Imaging interazioni proteina-proteina In vivo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la presenza di interazioni proteina-proteina sulla superficie cellulare. Questo viene ottenuto clonando due recettori di interesse, ciascuno in fuzione C-terminale a due fluorofori con spettri di emissione sovrapposti, come secondo passaggio. I due vettori vengono quindi trasfettati simultaneamente in cellule endoteliali per l'espressione dei recettori.

A questo punto, i fluorocromi aiutano a valutare l'entità complessiva dell'espressione nonché la localizzazione del recettore. Successivamente, i parametri di acquisizione delle immagini vengono stabiliti utilizzando una singola trasfezione come controllo al microscopio confocale. Singolarmente, le cellule trasfettate vengono selezionate in base ai loro livelli relativi di espressione e localizzazione del recettore.

Successivamente, vengono acquisite immagini di regioni all'interno di queste cellule al fine di valutare l'entità dei risultati ottenuti con la tecnica FRET. Tali risultati mostrano interazioni di tipo tie one e tie two sulla superficie delle cellule endoteliali, basate su FRET e microscopia confocale. Ciao, sono Tom Seger del laboratorio del Dott. William Barton del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare della Virginia Commonwealth University.

Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare le interazioni tra proteine in cellule endoteliali mediante microscopia confocale basata su FRET. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnica per studiare le interazioni tra recettori durante l'angiogenesi. Cominciamo dunque.

Per visualizzare le interazioni proteina-proteina mediante un saggio di prossimità basato sul trasferimento di energia di risonanza (FRET), iniziare clonando i recettori di interesse nei siti NHE1 ed EcoR1 del vettore pcd, un vettore hydro o neo 3.1 contenente CFP o YFP monomerici. La determinazione del FRET è empirica e dipende criticamente dalla lunghezza del linker tra la regione transmembrana e l'inizio del fluoroforo. Pertanto, devono essere esplorati diversi tipi di linker per ogni nuova coppia di recettori in esame. Trasformare e amplificare i vettori seguendo il protocollo allegato.

Quindi preparare il DNA di qualità per la trasfezione, trasformare e amplificare i vettori secondo il protocollo allegato. Successivamente, preparare il DNA di qualità per la trasfezione e diluirlo a una concentrazione lavorativa di un microgrammo per microlitro per preparare le cellule alla trasfezione sotto una cappa a flusso laminare. Suddividere le cellule EAHY 926 coltivate in DMEM completo in piatti da 35 millimetri con coprislips, utilizzando due millilitri di mezzo. Preparare un piatto per valutare l'espressione di ciascun recettore singolo e un piatto aggiuntivo per ogni coppia di recettori.

Lasciare le cellule incubare in un'atmosfera con oltre il 95% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per il giorno successivo. Il giorno della trasfezione, la coltura dovrebbe raggiungere una confluenza compresa tra il 70 e il 90%. Preparare i complessi nucleolipidici mescolando due microgrammi di DNA del vettore del recettore chimera con otto microlitri di Fuji N HD in 200 microlitri di Opti-MEM preriscaldato; per le coppie di recettori, trasfettare un microgrammo di ciascun recettor, per un totale di due microgrammi, mescolando delicatamente per inversione e lasciando incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Durante il periodo di incubazione, preparare le cellule per la trasfezione aspirando il mezzo fresco e lavando delicatamente e brevemente ogni piastra con PBS tiepido prima dell'aggiunta di due millilitri di DMEM completo pre-riscaldato senza antibiotici. È importante evitare la presenza di penicillina e streptomicina poiché risultano notevolmente più tossiche per le cellule durante il trattamento. Aggiungere goccia a goccia il complesso contenente il gene FU alle cellule e incubare per ulteriori 20-24 ore. Dopo 24 ore, aspirare con attenzione il mezzo dalle cellule e aggiungere mezzo DMEM completo fresco con antibiotici a seguito della trasfezione.

La vitalità cellulare dovrebbe rimanere relativamente elevata. Si dovrebbero osservare poche o nessuna cellula in sospensione. Per eseguire l'immagineggiamento di cellule vive, utilizziamo un microscopio confocale a scansione laser A-T-C-S-P two A OBS dotato di laser a diodo blu al argon e laser al neon elio verdi, arancioni e rossi, un obiettivo H-C-X-P-I-A-O 63x 1,3 NA a immersione in glicerina, un piatto motorizzato XY e un incubatore per piatto con controllo di temperatura, umidità e anidride carbonica.

I controlli sperimentali sono fondamentali per eliminare il crosstalk tra i canali di emissione dei fluorocromi, nonché per valutare problemi di espressione e la marcatura non specifica con il fluorocromo. Pertanto, vengono utilizzate trasfezioni singole con fluorocromo per impostare ogni sessione di acquisizione immagini, al fine di eliminare il crosstalk tra i canali di emissione di CFP e YFP. Posizionare il controllo di espressione di CFP nell'incubatore sul palchetto utilizzando luce bianca.

Regolare la piastra Z per mettere a fuoco le cellule. Impostare le finestre SP per il rilevamento dell'emissione di CFP da 465 a 505 e di YFP da 525 a 600 nanometri, monitorando contemporaneamente entrambi i canali di emissione, ed eccitare il CFP a 458 nanometri. Utilizzando l'A OTF, regolare la potenza del laser per eliminare il passaggio apprezzabile di CFP nel canale di emissione di YFP.

Salvare questa impostazione. Eseguire lo stesso controllo per la fuoriuscita di YFP nel canale CFP regolando la potenza di eccitazione a 514 nanometri. Le cellule che esprimono solo YFP, salvare questa impostazione.

Successivamente, posizionare le cellule coesprimenti CFP e YFP nell'incubatrice dello strumento. Utilizzando l'impostazione sequenziale del software confocale LICO, individuare le cellule che esprimono livelli simili di CFP e YFP con una corretta localizzazione membranare mediante il software LICO, escludendo un programma software di foto-sbiancamento.

Impostare le impostazioni del donatore e dell'accettore rispettivamente sulle proprie impostazioni salvate per CFP e YFP. Ingrandire la cellula, evidenziare una regione di interesse o ROI in cui deve avvenire la foto-distruzione di YFP sulla membrana cellulare e avviare il programma per la foto-distruzione dell'accettore. Regolare l'A OTF al 100% di 514 nanometri e lasciare proseguire il fotoblesciamento con il laser fino a quando l'emissione di YFP non si sarà ridotta del 70%.

Per accelerare lo sbiancamento, le ROI vengono tipicamente scelte lungo l'asse raster del laser durante la fotobleach. Monitorare il movimento cellulare e scartare le misurazioni ottenute con un movimento apprezzabile nel piano XY. Poiché queste misurazioni possono riportare efficienze FRET false, vengono registrate immagini prima e dopo lo sbiancamento sia per il donatore che per l'accettore, e l'efficienza FRET viene calcolata come efficienza FRET uguale a (intensità post-bleach del donatore meno intensità pre-bleach del donatore) diviso per intensità post-bleach del donatore, per tutti i valori di intensità post-bleach del donatore maggiori dell'intensità pre-bleach del donatore, dove D pre e D post sono rispettivamente le intensità del donatore prima e dopo la fotobleach.

JMP viene utilizzato per determinare il grado di variabilità sperimentale. I singoli recettori dovrebbero essere fusi sia a CFP che a YFP con lunghezze variabili di sequenza giuxtamembrana. Per identificare la migliore coppia possibile di partner recettoriali per FRET, le efficienze di trasfezione sono tipicamente comprese tra il 30 e il 40%, nonostante risultati precedenti ottenuti da altri autori.

Non abbiamo osservato che la trasfezione e l'espressione di un vettore favoriscano quella dell'altro. Di fatto, osserviamo frequentemente l'espressione esclusiva di una delle due flora, specchio KY o l'altra. Queste immagini rappresentative mostrano un'analisi di fotobleaching dell'accettore di un fenomeno di trasferimento di energia di risonanza (FRET) tra CFP e YFP in una cellula EAHY 9 26.

I canali di emissione di CFP e YFP sono stati monitorati separatamente prima e dopo il fotoblesciamento, e i calcoli sono stati limitati alla regione all'interno del riquadro rosso. L'efficienza FRET è mostrata come un intervallo assoluto che va da valori elevati (colorati di rosso) a 1,0 a valori bassi (colorati di viola) a zero, sovrapposti in ingrandimento all'immagine fusa A-C-F-P-Y-F-P, esclusivamente a scopo orientativo per il sistema del recettore T. I valori tipici di efficienza FRET sono compresi tra il 20 e il 28% per le cellule epiteliali e tra il 19 e il 23% per le cellule endoteliali, come mostrato qui.

Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede tipicamente da tre a quattro giorni se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la lunghezza del linker tra la proteina bersaglio e la proteina fluorescente di fusione, così come i loro livelli di espressione e il movimento cellulare, influenzano direttamente la misurazione FRET successiva alla procedura. Inoltre, possono essere eseguiti saggi biochimici relativi all'attivazione del segnale al fine di ottenere informazioni sui percorsi di trasduzione del segnale dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica fornisce un saggio in cui è possibile studiare interazioni proteina-proteina che sono deboli o transitorie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del modo in cui eseguire autonomamente saggi di prossimità basati su FRET in cellule vive. E non dimenticare che quando si lavora con cellule in coltura tissutale, è sempre necessario seguire adeguate precauzioni di sicurezza.

Grazie quindi per aver guardato e buona fortuna con i vostri futuri esperimenti con il fret.