Imaging interazioni proteina-proteina In vivo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la presenza di interazioni proteina-proteina sulla superficie cellulare. Ciò si ottiene clonando due recettori di interesse, un mioterminale a due fluorofori che hanno un'emissione sovrapposta e spettri come secondo passaggio. I due vettori vengono trasfettati simultaneamente in cellule endoteliali per l'espressione del recettore.

A questo punto, i fluorofori aiutano a valutare l'estensione complessiva dell'espressione e la localizzazione dei recettori. Successivamente, i parametri di imaging vengono stabiliti utilizzando un singolo trasfetto come controllo sul microscopio confocale. Individualmente, le cellule trasfettate vengono selezionate in base ai loro livelli relativi di espressione e localizzazione dei recettori.

Le regioni all'interno di queste cellule vengono quindi visualizzate per valutare l'entità dei risultati di FRET. Ciò mostra interazioni di legame uno e due sulla superficie delle cellule endoteliali basate sulla microscopia fre e confocale. Ciao, sono Tom Seger del laboratorio del Dr.William Barton nel Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare della Virginia Commonwealth University.

Oggi vi mostreremo una procedura per valutare le interazioni di una proteina proteina nelle cellule endoteliali mediante una microscopia confocale basata su FRET. Nel nostro laboratorio, lo usiamo per studiare le interazioni dei recettori durante l'angiogenesi. Quindi iniziamo.

Per visualizzare le interazioni proteina-proteina utilizzando un saggio di prossimità basato su FRET, iniziare clonando i recettori di interesse nei siti NHE one eco R one della pcd, un vettore 3.1 idro o neo contenente CFP monomerico o YFP. La determinazione del fret è empirica e dipende in modo critico dalla lunghezza del linker tra la regione di attraversamento transmembrana e l'inizio del Fluor. Pertanto, è necessario esplorare diversi collegamenti di linker per ogni nuova coppia di recettori in fase di studio, trasformare e amplificare i vettori secondo il protocollo di accompagnamento.

Quindi preparare il DNA di grado di trasfezione, trasformare e amplificare i vettori secondo il protocollo di accompagnamento. Quindi preparare il DNA di grado di trasfezione e diluirlo a una concentrazione di lavoro di un microgrammo per microlitro per preparare le cellule per la trasfezione sotto una cappa di coltura tissutale divisa EAHY 92 6 cellule coltivate in DMEM completo in una linea di scorrimento coprioggetti da 35 millimetri con due millilitri di terreno. Preparare un piatto per valutare l'espressione di ogni singolo recettore e un piatto per ogni coppia di recettori.

Lasciare che le cellule incubino oltre il 95% di anidride carbonica in atmosfera a 37 gradi Celsius il giorno successivo. La coltura dovrebbe essere intorno al 70-90% di confluenza il giorno della trasfezione. Preparare i complessi lipidici del nucleo mescolando due microgrammi del DNA vettore del recettore chimerico con otto microlitri di Fuji N HD in 200 microlitri di preriscaldamento ottimale per le coppie di recettori, trasfettare con un microgrammo di ciascun recettore per un totale di due microgrammi miscelati delicatamente per inversione e incubarlo a temperatura ambiente per 30 minuti.

Durante il periodo di incubazione, preparare le cellule per la trasfezione, aspirare i terreni freschi e lavare delicatamente e brevemente ogni piastra con PBS caldo prima dell'aggiunta di due millilitri di DMEM completo prebellico senza antibiotici. È importante evitare la presenza di penicillina e streptomicina poiché sono considerevolmente più tossiche per le cellule durante il trattamento con il gene FU HD al complesso goccia a goccia alle cellule e incubare per ulteriori 20-24 ore. Dopo 24 ore, aspirare con cura il terreno dalle cellule e pipettare il DMEM completo fresco con antibiotici dopo la trasfezione.

La vitalità cellulare dovrebbe rimanere relativamente elevata. Si devono osservare poche o nessuna cella fluttuante. Per eseguire l'imaging di cellule vive, utilizziamo un microscopio a scansione laser confocale a due A OBS dotato di laser a diodo blu e laser al neon ad elio verde, arancione e rosso, un H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA a immersione, uno stadio XY motorizzato e un incubatore a stadio controllato da temperatura, umidità e anidride carbonica.

I controlli sperimentali sono fondamentali per eliminare la diafonia del fluor tra i canali di emissione e per valutare i problemi di espressione e la fourizzazione del fluor aspecifico. Pertanto, i singoli transfetti fluoro quattro vengono utilizzati per impostare ogni sessione di immagini per eliminare la diafonia tra i canali di emissione per CFP e YFP. Posizionare il controllo di espressione CFP nell'incubatore di tavolino utilizzando la luce bianca.

Regola la piastra Z per concentrarti sulle celle. Impostare le impostazioni della finestra SP per il rilevamento delle emissioni di CFP da 465 a 505 e YFP da 525 a 600 nanometri, mentre il monitoraggio di entrambi i canali di emissione eccita la CFP a 458 nanometri. Utilizzando l'A OTF, impostare la potenza del laser per eliminare l'apprezzabile spurgo di CFP nel canale di emissione YFP.

Salvare questa impostazione. Eseguire lo stesso controllo per la diafonia YFP nel canale CFP regolando la potenza di eccitazione a 514 nanometri. Le celle che esprimono solo YFP salvano questa impostazione.

Successivamente, al prossimo posto, le cellule esprimono CFP e YFP nell'incubatore di stadio. Utilizzo dell'impostazione della sequenza per il software confocale LICO. Localizzare le cellule che esprimono livelli simili di CFP e YFP con un'adeguata localizzazione della membrana utilizzando il software LICO, ad eccezione di un programma di fotosbiancamento con accettatore di software.

Imposta le impostazioni del donatore e dell'accettatore rispettivamente sulle impostazioni CFP e YFP salvate. Ingrandendo la cella, evidenziare una regione di interesse o ROI in cui la fotodistruzione di YFP deve avvenire sulla membrana cellulare e iniziare il programma per la fotodistruzione dell'accettore. Regolare l'A OTF al 100% di 514 nanometri e lasciare che lo sbiancamento laser continui fino a quando il 70% dell'emissione YFP non è stato esaurito.

Per accelerare lo sbiancamento, le ROI sono tipicamente scelte nell'asse raster del laser durante il fotosbiancamento. Monitora il movimento cellulare e le misure di scarto ottenute con un movimento apprezzabile nel piano XY. Poiché queste misurazioni possono riportare false efficienze dei tasti, le immagini pre e post bleach vengono registrate sia per il donatore che per l'accettore e l'efficienza dei tasti viene calcolata come l'efficienza dei tasti uguale al palo genitore aperto meno le parentesi DLO divise per depost per ogni deposizione maggiore di D pre dove D, pre e D post sono rispettivamente le intensità del donatore prima e dopo il fotobleaching.

JMP viene utilizzato per determinare l'entità della variabilità sperimentale. I singoli recettori devono essere fusi sia con CFP che con YFP con lunghezze variabili della sequenza di membrana juxta. Per identificare la migliore coppia possibile di partner recettoriali, le efficienze di trasfezione sono in genere comprese tra il 30 e il 40%, nonostante i risultati precedenti di altri.

Non abbiamo visto che la trasfezione e l'espressione di un vettore favoriscono quella dell'altro. In effetti, osserviamo spesso l'espressione esclusiva di una flora, quattro specchi KY o l'altro. Queste immagini rappresentative mostrano un'analisi di fotosbiancamento dell'accettore del fret che si verifica tra CFP e YFP in una cella EAHY 9 26.

I canali di emissione CFP e YFP sono stati monitorati separatamente prima e dopo il fotosbiancamento, il fotosbiancamento e i calcoli sono stati limitati alla regione. All'interno della casella rossa, l'efficienza dei tasti viene visualizzata come un intervallo assoluto dal rosso colorato alto a 1,0 al viola colorato basso a zero su una sovrapposizione ingrandita di un'immagine fusa A-C-F-P-Y-F-P solo per scopi di orientamento per il sistema del recettore T. I valori tipici di efficienza FRET, compresi tra il 20 e il 28% per le cellule epiteliali e tra il 19 e il 23% per le cellule endoteliali, come mostrato qui.

Quindi, una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà in genere dai tre ai quattro giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la lunghezza del linker tra la proteina bersaglio e la proteina fluorescente di fusione, così come i loro livelli di espressione e il movimento cellulare influenzano direttamente la misurazione del fret dopo la loro procedura. Inoltre, è possibile eseguire saggi biochimici relativi all'attivazione del segnale al fine di ottenere informazioni sulle vie di trasduzione del segnale dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica fornisce un saggio in cui è possibile studiare le interazioni proteina-proteina deboli o transitorie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire i tuoi saggi di prossimità basati su tasti e cellule vive. E non dimenticare che quando si lavora con le cellule in coltura tissutale, è necessario seguire sempre le precauzioni di sicurezza appropriate.

Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi futuri esperimenti sui tasti.