigeno nelle immediate vicinanze delle cellule di cianobatteri. Ciao, sono Al del laboratorio di BLA presso la Facoltà di Chimica del Technion, l'Istituto Israeliano di Tecnologia di Haifa.Oggi vi mostreremo un procedimento per mappare le concentrazioni di ossigeno nelle vicinanze delle cellule viventi in maniera tridimensionale con elevata risoluzione spaziale mediante la microscopia a sonda invasiva. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il tasso di consumo di ossigeno e l'attività metabolica delle cellule. Cominciamo dunque.La risonanza paramagnetica elettronica o RPE è una tecnica spettroscopica in cui una radiazione elettromagnetica a una frequenza specifica viene assorbita da specie paramagnetiche dotate di spin elettronico spaiato, poste in un campo magnetico statico esterno. È un metodo potente per studiare l'ambiente delle molecole paramagnetiche in organismi viventi, inclusa la concentrazione di ossigeno e di specie reattive dell'ossigeno. Qui viene mostrata un'immagine tipica della concentrazione di ossigeno in un topo portatore di tumore, relativa a campioni eterogenei.Le informazioni spettrali di RPE possono essere ottenute in modo risolto spazialmente mediante l'uso di gradienti di campo magnetico. Un radicale organico stabile e libero è stato iniettato nel topo e le sue caratteristiche di RPE forniscono la concentrazione di ossigeno nel suo ambiente. I risultati basati sulla RPE sono sovrapposti a un'immagine anatomica di risonanza magnetica.Fino ad ora, tali tecniche di imaging ESR su campioni vivi sono state effettuate solo con campioni relativamente grandi su scala millimetrica. La microscopia ESR con risoluzione implica la misurazione di campioni di dimensioni millimetriche e sub-millimetriche, fornendo immagini ESR tridimensionali con una risoluzione prossima a un micrometro.Di seguito sono riportati due esempi di immagini ESR ad alta risoluzione su scala micrometrica, di un campione generato con polvere NNC 60 e cristalli paramagnetici di cianuro ferrico di litio. Un microscopio ESR è simile a uno spettrometro ESR convenzionale, ed è dotato di un magnete per generare il campo statico, di un sistema a microonde per l'eccitazione degli spin e la rilevazione del segnale, di una sonda per contenere il campione e di una consolle computerizzata per controllare l'acquisizione dei dati e la loro elaborazione. Altri componenti del sistema includono i driver dei gradienti del campo magnetico, che fanno parte del sistema elettronico, e le bobine di gradiente posizionate all'interno della sonda per l'imaging.Le bobine a gradiente dispongono anche di un'apertura che consente l'irraggiamento luminoso del campione. Al campione viene applicata aria umida a temperatura controllata per garantire una minima disidratazione durante l'esperimento. Le principali caratteristiche distintive della microscopia ESR sono le ridotte dimensioni della sonda e delle bobine a gradiente, la maggiore sensibilità agli spin del sistema e l'elevata intensità dei driver del gradiente di campo magnetico. Prima di iniziare questa procedura, preparare una sospensione di cianobatteri a una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro.Per iniziare la preparazione del campione per la microimaging con risonanza di spin elettronico, prendere con pinzette fini alcuni quadratini di carta assorbente di dimensioni pari a circa 400 per 400 micron. Inserire quindi i quadratini in un tubo einor. Successivamente, riempire il tubo con 1,2 millilitri di sospensione di cianobatteri.Quindi centrifugare la sospensione per due minuti a 6.000 g in una microcentrifuga; al termine della centrifugazione, rimuovere completamente il soprannatante lasciandone circa 50 microlitri per evitare la disidratazione delle cianobatterie. Questo processo porta alla saturazione della carta assorbente con le cellule di cianobatteri. Successivamente, preparare un apposito contenitore simile a un portacampioni in vetro, estrarre alcune fibre dalla carta utilizzando pinzette fini e posizionarle sul fondo del portacampioni.In seguito, aggiungere tre millimolari di tridel e soluzione BG 11, preparata come descritto nel protocollo scritto, mediante l'ottavo di una siringa. Quindi sigillare il portacampioni con colla polimerizzabile con luce UV applicando la colla tra i bordi del portacampioni in vetro e il relativo vetrino di copertura, lasciando aperta una piccola apertura per l'aria. Infine, polimerizzare la colla con luce UV per due secondi.Per iniziare l'esperimento di imaging, accendere il sistema di micro-imaging ESR e inserire il campione nel risonatore che va all'interno della sonda di imaging. A questo punto, utilizzando il software di controllo del computer, impostare il sistema sulla modalità di accordo e individuare la frequenza di risonanza delle microonde della sonda, che verrà utilizzata per le misurazioni ESR. Successivamente, impostare il campo magnetico statico sul valore corrispondente alla frequenza delle microonde applicata.Impostare i parametri temporali per la sequenza d'impulsi e osservare il segnale ESR per verificare che il sistema funzioni correttamente e che il campione sia adeguatamente preparato. Successivamente, impostare i parametri di imaging come il numero di pixel, l'intensità dei gradienti e la durata degli impulsi di gradiente ai valori richiesti. Dopo la configurazione, acquisire tre immagini ESR tridimensionali mediante una sequenza d'impulsi di imaging ad eco Han con valori di separazione interpulso tau di 500, 600 e 700 nanosecondi.A questo punto, se richiesto dalle condizioni sperimentali durante l'acquisizione, accendere la proiezione della luce sul campione; i dati vengono salvati automaticamente. Al termine del processo di acquisizione, i file dei dati grezzi vengono elaborati mediante uno script software in MATLAB. Utilizzando il software, generare immagini della concentrazione del radicale trill e del tempo di rilassamento.T due mappa e quindi traduce queste immagini in un'immagine di concentrazione di ossigeno mediante una curva di calibrazione preesistente che collega la concentrazione di ossigeno al tempo di rilassamento. Qui T due zero è il tempo di rilassamento spin-spin del sonda in condizioni anossiche, che dipende dalla concentrazione C della sonda e dal suo coefficiente di diffusione D. Vengono mostrate tipiche immagini di dati grezzi provenienti da diversi esperimenti di imaging ESR tridimensionali effettuati su cianobatteri. Queste immagini sono state acquisite con diversi valori di tau in condizioni di buio o di luce.In condizioni di oscurità, i risultati sono molto simili, ad eccezione di una minore intensità per i valori maggiori di T dovuti al tempo di rilassamento spin-spin T due. Al contrario, sotto irradiazione luminosa, il modello dell'immagine cambia a causa dei diversi tempi di rilassamento all'interno del campione. Successivamente, questi dati vengono elaborati per ottenere un'immagine di ampiezza a partire da tale immagine.È evidente che la cianobatteria si trova principalmente sul lato destro del portacampioni. Le due immagini vengono convertite in valori di concentrazione di ossigeno mediante una curva di calibrazione preesistente che associa la concentrazione di ossigeno al tempo di rilassamento. I risultati sono mostrati per le cianobatterie in presenza e in assenza di luce.È chiaro che la produzione di ossigeno è innescata dalla luce e provoca un aumento significativo della concentrazione di ossigeno nella soluzione. Questo porta a una diminuzione del radicale T due, principalmente nei voxel vicini alle fibre di carta assorbente contenenti i cianobatteri. Vi abbiamo appena mostrato come preparare un campione contenente cellule vive con radicali liberi stabili per la mappatura della concentrazione di ossigeno mediante microscopia E PR E. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenerla il più breve possibile per garantire la riproducibilità e per evitare il deterioramento del campione.Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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