Cella Transfection singola in embrioni di pollo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di iniettare singole cellule di somiti chic o tubi neurali con un plasmide che codifica per la proteina fluorescente verde. Ciò si ottiene estraendo prima le pipette per microiniezione con un diametro di apertura del puntale appropriato. La seconda fase della procedura consiste nella preparazione di un ceppo plasmidico per le iniezioni.

La terza fase della procedura consiste nel preparare gli embrioni per l'iniezione. La quarta fase della procedura consiste nel caricare le micropipette con DNA plasmidico. La fase finale della procedura consiste nell'iniettare i tessuti desiderati.

In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la gamma di derivati nel numero di cellule prodotte da singoli progenitori marcati in som scelti e sottodomini del tubo neurale attraverso la microscopia a immunofluorescenza. Ciao, sono Rael del laboratorio del professor Heim nel Dipartimento di Neurobiologia Medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Oggi ti mostreremo una procedura per iniettare singole cellule di somiti di pollo e tubi neurali.

Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare la segregazione lineare delle cellule dell'acaro e del tubo neurale. Quindi iniziamo: per generare singole cellule trasfettate negli embrioni di pollo, inizia estraendo micro pipette. Tiriamo le nostre pipette su un estrattore per pipette Naga PP 83 standard con un'impostazione di calore di 13,5.

L'impostazione precisa deve essere calibrata per ottenere un diametro del puntale della pipetta compreso tra otto e 10 micron. Utilizziamo filamenti contenenti tubi di vetro silicato Boris con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno da 0,75 a 0,78 millimetri. È inoltre possibile utilizzare micropipette disponibili in commercio, prive di un filamento di un diametro esterno di un millimetro e di un diametro interno di 0,75 millimetri.

Le pipette preparate sono conservate in un piatto di plastica con i puntali protetti dal contatto con il bordo del piatto. Per preparare il DNA per la microiniezione, il plasmide di interesse viene trasfettato in DH cinque alfa e coli. Utilizzando le procedure standard il giorno successivo, il plasmide viene purificato utilizzando un kit di preparazione Maxi per iniezioni non clonali, utilizziamo una concentrazione di DNA di un microgrammo per microlitro.

Per gli esperimenti in cui si desidera cloni individuali, la concentrazione di plasmidi sarà molto più bassa e dovrà essere regolata. Per P-C-A-G-G-F-P-A una concentrazione da 0,05 a 0,1 microgrammi per microlitro funziona bene. Una volta determinata la concentrazione ottimale, si consiglia di diluire l'intero stock di plasmidi purificati piuttosto che i singoli preparati a una concentrazione predeterminata.

Quest'ultimo potrebbe introdurre una certa varianza nelle percentuali di successo, probabilmente a causa di variazioni nella purezza e in altri parametri, come la proporzione di plasmide supercoil per preparare le uova per la microiniezione, le uova di gallina che sono state incubate mentre giacevano sui loro assi lunghi fino allo stadio di sviluppo desiderato sono tamponate con etanolo al 70% e lasciate asciugare. Quindi, fora l'estremità appuntita dell'uovo con le forbici chirurgiche. Utilizzando una siringa da 10 millilitri e un ago da 19 gauge, prelevare due millilitri di albumina dall'uovo, sigillare i fori con paraffina calda prima dell'iniezione.

Usa le forbici chirurgiche per aprire una finestra nella parte superiore del guscio d'uovo per evitare che i detriti entrino nel foro. Metti un pezzo di nastro adesivo sulla finestra e fai un buco attraverso di esso. Per aiutare a visualizzare l'embrione, utilizzare un capillare tirato a fuoco montato su un aspiratore per iniettare un inchiostro non tossico come il pellicano 17 sotto il derma sabbiato.

Successivamente, accedere all'embrione tagliando e deviando le membrane vitali e/o amniotiche utilizzando perni di insetto da 0,14 millimetri montati su un portaaghi per caricare il DNA nella pipetta tirata Eloqua e aggiungere una piccola quantità di polvere verde veloce utilizzando il capillare. Aspirare una quantità minima di capillare montato su plasmide di diametro adeguato su un aspiratore. Quindi inserirlo nell'estremità della pipetta opposta alla punta affilata e caricare il DNA il più vicino possibile all'estremità affilata.

Quindi, collegare la pipetta a un iniettore manuale di pressione dell'aria montato su un micromanipolatore. Se necessario, applicare una pressione minima per consentire alla soluzione plasmidica di raggiungere la punta della pipetta. Manipolare la pipetta nel mezzo liquido dell'uovo applicando una certa pressione dell'aria per evitare l'ostruzione del puntale della pipetta.

Una volta che il dominio tissutale pertinente è perforato, la variazione di pressione è spesso sufficiente per rilasciare il plasmide con il verde veloce visibile. Se ciò non si verifica, applicare una leggera pressione sulla siringa fino a quando la miscela di plasmidi fast green non viene espulsa. Ripetere questa procedura lungo l'asse dell'embrione dopo l'iniezione può essere aggiunto PBS.

Infine, sigilla la finestra con del nastro adesivo e rimetti le uova nell'incubatrice. Evitare la ventilazione e includere piccoli contenitori d'acqua nell'incubatrice per aiutare a mantenere l'umidità e aumentare i raccolti. Se il sito bersaglio dell'iniezione era abbastanza superficiale da essere facilmente evidente, come all'interno del tubo neurale dei somiti dorsali o dell'ectoderma, si può misurare il tasso di successo dell'esperimento eseguendo un'osservazione dell'intera montatura utilizzando un binocolo fluorescente.

Questo passaggio è particolarmente utile per valutare se sono state etichettate troppe o troppo poche cellule. Se si desidera un'ulteriore incubazione, aggiungere antibiotici contenenti soluzione PBS all'uovo dopo averlo visto e sostituire il nastro del soffitto. Inoltre, è possibile valutare il tasso di successo dell'iniezione sezionando in serie gli embrioni ed eseguendo l'immunoistochimica.

Dopo quattro ore o più, gli embrioni post-iniezione vengono fissati e processati per la sezione in paraffina. Le sezioni montate su vetro vengono quindi depa finalizzate e potrebbe essere auspicabile l'immunocolorazione per i metodi di amplificazione della visualizzazione del reporter come la streptavidina della biotina. Infine, le sezioni seriali vengono scansionate per rilevare le cellule marcate nei segmenti iniettati.

Se durante le prove iniziali si ottengono più cellule piuttosto che singole cellule, lo stock plasmidico deve essere diluito nel processo ripetuto fino a raggiungere risultati adeguati. In genere effettuiamo una singola iniezione di P-C-A-G-G-F-P per acaro mentre miriamo da sei a 12 segmenti per embrione. Con questa impostazione, un segnale chiaro può essere rilevato mediante osservazione dell'intera montatura, otto ore dopo l'iniezione in almeno un segmento in un embrione su 10.

In questo esempio, a un acaro è stato iniettato un plasmide codificante GFP, e cinque ore dopo si osserva una singola cellula fluorescente in una vista dell'intera montatura dell'embrione mostrato qui. Quando osservato 24 ore dopo l'iniezione nell'acaro centrale, si osserva un clone di cellule fluorescenti in un intero embrione montato due giorni dopo l'iniezione clonale. Il sezionamento di questo segmento rivela la presenza di progenie clonale sia nel derma che nel muscolo, dimostrando che i singoli progenitori generano entrambi i derivati.

Come per i somiti, anche i singoli progenitori neuroepiteliali nel tubo neurale dorsale possono essere impalati come illustrato in questa sezione trasversale, fotografata cinque ore dopo l'iniezione qui. L'analisi della sezione seriale ha rivelato che i trasfetti clonali sono stati raggiunti quando il tasso di successo era di circa il 10%Ciò significa che per ottenere la clonalità, la tecnica è per definizione altamente inefficiente. D'altra parte, in queste condizioni, oltre il 93% degli eventi di marcatura positiva è risultato essere clonale.

Ti abbiamo appena mostrato come iniettare singole cellule di embrioni di pollo quando esegui questa procedura. È importante ricordare di diluire una grande quantità di plasmide stock a una concentrazione ideale per le infezioni a singola cellula e quindi utilizzarlo durante gli esperimenti. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.