Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere immagini tridimensionali su scala micrometrica della concentrazione di ossigeno nell'ambiente immediatamente circostante cellule vive mediante microscopia di risonanza di spin elettronico o ESR. Il protocollo verrà dimostrato su cianobatteri, che sono cellule fotosintetiche comuni. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un campione di cellule di cianobatteri all'interno del portacampione per microscopia ESR.

Incorporato in una soluzione stabile di radicali organici. Il portacampioni viene posizionato all'interno della sonda di imaging, che viene inserita nell'elettromagnete statico del sistema di microscopia ESR. A questo punto, vengono acquisite diverse immagini microscopiche tridimensionali ESR della soluzione di radicali organici mediante il microscopio ESR.

Questo viene eseguito per diverse varianti di sequenze d'impulso e spesso in varie condizioni esterne, come in condizioni di luce e di buio. Successivamente, le immagini dei dati grezzi vengono elaborate dal computer al fine di estrarre i tempi di rilassamento tridimensionali risolti spazialmente del radicale. Questi tempi di rilassamento forniscono una misura diretta della concentrazione di ossigeno attraverso una calibrazione preesistente, portando a mappe tridimensionali complete di ossigeno dei campioni misurati in diverse condizioni esterne.

Si ottengono risultati che mostrano chiaramente l'assenza di produzione di ossigeno da parte dei cianobatteri in assenza di luce. Inoltre, si osserva che sotto irradiazione luminosa si creano un gradiente significativo di ossigeno e un'eterogeneità dell'ossigeno nelle immediate vicinanze delle cellule di cianobatteri. Ciao, sono Al del laboratorio di BLA presso la Facoltà di Chimica del Technion, l'Istituto Israeliano di Tecnologia di Haifa.

Oggi vi mostreremo un procedimento per mappare le concentrazioni di ossigeno nelle vicinanze delle cellule viventi in maniera tridimensionale con elevata risoluzione spaziale mediante la microscopia a sonda invasiva. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il tasso di consumo di ossigeno e l'attività metabolica delle cellule. Cominciamo dunque.

La risonanza paramagnetica elettronica o RPE è una tecnica spettroscopica in cui una radiazione elettromagnetica a una frequenza specifica viene assorbita da specie paramagnetiche dotate di spin elettronico spaiato, poste in un campo magnetico statico esterno. È un metodo potente per studiare l'ambiente delle molecole paramagnetiche in organismi viventi, inclusa la concentrazione di ossigeno e di specie reattive dell'ossigeno. Qui viene mostrata un'immagine tipica della concentrazione di ossigeno in un topo portatore di tumore, relativa a campioni eterogenei.

Le informazioni spettrali di RPE possono essere ottenute in modo risolto spazialmente mediante l'uso di gradienti di campo magnetico. Un radicale organico stabile e libero è stato iniettato nel topo e le sue caratteristiche di RPE forniscono la concentrazione di ossigeno nel suo ambiente. I risultati basati sulla RPE sono sovrapposti a un'immagine anatomica di risonanza magnetica.

Fino ad ora, tali tecniche di imaging ESR su campioni vivi sono state effettuate solo con campioni relativamente grandi su scala millimetrica. La microscopia ESR con risoluzione implica la misurazione di campioni di dimensioni millimetriche e sub-millimetriche, fornendo immagini ESR tridimensionali con una risoluzione prossima a un micrometro.

Di seguito sono riportati due esempi di immagini ESR ad alta risoluzione su scala micrometrica, di un campione generato con polvere NNC 60 e cristalli paramagnetici di cianuro ferrico di litio. Un microscopio ESR è simile a uno spettrometro ESR convenzionale, ed è dotato di un magnete per generare il campo statico, di un sistema a microonde per l'eccitazione degli spin e la rilevazione del segnale, di una sonda per contenere il campione e di una consolle computerizzata per controllare l'acquisizione dei dati e la loro elaborazione. Altri componenti del sistema includono i driver dei gradienti del campo magnetico, che fanno parte del sistema elettronico, e le bobine di gradiente posizionate all'interno della sonda per l'imaging.

Le bobine a gradiente dispongono anche di un'apertura che consente l'irraggiamento luminoso del campione. Al campione viene applicata aria umida a temperatura controllata per garantire una minima disidratazione durante l'esperimento. Le principali caratteristiche distintive della microscopia ESR sono le ridotte dimensioni della sonda e delle bobine a gradiente, la maggiore sensibilità agli spin del sistema e l'elevata intensità dei driver del gradiente di campo magnetico. Prima di iniziare questa procedura, preparare una sospensione di cianobatteri a una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro.

Per iniziare la preparazione del campione per la microimaging con risonanza di spin elettronico, prendere con pinzette fini alcuni quadratini di carta assorbente di dimensioni pari a circa 400 per 400 micron. Inserire quindi i quadratini in un tubo einor. Successivamente, riempire il tubo con 1,2 millilitri di sospensione di cianobatteri.

Quindi centrifugare la sospensione per due minuti a 6.000 g in una microcentrifuga; al termine della centrifugazione, rimuovere completamente il soprannatante lasciandone circa 50 microlitri per evitare la disidratazione delle cianobatterie. Questo processo porta alla saturazione della carta assorbente con le cellule di cianobatteri. Successivamente, preparare un apposito contenitore simile a un portacampioni in vetro, estrarre alcune fibre dalla carta utilizzando pinzette fini e posizionarle sul fondo del portacampioni.

In seguito, aggiungere tre millimolari di tridel e soluzione BG 11, preparata come descritto nel protocollo scritto, mediante l'ottavo di una siringa. Quindi sigillare il portacampioni con colla polimerizzabile con luce UV applicando la colla tra i bordi del portacampioni in vetro e il relativo vetrino di copertura, lasciando aperta una piccola apertura per l'aria. Infine, polimerizzare la colla con luce UV per due secondi.

Per iniziare l'esperimento di imaging, accendere il sistema di micro-imaging ESR e inserire il campione nel risonatore che va all'interno della sonda di imaging. A questo punto, utilizzando il software di controllo del computer, impostare il sistema sulla modalità di accordo e individuare la frequenza di risonanza delle microonde della sonda, che verrà utilizzata per le misurazioni ESR. Successivamente, impostare il campo magnetico statico sul valore corrispondente alla frequenza delle microonde applicata.

Impostare i parametri temporali per la sequenza d'impulsi e osservare il segnale ESR per verificare che il sistema funzioni correttamente e che il campione sia adeguatamente preparato. Successivamente, impostare i parametri di imaging come il numero di pixel, l'intensità dei gradienti e la durata degli impulsi di gradiente ai valori richiesti. Dopo la configurazione, acquisire tre immagini ESR tridimensionali mediante una sequenza d'impulsi di imaging ad eco Han con valori di separazione interpulso tau di 500, 600 e 700 nanosecondi.

A questo punto, se richiesto dalle condizioni sperimentali durante l'acquisizione, accendere la proiezione della luce sul campione; i dati vengono salvati automaticamente. Al termine del processo di acquisizione, i file dei dati grezzi vengono elaborati mediante uno script software in MATLAB. Utilizzando il software, generare immagini della concentrazione del radicale trill e del tempo di rilassamento.

T due mappa e quindi traduce queste immagini in un'immagine di concentrazione di ossigeno mediante una curva di calibrazione preesistente che collega la concentrazione di ossigeno al tempo di rilassamento. Qui T due zero è il tempo di rilassamento spin-spin del sonda in condizioni anossiche, che dipende dalla concentrazione C della sonda e dal suo coefficiente di diffusione D. Vengono mostrate tipiche immagini di dati grezzi provenienti da diversi esperimenti di imaging ESR tridimensionali effettuati su cianobatteri. Queste immagini sono state acquisite con diversi valori di tau in condizioni di buio o di luce.

In condizioni di oscurità, i risultati sono molto simili, ad eccezione di una minore intensità per i valori maggiori di T dovuti al tempo di rilassamento spin-spin T due. Al contrario, sotto irradiazione luminosa, il modello dell'immagine cambia a causa dei diversi tempi di rilassamento all'interno del campione. Successivamente, questi dati vengono elaborati per ottenere un'immagine di ampiezza a partire da tale immagine.

È evidente che la cianobatteria si trova principalmente sul lato destro del portacampioni. Le due immagini vengono convertite in valori di concentrazione di ossigeno mediante una curva di calibrazione preesistente che associa la concentrazione di ossigeno al tempo di rilassamento. I risultati sono mostrati per le cianobatterie in presenza e in assenza di luce.

È chiaro che la produzione di ossigeno è innescata dalla luce e provoca un aumento significativo della concentrazione di ossigeno nella soluzione. Questo porta a una diminuzione del radicale T due, principalmente nei voxel vicini alle fibre di carta assorbente contenenti i cianobatteri. Vi abbiamo appena mostrato come preparare un campione contenente cellule vive con radicali liberi stabili per la mappatura della concentrazione di ossigeno mediante microscopia E PR E. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenerla il più breve possibile per garantire la riproducibilità e per evitare il deterioramento del campione.

Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.