Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica
4 settembre 2010
Analisi di singola cellula viene effettuata mediante spettrometria di massa su cellule animali e vegetali a pressione atmosferica, utilizzando una fibra ottica affilato per assaggiare le cellule per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è espellere il contenuto di una singola cellula vivente e ionizzare le biomolecole rilasciate per l'analisi mediante uno spettrometro di massa in condizioni di pressione atmosferica. Questo risultato si ottiene selezionando una singola cellula attraverso un microscopio a lunga distanza e ablazionando la cellula selezionata con un impulso laser di lunghezza d'onda 2,94 micrometri, erogato tramite una fibra ottica affilata. L'ablazione di una singola cellula provoca la formazione di un pennacchio microscopico di materiale particolato neutro, da ionizzare successivamente.
Viene intercettato da uno spruzzo elettrostatico. Le goccioline cariche dello spruzzo si fondono con le particelle della nube di ablazione proveniente dalla cellula. Le goccioline risultanti sono arricchite con le molecole della cellula e generano gli ioni corrispondenti.
Vengono ottenuti risultati che mostrano uno spettro di massa proveniente da una singola cellula. Lo spettro contiene numerosi picchi relativi ai metaboliti e ai lipidi della cellula. Salve, sono il dottor Bin Drester del Verese Laboratory del Dipartimento di Chimica della George Washington University.
Oggi vi mostreremo il procedimento per l'analisi diretta di singole cellule vive mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare metaboliti e lipidi di singole cellule vegetali e animali. Cominciamo dunque.
L'ablazione laser per l'ablazione laser, ionizzazione mediante spruzzo elettrostatico, spettrometria di massa o MS pigra è prodotta da un impulso laser di cinque nanosecondi a una lunghezza d'onda di 2,94 micrometri. Un oscillatore ottico parametrico accordabile, azionato da un laser a neodimio YAG, è utilizzato per l'ablazione in questo studio.
Per iniziare, montare l'estremità incisa di una fibra ottica su un micromanipolatore e avvicinarla alla superficie della cellula. Per un efficiente deposito di energia, tenere l'estremità non incisa della fibra ottica mediante un porta-fibra nudo per l'allineamento ottico. Il porta-fibra è montato su un traduttore a cinque assi.
Accoppiare l'energia laser alla fibra focalizzando il fascio mediante una lente piano-convessa in fluoruro di calcio o in seleniuro di zinco con rivestimento antiriflesso, indirizzandolo sull'estremità non incisa della fibra; utilizzare specchi d'oro protetti per deviare il fascio laser nell'infrarosso medio verso la lente di focalizzazione. Per mantenere la distanza tra la punta appuntita della fibra e la superficie della cellula, utilizzare un microscopio video a lunga distanza montato con un angolo compreso tra 15 e 30 gradi rispetto alla superficie. Questo sistema comprende inoltre un obiettivo corretto all'infinito con ingrandimento cinque volte, dotato di una telecamera CCD per il monitoraggio e l'acquisizione delle immagini.
Un secondo microscopio video è montato perpendicolarmente alla superficie del campione per visualizzare le cellule dall'alto e selezionarle per l'analisi. Questo sistema fornisce un riscontro visivo per allineare la punta della fibra sopra la cellula selezionata per l'ablazione e l'analisi. È composto da un obiettivo zoom di precisione con ingrandimento sette volte, da una lente obiettivo corretta all'infinito con lunga distanza di lavoro 10 volte e da una telecamera CCD.
Il sistema di elettrospruzzo è stato costruito utilizzando un raccordo metallico con perfluoro conduttivo, elastomero, raccordi feral, tubi, porta ago con manicotto e tubo in silice FU. L'emettitore raccomandato è in acciaio inossidabile e presenta una punta conica con un diametro di 50 micrometri; preparare una soluzione al 50% di metanolo con 0,1% di acido acetico per l'elettrospruzzo. Pompare la soluzione a una velocità compresa tra 200 e 300 nanolitri al minuto mediante una pompa a siringa.
Utilizzando una siringa da 500 microlitri, verrà applicata una tensione elevata compresa tra 2, 803.000 volt al giunto metallico mediante un alimentatore regolato. Per generare uno spruzzo elettrostatico stabile, assicurarsi che tutte le connessioni elettriche siano sicure e schermate correttamente, con messa a terra adeguata, poiché il contatto diretto con parti scoperte in alta tensione può provocare scosse elettriche. Ottenere il campione di tessuto o cellule vitali da una fonte appropriata e conservarlo secondo le raccomandazioni prima dell'analisi.
I bulbi di allium per questa dimostrazione sono stati acquistati da un negozio locale. Per la preparazione del campione del bulbo di allium, tagliare longitudinalmente il bulbo con un bisturi chirurgico, sezionando un segmento di circa due centimetri quadrati della squama di un bulbo di cipolla. Successivamente, staccare un monolayer intatto del tessuto epidermico interno. Utilizzare la superficie umida dell'epidermide per montare il tessuto su un vetrino microscopico precedentemente pulito.
Tenere il vetrino mediante un supporto universale, montato su un palco di traslazione a tre assi per il posizionamento. Immediatamente dopo aver montato il campione, acquisire gli spettri di massa per prevenire il degrado cellulare. Iniziare accendendo il laser, lo spruzzo elettrostatico e lo spettrometro di massa.
Ottimizzare la geometria della sorgente ionica lazy regolando la posizione del punto di ablazione e dell'emettitore elettrospray l'uno rispetto all'altro e rispetto all'orifizio dello spettrometro di massa. Per ottenere la massima intensità ionica, selezionare la cellula di interesse per l'analisi utilizzando il sistema di visualizzazione in vista superiore. Dopo la selezione, spostare la piattaforma del campione in modo da posizionare la cellula selezionata direttamente al di sotto della punta affilata della fibra ottica.
Utilizzando il microscopio con vista laterale, regolare nuovamente la distanza tra la punta e la superficie della cellula a circa 20 micrometri. Una volta raggiunta la posizione corretta, inviare impulsi laser sulla cellula selezionata attraverso la punta della fibra incisa. Ciò determina la perforazione della parete cellulare e l'espulsione del citoplasma sotto forma di materiale particellato.
Dopo la post-ionizzazione mediante elettrospruzzo, gli ioni prodotti vengono raccolti dallo spettrometro di massa e vengono registrati gli spettri di massa. Al termine dell'acquisizione dei dati, impostare il laser, l'elettrospruzzo e lo spettrometro di massa in modalità stand-by oppure spegnerli. Conservare il campione di tessuto di Allium cepa ablato per un'eventuale osservazione mediante microscopia ottica; un'ablazione riuscita di una singola cellula provoca la rottura della parete cellulare e la raccolta di uno spettro di massa debole.
Di seguito sono riportati i risultati dell'analisi MS lazy di una singola cellula epidermica inclusa in un bulbo di allium SEPA, che mostra un'immagine rappresentativa ottenuta mediante microscopia ottica. Dopo il campionamento di una cellula, la parete cellulare viene perforata e l'estensione della perforazione è limitata dai confini con le cellule adiacenti. Le cellule adiacenti risultano integre.
Qui viene mostrato uno spettro di massa lazy rappresentativo prodotto dalla cellula. Viene rilevata una vasta gamma di ioni dall'allium sea per cellula, e sulla base delle loro masse accurate, dei modelli di distribuzione degli isotopi e degli spettri di massa in tandem, gli ioni vengono attentamente assegnati a metaboliti endogeni. Gli ioni rilevati da una singola cellula erano simili a quelli osservati nell'analisi dello stesso tessuto mediante spettrometria di massa lazy convenzionale su più cellule.
Vi abbiamo appena mostrato come analizzare singole cellule vive mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di indossare occhiali protettivi per evitare esposizioni accidentali a laser infrarossi di classe quattro. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo studio dimostra l'uso della spettrometria di massa con ionizzazione mediante elettrospray e ablazione laser (LAESI) per l'analisi di singole cellule vegetali e animali. Il metodo consente l'analisi diretta di metaboliti e lipidi cellulari a pressione atmosferica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Spettrometria di Massa
- Biologia Cellulare
- Chimica Analitica
Sfondo
- L'analisi di singole cellule è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari.
- La spettrometria di massa LAESI consente l'analisi di biomolecole senza preparazione campionaria estesa.
- Questa tecnica è applicabile sia a cellule vegetali che animali.
- La comprensione di metaboliti e lipidi può fornire informazioni sui processi cellulari.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'analisi diretta di singole cellule vive.
- Indagare sui metaboliti e sui lipidi presenti in cellule singole.
- Dimostrare la fattibilità della spettrometria di massa LAESI nella ricerca biologica.
Metodi Utilizzati
- Selezione di una singola cellula mediante un microscopio a lunga distanza.
- Ablazione della cellula mediante un impulso laser erogato attraverso una fibra ottica.
- Ionizzazione del pennacchio di ablazione mediante un sistema di elettrospruzzo.
- Acquisizione degli spettri di massa mediante uno spettrometro di massa.
Risultati principali
- L'ablazione riuscita di singole cellule ha prodotto spettri di massa contenenti picchi relativi a metaboliti e lipidi.
- Il metodo ha dimostrato danni minimi alle cellule adiacenti.
- Gli spettri di massa hanno fornito informazioni dettagliate sulla composizione cellulare.
- I sistemi di feedback visivo hanno migliorato la precisione nella selezione e nell'analisi delle cellule.
Conclusioni
- La spettrometria di massa LAESI è uno strumento efficace per l'analisi di singole cellule.
- La tecnica consente l'analisi in tempo reale dei componenti cellulari.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi biologici che coinvolgono singole cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettrometria di massa diretta su singola cellula a pressione atmosferica consente un profilo metabolico senza marcatura, senza alterare gli stati cellulari nativi, supportando la validazione precoce dei bersagli grazie alla rivelazione dell'espressione eterogenea di biomarcatori in popolazioni isogeniche. Questa capacità riduce i rischi nell'identificazione dei composti promettenti fornendo dati quantitativi sui metaboliti con risoluzione spaziale, correlati agli esiti dello screening fenotipico, informando decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione preclinica dei bersagli. La compatibilità del metodo con cellule vive e la minima preparazione del campione si allineano ai flussi di lavoro nella fase di scoperta, che richiedono un'ancoraggio fenotipico rapido e riproducibile dei bersagli molecolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando l'eterogeneità dei metaboliti e dei lipidi endogeni in singole cellule vive in condizioni fisiologiche.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica attraverso la rilevazione diretta e senza marcatura di composti biochimici, senza artefatti da fissazione o estrazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce spettri di massa quantitativi e riproducibili da singole cellule, consentendo la standardizzazione dei saggi per lo screening fenotipico basato su metaboliti.
- Valore operativo: Supporta l'uso scalabile della piattaforma mediante ablazione laser con fibra ottica e ionizzazione a spruzzo elettrostatico, facilitando l'integrazione in flussi di lavoro automatizzati per l'analisi di singole cellule.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i fenotipi metabolici nella fase di scoperta a modelli preclinici fornendo candidati biomarcatori traslazionali derivati da dati di spettrometria di massa LAESI a singola cellula.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto attivo, fornendo letture molecolari coerenti e indipendenti da depositi in diversi tipi cellulari e condizioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione dell'obiettivo guidata da ipotesi all'identificazione di composti promettenti, in cui il profilo metabolico a singola cellula fornisce informazioni sulla fiducia nell'obiettivo e sulla progettazione di saggi fenotipici prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi metabolici e la riduzione del rischio biologico rilevando metaboliti e lipidi endogeni direttamente da singole cellule ablative.
- Screening: Permette la prontezza del saggio generando spettri di massa quantitativi e privi di depositi che riflettono la biochimica cellulare nativa.
- Analisi: Fornisce letture di metaboliti e lipidi mediante massa esatta, distribuzione degli isotopi e spettrometria di massa in tandem, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica identificando firme metaboliche associate a sistemi rilevanti per le malattie e supportando l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità analitica riutilizzabile per studi longitudinali su singole cellule, riducendo la necessità di riconvalida tra diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso l'ionizzazione diretta, in condizioni ambientali, dei metaboliti cellulari senza perturbazione del campione.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante ablazione laser accoppiata a fibra e ionizzazione elettrospray controllata a pressione atmosferica.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo il rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce del rischio metabolico degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante risoluzione a livello di singola cellula delle risposte eterogenee, consentendo la stratificazione degli effetti dei composti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sicurezza laser, nell'allineamento ottico e nell'interpretazione dei dati di spettrometria di massa per l'ablazione nel medio IR e l'ionizzazione elettrospray.
- È dipendente da sistemi laser accordabili nel medio IR, consegna mediante fibra ottica, emettitori elettrospray ad alta tensione e acquisizione sincronizzata dello spettrometro di massa.
- Necessita di standardizzazione congiunta tra gruppi di lavoro per la manipolazione delle cellule, i parametri di ablazione e la geometria dello spruzzo, al fine di ottenere rese ioniche riproducibili tra diversi laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento relative alle dimensioni cellulari, alla rigidità della membrana e alla matrice extracellulare quando si passa da modelli vegetali, mammiferi o microbici.
- Comprende limitazioni pratiche come gli effetti di dispersione del pennacchio e la dipendenza dell'efficienza di ionizzazione dalla distanza tra il punto di ablazione e lo spruzzo, come indicato nei passaggi di ottimizzazione geometrica.
