Name: Imaging interazioni proteina-proteina In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Scopri come valutare le interazioni proteina-proteina sulla superficie cellulare utilizzando un saggio di prossimità basato su FRET in cellule endoteliali. Questo metodo consente di studiare le dinamiche dei recettori durante l'angiogenesi.

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Vogliamo riconoscere il dottor Scott Henderson per un aiuto con microscopia confocale. Questa ricerca è stata sostenuta dalle concessioni dal National Institutes of Health 1RO1CA127501 a WAB, nonché al progetto di finanziamento pilota della Massey Cancer Center e la Scuola di Medicina (VCU) a Microscopia WAB è stato eseguito presso il VCU-Dipartimento. di Neurobiologia e Microscopia Fondo Anatomia, sostenuta, in parte, con il finanziamento NIHNINDS Centro nucleo concedere 5P30NS047463.

Il protocollo si compone di tre fasi principali. Il primo, la clonazione fase del gene di interesse in un vettore di espressione mammifero amino-terminale per le versioni monomerico della PCP e / o YFP sarà solo discusso brevemente. I passi secondo e terzo; trasfezione di DNA vettore in EA.hy926 cellule endoteliali, e di imaging confocale con FRET, sono descritti più approfonditamente di seguito. 1. Costruzione di recettori PCP e YFP Chimerico Recettori di interesse dovrebbero essere clonato amino-terminale di monomerico versioni avanzate dei CFP e YFP. Determinazione del FRET è empirica e critica è dipende dalla lunghezza del linker tra i transmembrana spanning regione e inizio del fluoroforo 1. Pertanto diverse lunghezze differenti linker deve essere esplorata per ogni coppia recettore nuovo sotto inchiesta. <ol><li> Nel hygro pcDNA3.1 R o neo vettore R contenente monomerica C o YFP (questo vettore può essere ottenuto dal nostro laboratorio), il tuo clone del recettore di interesse nel NheI / EcoRI siti. * Nota: se necessario, NheI è compatibile enzimi diversi altri tra cui SpeI e XbaI. </li><li> Trasforma la tua reazione legatura in una appropriata linea cellulare endA1 recA competenti (si usano abitualmente Mach1). Colonie schermo per la presenza di inserire seguita da sequenziamento del DNA per verificare l'assenza di mutazioni. </li><li> All'ottenimento conformazione di successo della clonazione molecolare, preparare trasfezione-grade vettore di DNA in acqua sterilizzata o TE utilizzando Qiagen, o simili, kit del DNA. Valutare la concentrazione e la purezza utilizzando la spettroscopia UV. Le rese del DNA dovrebbe essere nel range di 100-200 mg, che viene normalmente diluito a uno stock di lavoro di 1 mg / mL. </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule EA.hy 926 <ol><li> Split EA.hy 926 celle 4, coltivate in DMEM completo-(DMEM +10% siero fetale bovino + Pen. / Strep.) In MatTek coprioggetto (n. 0) 35 piatti mm con 2 ml di mezzo. Si può ottenere conservativo ~ 15 piatti (~ 90% confluenti del giorno successivo) da un piatto di 15 centimetri confluenti. Preparare un piatto di valutare l'espressione del recettore di ogni individuo, così come un piatto per ogni coppia recettore. </li><li> Permettono alle cellule di incubare una notte in 5% CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C. Il giorno seguente, le colture dovrebbero essere confluenti ~ 70-90%. </li><li> Il giorno della transfezione, preparare i complessi nucleolipid mescolando 2 mg di DNA chimerico vettore recettore (2 mL) con 8 ml di Fugene6 in 200 ml di pre-riscaldato OptiMEM. Per le coppie di recettori, trasfezione con 1 mg di ogni recettore, per un totale di 2 mg (Vedi anche la discussione sotto). </li><li> Mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Continuare a incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Durante il periodo di incubazione, preparare le cellule per la trasfezione. Aspirare off mezzi freschi e lavare ogni piastra delicatamente e brevemente con PBS caldo prima l'aggiunta di 2 ml preriscaldata completa-DMEM senza antibiotici (DMEM + FBS). E 'importante evitare la presenza di penicillina e streptomicina, in quanto sono molto più tossici per le cellule durante il trattamento con Fugene6. </li><li> Aggiungere la goccia complesso saggio cellule e incubare per ulteriori 20-24 ore a 37 ° C in un 5% di CO 2 nell'atmosfera. </li><li> Dopo 24 ore, con attenzione ai media di aspirare le cellule e pipetta fresca completa-DMEM con antibiotici. A seguito di trasfezione, la vitalità cellulare dovrebbe rimanere relativamente alti, cioè poco o nessun cellule galleggianti devono essere osservati. </li><li> L'espressione genica è tipicamente massima dopo un ulteriore 48-60 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, l'imaging è solitamente possibile nel più breve di 24 ore. Esperimenti di durata del corso per l'espressione genica ottimale dovrebbe essere eseguita. </li></ol> 3. Imaging confocale e analisi FRET Vivere l'imaging cellulare è eseguita su un TCS-SP2 laser Leica AOBS microscopio confocale a scansione dotato di diodo blu (405 nm), argon (458, 476, 488, 514 nm). HeNe verde (543 nm), arancio HeNe (594 nm), e rosso HeNe (633 nm), un HCX PI Apo 63x/1.3 na glicerina-immersion lente dell'obiettivo, un motorizzato XY (Märzhäuser), e un ambiente controllato ( temperatura, umidità e CO 2) fase di incubatore (Pecon). Controlli sperimentali sono fondamentali per eliminare fluoroforo cross-talk tra i canali di emissione, nonché per valutare i problemi di espressione e non specifici multimerization fluoroforo. Come tale, trasfezioni fluoroforo singole sono utilizzate per l'impostazione di ogni sessione di immagine. Negativo FRET controlli (con nota recettori non interagenti) dovranno essere eseguite, al fine di determinare lo sfondo FRET che si verifica a causa di espressione oltre. <ol><li> Per eliminare le interferenze tra i canali di emissione per PCP e YFP, posizionare il controllo della PCP espressione nell'incubatore palco. Utilizzando luce bianca, regolare la Z-piastra di concentrarsi sullaalle cellule. </li><li> Impostare la finestra delle impostazioni SP per il rilevamento delle emissioni di PCP a 465-505 nm e YFP di 525-600 nm. </li><li> Tenendo sotto controllo i due canali di emissione, eccitare la PCP a 458 nm. Utilizzando il AOTF, impostare la potenza del laser per eliminare sanguinare apprezzabile rispetto della politica comune della pesca nel canale di emissione YFP. Salva questa impostazione. </li><li> Eseguire lo stesso controllo per YFP crosstalk (utilizzando il controllo YFP espressione) nel canale PCP regolando la potenza di eccitazione a 514 nm per le cellule che esprimono YFP solo. Salva questa impostazione. </li><li> Cellule prossimo luogo co-esprimono PCP e YFP nell'incubatore palco. Utilizzando l'impostazione sequenza per il software Leica confocale, individuare cellule che esprimono livelli simili di PCP e YFP con la localizzazione di membrana adeguato. </li><li> Utilizzando il software Leica accettore fotometabolismo programma, configurare le impostazioni di donatore e accettore al CFP salvate e le impostazioni YFP, rispettabile. </li><li> Zoom sul cellulare, evidenzia un ROI (regione di interesse) in cui la foto-distruzione di YFP deve avvenire sulla membrana cellulare e avviare il programma. </li><li> Per foto-distruzione del accettore, regolare il AOTF al 100% a 514 nm e consentono il laser sbiancante per continuare fino al 70% delle emissioni di YFP è stato impoverito. Per accelerare il candeggio, ROI sono scelti tipicamente nell'asse raster del laser (asse X). </li><li> Durante fotometabolismo, monitorare il movimento cellulare e rifiutare misurazioni ottenute con il movimento apprezzabile nel piano XY, in quanto tali misure possono rapporto falso FRET efficienza. </li><li> Immagini pre-e post-candeggina sono registrati sia per i donatori (PCP) e accettore (YFP) e FRET efficienza viene calcolata come: FRET Eff = (D post-D pre) / D post per tutti i messaggi D&gt; D dove D pre pre e D post è l'intensità donatore prima e dopo photobleaching rispettivamente. </li><li> Software JMP (SAS) è usato per determinare il grado di variabilità sperimentale. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Efficienze di trasfezione sono di solito tra il 30 e il 40%. Nonostante i risultati precedenti da altri, non abbiamo visto che la trasfezione ed espressione di un vettore favorisce quella degli altri. Anzi, spesso ci osservano espressione esclusiva di una fluoroforo chimera o l'altro. Tipico FRET efficienze variano tra sistemi recettoriali. Per il sistema recettore Tie, valori tipici sono 20-28% per le cellule epiteliali e 19-23% nelle cellule endoteliali. Per i controlli negativi, l'efficienza tipica sono al di sotto del 2-3%. Il grado di variabilità si riduce notevolmente con l'esperienza. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immagini rappresentative del transfettate EA.hy 926 cellule. A) immagine DIC di EA.hy 926 monostrato cellulare. B) l'immagine di fluorescenza di cellule visualizzati in (A). C) Sovrapposizione di (A) e (B) che dimostrano l'efficienza di trasfezione ~ 20-30%. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Accettore rappresentante fotometabolismo analisi di FRET si verificano tra CFP e YFP in una cella EA.hy926. La PCP emissione canale (pannelli in alto) e YFP emissione di canale (in basso due pannelli) sono stati monitorati separatamente, prima e dopo photobleaching accettore. Fotodecolorazione esperimenti sono stati limitati a, e FRET valori calcolati da, la regione all'interno della scatola verde. FRET efficienza viene visualizzato come un campo da assoluto alto (rosso-1.0) a bassa (viola-0.0) su una sovrapposizione ingrandita di una PCP / YFP fusa immagine a scopo orientativo solo.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono diversi passaggi che sono cruciali per il successo. Il più importante tra questi è il livello relativo di espressione tra i due recettori chimerici. Per aggirare questo problema, si può fare linee cellulari stabili che esprimono entrambe le proteine ​​di interesse, o identificare i rapporti ottimali di DNA vettore per consentire l&#39;espressione equivalente. Allo stesso modo, a causa della non uniforme transfezione in un piatto, i livelli di proteina sarà raramente equivalente tra le cellule. Pertanto, si deve fare attenzione a distinguere &#39;alta&#39; expressors dal &#39;basso&#39;. Quelli che i livelli di &#39;medio&#39; di visualizzazione di proteine ​​tipicamente resa affidabile e riproducibile FRET efficienza. Un metodo nostro laboratorio ha perseguito per alleviare questo problema è l&#39;uso di adeno-virus e Lenti a &#39;anche&#39; l&#39;espressione genica. Inoltre, un metodo alternativo per accettore fotometabolismo per determinare l&#39;efficienza FRET è emissione sensibilizzata. Anche se, nonostante il potenziale di emissione sensibilizzati a controllare singole cellule in tempo reale, abbiamo trovato accettore fotometabolismo ad essere più sensibili e più affidabile. Infine, utilizzando FRET di monitorare le interazioni proteina può essere impegnativo, e richiede una attenta selezione delle lunghezze linker per i recettori di membrana legato. Inoltre, l&#39;aggiunta di C / YFP spesso influenza notevolmente i livelli di espressione della proteina e si traduce in aggregazione nel reticolo endoplasmatico e apparato di Golgi. Tuttavia, per le interazioni transitori o instabile,, FRET è la metodologia ideale da utilizzare.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con coprivetrino</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Cellule competenti Mach 1</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging interazioni proteina-proteina in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Interazioni proteina-proteina sono una caratteristica di tutti i processi cellulari fondamentali. Tuttavia, molte di queste interazioni sono transitori, o energeticamente deboli, impedendo la loro identificazione e analisi attraverso i tradizionali metodi biochimici come la co-immunoprecipitazione. A questo proposito, le proteine ​​geneticamente codificabili fluorescente (GFP, RFP, ecc) e le loro associate sovrapposizione spettro di fluorescenza hanno rivoluzionato la nostra capacità di monitorare le interazioni deboli in vivo, utilizzando Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 1-3. Qui, noi dettaglio il nostro uso di un saggio basato su FRET di prossimità per il monitoraggio recettore-recettore sulla superficie delle cellule endoteliali.

Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Le interazioni proteina-proteina sono un tratto distintivo di tutti i processi cellulari essenziali. Tuttavia, molte di queste interazioni sono transitorie, o energeticamente deboli, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la presenza di interazioni proteina-proteina sulla superficie cellulare. Questo viene ottenuto clonando due recettori di interesse, ciascuno in fuzione C-terminale a due fluorofori con spettri di emissione sovrapposti, come secondo passaggio. I due vettori vengono quindi trasfettati simultaneamente in cellule endoteliali per l'espressione dei recettori.A questo punto, i fluorocromi aiutano a valutare l'entità complessiva dell'espressione nonché la localizzazione del recettore. Successivamente, i parametri di acquisizione delle immagini vengono stabiliti utilizzando una singola trasfezione come controllo al microscopio confocale. Singolarmente, le cellule trasfettate vengono selezionate in base ai loro livelli relativi di espressione e localizzazione del recettore.Successivamente, vengono acquisite immagini di regioni all'interno di queste cellule al fine di valutare l'entità dei risultati ottenuti con la tecnica FRET. Tali risultati mostrano interazioni di tipo tie one e tie two sulla superficie delle cellule endoteliali, basate su FRET e microscopia confocale. Ciao, sono Tom Seger del laboratorio del Dott. William Barton del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare della Virginia Commonwealth University.Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare le interazioni tra proteine in cellule endoteliali mediante microscopia confocale basata su FRET. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnica per studiare le interazioni tra recettori durante l'angiogenesi. Cominciamo dunque.Per visualizzare le interazioni proteina-proteina mediante un saggio di prossimità basato sul trasferimento di energia di risonanza (FRET), iniziare clonando i recettori di interesse nei siti NHE1 ed EcoR1 del vettore pcd, un vettore hydro o neo 3.1 contenente CFP o YFP monomerici. La determinazione del FRET è empirica e dipende criticamente dalla lunghezza del linker tra la regione transmembrana e l'inizio del fluoroforo. Pertanto, devono essere esplorati diversi tipi di linker per ogni nuova coppia di recettori in esame. Trasformare e amplificare i vettori seguendo il protocollo allegato.Quindi preparare il DNA di qualità per la trasfezione, trasformare e amplificare i vettori secondo il protocollo allegato. Successivamente, preparare il DNA di qualità per la trasfezione e diluirlo a una concentrazione lavorativa di un microgrammo per microlitro per preparare le cellule alla trasfezione sotto una cappa a flusso laminare. Suddividere le cellule EAHY 926 coltivate in DMEM completo in piatti da 35 millimetri con coprislips, utilizzando due millilitri di mezzo. Preparare un piatto per valutare l'espressione di ciascun recettore singolo e un piatto aggiuntivo per ogni coppia di recettori.Lasciare le cellule incubare in un'atmosfera con oltre il 95% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per il giorno successivo. Il giorno della trasfezione, la coltura dovrebbe raggiungere una confluenza compresa tra il 70 e il 90%. Preparare i complessi nucleolipidici mescolando due microgrammi di DNA del vettore del recettore chimera con otto microlitri di Fuji N HD in 200 microlitri di Opti-MEM preriscaldato; per le coppie di recettori, trasfettare un microgrammo di ciascun recettor, per un totale di due microgrammi, mescolando delicatamente per inversione e lasciando incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Durante il periodo di incubazione, preparare le cellule per la trasfezione aspirando il mezzo fresco e lavando delicatamente e brevemente ogni piastra con PBS tiepido prima dell'aggiunta di due millilitri di DMEM completo pre-riscaldato senza antibiotici. È importante evitare la presenza di penicillina e streptomicina poiché risultano notevolmente più tossiche per le cellule durante il trattamento. Aggiungere goccia a goccia il complesso contenente il gene FU alle cellule e incubare per ulteriori 20-24 ore. Dopo 24 ore, aspirare con attenzione il mezzo dalle cellule e aggiungere mezzo DMEM completo fresco con antibiotici a seguito della trasfezione.La vitalità cellulare dovrebbe rimanere relativamente elevata. Si dovrebbero osservare poche o nessuna cellula in sospensione. Per eseguire l'immagineggiamento di cellule vive, utilizziamo un microscopio confocale a scansione laser A-T-C-S-P two A OBS dotato di laser a diodo blu al argon e laser al neon elio verdi, arancioni e rossi, un obiettivo H-C-X-P-I-A-O 63x 1,3 NA a immersione in glicerina, un piatto motorizzato XY e un incubatore per piatto con controllo di temperatura, umidità e anidride carbonica.I controlli sperimentali sono fondamentali per eliminare il crosstalk tra i canali di emissione dei fluorocromi, nonché per valutare problemi di espressione e la marcatura non specifica con il fluorocromo. Pertanto, vengono utilizzate trasfezioni singole con fluorocromo per impostare ogni sessione di acquisizione immagini, al fine di eliminare il crosstalk tra i canali di emissione di CFP e YFP. Posizionare il controllo di espressione di CFP nell'incubatore sul palchetto utilizzando luce bianca.Regolare la piastra Z per mettere a fuoco le cellule. Impostare le finestre SP per il rilevamento dell'emissione di CFP da 465 a 505 e di YFP da 525 a 600 nanometri, monitorando contemporaneamente entrambi i canali di emissione, ed eccitare il CFP a 458 nanometri. Utilizzando l'A OTF, regolare la potenza del laser per eliminare il passaggio apprezzabile di CFP nel canale di emissione di YFP.Salvare questa impostazione. Eseguire lo stesso controllo per la fuoriuscita di YFP nel canale CFP regolando la potenza di eccitazione a 514 nanometri. Le cellule che esprimono solo YFP, salvare questa impostazione.Successivamente, posizionare le cellule coesprimenti CFP e YFP nell'incubatrice dello strumento. Utilizzando l'impostazione sequenziale del software confocale LICO, individuare le cellule che esprimono livelli simili di CFP e YFP con una corretta localizzazione membranare mediante il software LICO, escludendo un programma software di foto-sbiancamento.Impostare le impostazioni del donatore e dell'accettore rispettivamente sulle proprie impostazioni salvate per CFP e YFP. Ingrandire la cellula, evidenziare una regione di interesse o ROI in cui deve avvenire la foto-distruzione di YFP sulla membrana cellulare e avviare il programma per la foto-distruzione dell'accettore. Regolare l'A OTF al 100% di 514 nanometri e lasciare proseguire il fotoblesciamento con il laser fino a quando l'emissione di YFP non si sarà ridotta del 70%.Per accelerare lo sbiancamento, le ROI vengono tipicamente scelte lungo l'asse raster del laser durante la fotobleach. Monitorare il movimento cellulare e scartare le misurazioni ottenute con un movimento apprezzabile nel piano XY. Poiché queste misurazioni possono riportare efficienze FRET false, vengono registrate immagini prima e dopo lo sbiancamento sia per il donatore che per l'accettore, e l'efficienza FRET viene calcolata come efficienza FRET uguale a (intensità post-bleach del donatore meno intensità pre-bleach del donatore) diviso per intensità post-bleach del donatore, per tutti i valori di intensità post-bleach del donatore maggiori dell'intensità pre-bleach del donatore, dove D pre e D post sono rispettivamente le intensità del donatore prima e dopo la fotobleach.JMP viene utilizzato per determinare il grado di variabilità sperimentale. I singoli recettori dovrebbero essere fusi sia a CFP che a YFP con lunghezze variabili di sequenza giuxtamembrana. Per identificare la migliore coppia possibile di partner recettoriali per FRET, le efficienze di trasfezione sono tipicamente comprese tra il 30 e il 40%, nonostante risultati precedenti ottenuti da altri autori.Non abbiamo osservato che la trasfezione e l'espressione di un vettore favoriscano quella dell'altro. Di fatto, osserviamo frequentemente l'espressione esclusiva di una delle due flora, specchio KY o l'altra. Queste immagini rappresentative mostrano un'analisi di fotobleaching dell'accettore di un fenomeno di trasferimento di energia di risonanza (FRET) tra CFP e YFP in una cellula EAHY 9 26.I canali di emissione di CFP e YFP sono stati monitorati separatamente prima e dopo il fotoblesciamento, e i calcoli sono stati limitati alla regione all'interno del riquadro rosso. L'efficienza FRET è mostrata come un intervallo assoluto che va da valori elevati (colorati di rosso) a 1,0 a valori bassi (colorati di viola) a zero, sovrapposti in ingrandimento all'immagine fusa A-C-F-P-Y-F-P, esclusivamente a scopo orientativo per il sistema del recettore T. I valori tipici di efficienza FRET sono compresi tra il 20 e il 28% per le cellule epiteliali e tra il 19 e il 23% per le cellule endoteliali, come mostrato qui.Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede tipicamente da tre a quattro giorni se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la lunghezza del linker tra la proteina bersaglio e la proteina fluorescente di fusione, così come i loro livelli di espressione e il movimento cellulare, influenzano direttamente la misurazione FRET successiva alla procedura. Inoltre, possono essere eseguiti saggi biochimici relativi all'attivazione del segnale al fine di ottenere informazioni sui percorsi di trasduzione del segnale dopo il loro sviluppo.Questa tecnica fornisce un saggio in cui è possibile studiare interazioni proteina-proteina che sono deboli o transitorie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del modo in cui eseguire autonomamente saggi di prossimità basati su FRET in cellule vive. E non dimenticare che quando si lavora con cellule in coltura tissutale, è sempre necessario seguire adeguate precauzioni di sicurezza.Grazie quindi per aver guardato e buona fortuna con i vostri futuri esperimenti con il fret.

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