Name: Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Impara a coltivare embrioni di pollo ex-ovo per studi di embriogenesi con accesso ottico completo. Questa tecnica consente microiniezioni, imaging e microchirurgia in biologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Ex-ovo Cultura protocollo: <ol><li> Incubare uova di gallina fecondate <ol class="lroman"><li> Uova di gallina fecondate possono essere conservati a 13 ° C fino a 5 giorni prima di incubazione senza avviare lo sviluppo. Un raffreddamento di vino rosso in grado di mantenere questa temperatura. </li><li> Incubare le uova lato smussato in un incubatore di umidità del 60% costante con dondolo continuo a 37,5 ° C per 72 ore. </li></ol></li><li> Preparare amache (Figura 1a) <ol class="lroman"><li> Riempire ¾ di 9 bicchieri di plastica oz con acqua calda sterile. Un regolare 9 oz tazza ha un diametro superiore di 8 cm. Abbiamo scoperto che queste dimensioni era più adatto per l'applicazione della cultura lungo tempo presentato qui. </li><li> Taglio di circa 20 cm pellicola trasparente. Circonferenza apporre sulla parte superiore della coppa mettendo un elastico intorno. Plastica dovrebbe essere ripartito in cima l'acqua. Tagliare la plastica in eccesso intorno alla band. Abbiamo trovato pellicola trasparente per essere più appropriato per questa applicazione in quanto impedisce l'adesione del tuorlo, con conseguente suddivisione tuorlo durante il trasporto. </li><li> Pulire la plastica con Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) bagnate con il 70% di etanolo. </li></ol></li><li> Rimuovere le uova da incubatrice dopo 72 ore di incubazione. </li><li> Sterilizzare le uova strofinando la superficie con etanolo al 70% Kimwipes bagnata. </li><li> Deporre le uova in orizzontale per 1-2 minuti per il corretto posizionamento degli embrioni (Figura 1b). Una scatola di uova può essere utilizzato per deporre le uova in orizzontale. Gli embrioni ruoterà verso l'alto dopo 1-2 minuti. </li><li> Trasferimento degli embrioni su amache in modo asettico in una cappa a flusso laminare. <ol class="lroman"><li> Usando un bordo tagliente (come il bordo di un secchio di metallo o di un bicchiere di vetro), toccare delicatamente l'uovo fino a quando vi è una piccola ammaccatura sul lato inferiore delle uova (Figura 1c). Ricordate, l'embrione è posizionato sulla superficie superiore. </li><li> Mettete i pollici in lati opposti della ammaccatura e tirare i gusci a parte in orizzontale (Figura 1d). </li><li> Mettere il tuorlo con embrione così come l'albumina sulla amaca (figura 1e). Albumina fornirà un ambiente di smorzamento intorno al tuorlo di assorbire gli shock indotto spostando il sistema così come fornisce nutrimento all'embrione per le pratiche della cultura lungo. Acqua sotto l'amaca garantirà l'embrione rimane parallelo al terreno durante il trasporto e fungere da conduttore di calore durante l'imaging se un riscaldatore a circolazione d'acqua è usato. </li><li> L'embrione deve essere già posizionato sulla parte superiore se il trasferimento viene effettuato correttamente. In caso contrario, utilizzare un contrasto, un oggetto sterile (es. Blunt punta di forbici curve chiuse) e direzionale accarezzare il tuorlo in modo che l'embrione ruota verso l'alto. </li><li> Posizionare un diametro di 10 centimetri piatto Petri in cima alla coppa per sigillare l'embrione. </li></ol></li><li> Luogo cultura tazza in incubatore a 37,5 ° C. Se un incubatore portatile è usato, ponendo 01-02 settembre tazze oz riempita con acqua distillata mantiene l'umidità a ~ 60% (Fig. 1f). </li><li> Se gli embrioni al di là di coltura embrionale giorni 7, pezzi di guscio d'uovo tritato devono essere sparsi per la periferia dell'embrione come fonte di calcio per lo sviluppo e la maturazione delle ossa. </li></ol> Equipaggiamento accessorio per esterno incubatore di imaging / manipolazione: Un bagno d'acqua in circolo è stato costruito in casa per mantenere la temperatura di incubazione, mentre imaging o manipolazione (Figura 3). Un bagno d'acqua che può andare bene la coppa è collegato tramite tubazione dimensioni adeguate ad un serbatoio d'acqua. Un riscaldatore resistenza riscalda l'acqua nel serbatoio, che viene regolata manualmente seguendo la temperatura dell'acqua. Una pompa acqua circola l'acqua. Rappresentazione pittorica raffigura la facilità di imaging tramite ultrasongraphy / microscopia florescent (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparazione di amaca e il trasferimento di embrioni di pollo al amache. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi -. Diversi embrioni di pollo fase cresciuta attraverso la cultura tecnica ex ovo embrioni da SS 17 in poi possono essere coltivate attraverso questa tecnica. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagini schematiche e rappresentante del sistema di circolazione dell'acqua utilizzata in congiunzione con l'ex-ovo sistema di coltura per mantenere gli embrioni a temperatura ideale di sviluppo. 2. Applicazioni selezionato: I. Microiniezione Questa cultura embrione è adatto per applicazioni microiniezione in cui le soluzioni devono essere iniettati per l'imaging vascolare di contrasto a base (es. microscopia a fluorescenza, micro-topografia computerizzata, ecc) (Figura 4). Di seguito è riportato il protocollo microiniezione: <ol><li> Preparare il apparec iniezionetus <ol class="lroman"><li> Moda tirato 0,75 tubi di vetro capillari ID in microaghi punta smussata con un microforge. Dimensioni della punta richiesta dipende vena obiettivo diametro / portata desiderata. </li><li> Collegare la siringa a 0,03 pollici tubo in silicone ID. </li><li> Caricare il tubo con la soluzione da iniettare e collegare il microago al tubo. </li><li> Posizionare il microago sul micromanipolatore e siringa titolare siringa o pompa a siringa. </li></ol></li><li> Aggiungere acqua sterile in tazza in modo da accrescere l'embrione. Abbiamo sperimentato che per la penetrazione corretta dell'ago in un vaso sanguigno (es. vasi vitellina), la penetrazione orizzontale è necessario. Ciò richiede l'embrione di essere sullo stesso piano, come i bordi della tazza. <ol class="lroman"><li> Estrarre l'elastico tenendo la plastica sotto l'embrione. </li><li> Sollevare un lato della plastica delicatamente e aggiungere un po 'di acqua sterile per la coppa. </li><li> Fissare l'elastico sulla plastica di nuovo. </li></ol></li><li> Iniettare la soluzione di un vaso embrionale. Nella nostra esperienza, quando la soluzione viene iniettata a una nave vitellina, microaghi doveva essere di dimensioni ° circa 1 / 10 del diametro del vaso per mantenere la perfusione efficace senza causare sanguinamento. <ol class="lroman"><li> Pompa la soluzione per il microago garantendo l'assenza di formazione di bolle d'aria. </li><li> Allineare la punta del microago sulla nave selezionata. Per le navi vitellina, selezionando un'area forchetta darà superficie massima di penetrare la nave. </li><li> Spingere l'ago verso la nave. La nave per prima ritrattare. Una volta che l'ago penetra, avviare perfusione. Il colore del sangue che scorre dovrebbe cambiare con perfusione. Se il cambiamento di colore non si vede, l'ago potrebbe essere penetrato dalla nave. In questo caso, ritirare lentamente il microago allo stesso tempo la soluzione di pompaggio fino a cambiare colore nel vaso si vede. Una volta che la perfusione è completo, ritirare il microago fuori dal vaso. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: microiniezione di un colorante fluorescente nel sistema vascolare di un ex-ovo-embrione di pollo in coltura. II. Microchirurgico Procedura - Sinistra Legatura atriale Questo ex-ovo configurazione cultura è l'ideale per l'esecuzione di applicazioni chirurgiche di embrioni di pollo in quanto fornisce la piena accessibilità per l'embrione. Di seguito è riportato il protocollo per una tecnica, ad esempio, la legatura atriale sinistro (LAL) (Figura 5). La procedura viene eseguita circa 24 ore nel periodo di coltura (HH24): <ol><li> Preparare overhand nodi ~ 0,5 mm di diametro con 10-0 sutura chirurgica nylon. </li><li> Con una pinza sottile, localmente rimuovere le membrane coriali e allantoide oltre l'embrione e sollevare l'embrione dal retro per ruotare verticalmente in modo tale che il lato sinistro dell'embrione è visibile. </li><li> Utilizzando una pinza sottile, rimuovere il pericardio sopra l'atrio sinistro. </li><li> Allineare il nodo sopra l'atrio sinistro e stringerlo. Il nodo dovrebbe essere legata in modo da vietare ~ 75% del flusso di sangue originale sul lato sinistro. Tagliare i bordi del nodo con microscissors e rimuovere con cautela e scartare sutura in eccesso. </li><li> Ruotare l'embrione al suo orientamento originale (lato destro in alto). </li><li> Controlli Sham coinvolgerà la stessa procedura, ma la sutura sarà solo attraversato e non legato. Efficace trattamento LAL (75 costrizione%) sarà confermato a 24 ore dopo la chirurgia, e gli embrioni squalificato saranno esclusi. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5:. Un controllo e una sinistra embrione atriale pulcino legatura Arrow mostra gli atri sinistra, che è circa il 75% più piccolo nell'embrione legato.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Accesso ottico e sperimentazione negli embrioni aviaria è una sfida a causa dei vincoli del guscio d&#39;uovo. Windowing limita in modo significativo il numero di accesso per gli approcci di iniezione e microchirurgia 8 microvasi. Di conseguenza solo gli embrioni precoci possono essere manipolati e costante osservazione non è possibile. Primi ex-ovo culture utilizzando piastre di Petri erano di uso limitato a causa di un inadeguato controllo della tensione superficiale sull&#39;embrione impedito a lu...

<table><tbody><tr><td>Uova di gallina Leghorn bianca feconde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modello GB1, forni di incubazione Avery Incubators, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile calda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere di plastica da 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto di Petri da 100 mm di diametro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria termica 1602N</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destrano coniugato con fluoresceina (2 MDa, 1% p/v in soluzione salina fosfato tampone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforno</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillari di vetro (0,75 mm di diametro interno)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modello M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini da 55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgico in nylon 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulazione</td><td>VWR international</td><td></td><td>1 mm di diametro esterno</td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 200 &amp;mu;L e punte per pipetta</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ex-ovo sistema di embrioni di pollo cultura adatto per applicazioni di imaging e microchirurgia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Comprendere le relazioni tra fattori genetici e microambientali che guidano normali e malformate sviluppo embrionale è fondamentale per scoprire nuove strategie terapeutiche. I progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso indagine quantitativa dell&#39;organizzazione e della maturazione del piano di corpo, ma una fase successiva morfogenesi embrionale è meno chiara. Embrioni di pollo sono un interessante modello animale vertebrato sistema per questa applicazione a causa della sua facilità di cultura e di manipolazione chirurgica. Embrioni precoci possono essere coltivate per un breve periodo su anelli carta da filtro, che permette l&#39;accesso completo ottici per patterning cellulare e il destino 1,2 studi. Lo studio dei processi avanzati dello sviluppo come morfogenesi cardiaca sono tradizionalmente svolte attraverso una finestra del guscio 3-5, ma questa tecnica limita l&#39;accesso ottico a causa delle dimensioni della finestra. Abbiamo già messo a punto un metodo semplice per la cultura embrioni interi franco-ovo su esagonale pesare imbarcazioni fino a 10 giorni, che ha permesso di imaging ad alta risoluzione tramite ecografia 6,7. Queste culture sono state difficili da trasportare, limitando i tipi di strumenti di imaging disponibili per esperimenti dal vivo. Noi qui presenti una migliore senza guscio sistema di coltura con un costo-efficace, camera portatile ambientale. Uova erano incrinate su un amaca creato da una membrana poliuretanica (pellicola trasparente) apposto la circonferenza un bicchiere di plastica parzialmente piena d&#39;acqua sterile. Le dimensioni della circonferenza e la profondità della amaca erano entrambi critici per mantenere la tensione superficiale, mentre la meccanica del amaca e acqua sotto aiutato smorzare le vibrazioni indotte dal trasporto. Un piccolo ingombro circolante bagno d&#39;acqua è stato anche sviluppato per consentire un controllo continuo della temperatura durante la sperimentazione. Dimostriamo la capacità di embrioni cultura in questo modo per almeno 14 giorni senza difetto morfogenici o ritardi ed impiegare questo sistema in microchirurgia diversi e applicazioni di imaging.

In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo termine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Cultura embrione aviaria. Questa tecnica è ideale per la sperimentazione longitudinale che richiedono una completa accessibilità ottici e / o il trasporto sterile negli embrioni aviaria.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Comprendere le relazioni tra i fattori genetici e microambientali che guidano lo sviluppo embrionale normale e malformato è fondamentale per ...

Nel sistema di coltura embrionale del pollo in ovo, la preparazione di colture embrionali di pulcino con guscio consente lo studio dell'embriogenesi. Il procedimento inizia con l'acquisto e l'incubazione di uova di pollo fecondate a 37,5 gradi Celsius per 72 ore. Vengono quindi preparati degli amache per sostenere i tuorli delle uova con gli embrioni in via di sviluppo.Successivamente, i tuorli d'uovo possono essere trasferiti su amache e l'embriogenesi prosegue all'esterno del guscio. Questa tecnica può essere applicata per microiniezioni nel sistema vascolare, ecografia ad ultrasuoni e microchirurgia, e i risultati possono mostrare come gli embrioni si sviluppano in condizioni normali e alterate. Ciao, mi chiamo Akshay Shaker e sono uno studente magistrale nel laboratorio di bioingegneria dello sviluppo cardiovascolare diretto da Jonathan Butcher presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Cornell University.E il principale vantaggio della nostra tecnica rispetto ai metodi precedenti, come la coltura dell'uovo in ovo, è che fornisce un completo accesso ottico all'embrione e facilità di trasporto senza danni. Salve, mi chiamo Char Hin. Sono un ricercatore postdottorato presso il Laboratorio di Bioingegneria dello Sviluppo Cardiovascolare, laboratorio di Jonathan Chu, del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Cornell University.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, ad esempio in che modo si sviluppano i difetti cardiaci durante l'embriogenesi. Prima di iniziare la procedura, sterilizzare tutti i materiali passandoli con etanolo al 70%. Per iniziare la procedura, riempire tre quarti di un bicchiere di plastica da nove once con acqua sterile tiepida.Ripetere per un numero di bicchieri necessario. Un bicchiere standard da nove once ha un diametro superiore di otto centimetri, che è la dimensione più adatta per l'applicazione di coltura prolungata qui presentata. Successivamente, tagliare un pezzo di pellicola trasparente lungo 20 centimetri.Coprire la parte superiore del bicchiere di plastica da nove once riempito con acqua sterile calda con un pezzo di pellicola trasparente, e utilizzare un elastico per fissare la pellicola al suo posto. La pellicola trasparente è la più adatta per questa applicazione poiché impedisce l'adesione del tuorlo, che potrebbe causare la rottura del tuorlo. Durante il trasporto, la pellicola deve essere stesa in modo da toccare la superficie dell'acqua.Tagliare la plastica in eccesso intorno alla fascia e pulire la superficie in plastica. Utilizzando salviette Kim imbevute di etanolo al 70%, gli amache sono ora pronte a sostenere gli embrioni. Le uova di pollo fecondate possono essere conservate a 13 gradi Celsius fino a cinque giorni prima dell'incubazione.Senza attivare lo sviluppo, un refrigeratore per vino rosso può mantenere questa temperatura per avere le uova pronte per la coltura. Attivare lo sviluppo dell'embrione incubando le uova in posizione orizzontale in un incubatore con umidità costante al 60% con movimento oscillante continuo a 37,5 gradi Celsius per 72 ore. Quando le uova sono pronte, rimuoverle dall'incubatore.Sterilizzare le uova passando con salviette Kim imbevute di etanolo al 70%. Disporre le uova orizzontalmente su un lato in un portauova per uno o due minuti per garantire un corretto posizionamento dell'embrione. Lavorare con un massimo di sei uova alla volta, poiché tentare di rompere più di sei uova contemporaneamente risulta difficoltoso.Potrebbe provocare un mantenimento eccessivo della temperatura ambiente in uscita, il che può compromettere la vitalità. Al termine di uno o due minuti, l'embrione si è spostato nella parte superiore dell'uovo. Per trasferire ciascun embrione su un'amaca, lavorare in modo asettico all'interno di una cappa a flusso laminare.Per prima cosa, rompere delicatamente la parte inferiore dell'uovo utilizzando un bordo affilato, come il bordo di un secchio metallico o di un becher di vetro. Ricordare che l'embrione si trova sul lato superiore. Separare delicatamente le due metà del guscio dell'uovo tirando ai lati con i due pollici.Quindi posizionare l'embrione, il tuorlo e l'albume sulla rete. L'albume fornisce un ambiente umido attorno al tuorlo, assorbendo gli urti causati dal movimento del sistema. L'albume fornisce inoltre nutrimento all'embrione durante il lungo periodo di coltura.Se il trasferimento dell'embrione viene eseguito correttamente, l'embrione dovrebbe trovarsi già nella posizione superiore. Se l'embrione si trova nella parte inferiore, utilizzare forbici piccole a curva chiusa o un altro strumento ottuso simile per sfregare il tuorlo in modo che ruoti su se stesso e l'embrione si sposti nella parte superiore. Se si coltivano embrioni oltre il settimo giorno embrionale, disporre frammenti di guscio d'uovo tritati attorno alla periferia dell'embrione come fonte di calcio per lo sviluppo e la maturazione delle ossa.Al termine del trasferimento dell'embrione, posizionare una piastra di Petri di 10 centimetri di diametro sopra il bicchiere per sigillare l'embrione. Collocare l'amaca nell'incubatrice impostata a 37,5 gradi Celsius. Se si utilizza un'incubatrice portatile, inserire nell'incubatrice uno o due bicchieri da nove once riempiti di acqua.Per mantenere l'umidità a circa 60%, gli embrioni continuano a svilupparsi e possono essere utilizzati per microiniezioni in applicazioni microchirurgiche. Questa coltura embrionale è adatta per applicazioni di microiniezione in cui è necessario iniettare soluzioni nella vascolarizzazione. Preparare innanzitutto l'apparato di iniezione, partendo dagli aghi, modellando con una microfiamma tubi capillari di vetro, tirandoli fino a formare micropunture con estremità smussata.La dimensione della punta dipende dalla portata desiderata. Collegare la siringa con micropuntura a un tubo di silicone con diametro interno di 0,03 pollici. Riempire il tubo della siringa con la soluzione da iniettare e collegare la micropuntura della siringa al tubo.Posizionare il microneedle sul micromanipolatore e sulla siringa o sulla pompa per siringa. Una volta che l'assemblaggio per l'iniezione è pronto, recuperare gli embrioni. Per un corretto inserimento del microneedle in un vaso sanguigno, come un vaso vitale, è necessaria una penetrazione orizzontale dell'ago.L'embrione deve quindi trovarsi allo stesso livello dei bordi della coppetta che lo contiene. Per sollevare l'embrione, rimuovere il cerchietto di gomma che tiene ferma la pellicola di plastica su cui poggia l'embrione. Sollevare delicatamente un lato della pellicola di plastica e aggiungere un po' d'acqua nella coppetta senza spostare eccessivamente l'embrione.Quindi posizionare nuovamente l'elastico sulla plastica. Ora che l'embrione è sollevato, la soluzione può essere iniettata in un vaso embrionale. Si noti che, durante l'iniezione in un vaso vitale, la dimensione della micropuntura deve essere approssimativamente un decimo del diametro del vaso.Per mantenere un'irrorazione efficiente senza causare sanguinamento, pompare prima la soluzione all'interno del micropuntura in modo che non rimangano bolle d'aria intrappolate. Successivamente, allineare la punta del micropuntura con un vaso selezionato per i vasi vitali. La selezione di un'area consente di ottenere la massima superficie disponibile per il targeting del vaso.Dopo aver definito l'area di iniezione, spingere l'ago verso il vaso. Inizialmente il vaso si ritrae. Una volta che l'ago penetra e si inizia la perfusione, il colore del sangue in circolo cambia con la perfusione.Se il cambiamento di colore non è visibile, l'ago potrebbe aver perforato il vaso. In tal caso, ritirare lentamente la micropuntura pompando contemporaneamente la soluzione finché non si osserva un cambiamento di colore nel vaso. Quando la perfusione è completa, estrarre delicatamente la micropuntura dal vaso. Questa coltura di embrioni è adatta anche ad applicazioni di microchirurgia, come la legatura dell'atrio sinistro, che viene eseguita al quarto giorno di incubazione.Per prima cosa, preparare i nodi da utilizzare con un diametro di 0,5 millimetri a partire da sutura chirurgica in nylon 10/0. Utilizzando pinzette fini, rimuovere le membrane corioniche e amniotiche dall'embrione. Sollevare l'embrione dal dorso e ruotarlo verticalmente in modo che il lato sinistro dell'embrione risulti ora rivolto verso l'alto e accessibile.In seguito, rimuovere il pericardio sovrastante l'atrio sinistro. Allineare il nodo sopra l'atrio sinistro e stringerlo tenendolo e tirandolo lateralmente con una pinzetta; il nodo deve essere legato in modo da ostacolare circa il 75% del flusso sanguigno originale verso il lato sinistro. Tagliare i lembi del nodo con forbici microchirurgiche e rimuovere con cura, quindi scartare l'eccesso di sutura.Infine, ruotare l'embrione riportandolo alla sua orientazione originale con il lato destro in alto. Qui sono mostrati embrioni a diversi stadi coltivati ex ovo come appena dimostrato; un riscaldatore a circolazione d'acqua può mantenere le condizioni ambientali per periodi prolungati, quando necessario. Durante applicazioni di imaging e microchirurgiche.Gli embrioni di pollo coltivati ex ovo sono adatti per la microiniezione. In questo esperimento, un colorante fluorescente è stato iniettato nella vascolarizzazione di un embrione di pollo coltivato ex ovo. Gli embrioni di pollo coltivati ex ovo sono adatti per la microchirurgia.In questo esperimento, è stata eseguita la procedura di legatura dell'atrio sinistro su un embrione di pollo coltivato in ovo. Una volta acquisita padronanza, la coltura di embrioni di pollo in ovo può essere effettuata in circa cinque minuti per ogni embrione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come creare colture di embrioni di pollo XO adatte ad applicazioni di imaging e microchirurgia, e in cui è necessario il trasporto delle colture.

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell'angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi...

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

L'obiettivo generale di questo video è quello di mostrare come eseguire l'iniezione mirata della retina...

In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic

Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell'ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Qui, presentiamo una nuova tecnica per coltivare embrioni di pollo ex ovo per l'imaging time-lapse utilizzando la luce trasmessa e la microscopia a fluorescenza. Il sandwich di carta da filtro sommerso è una variante della consolidata tecnica di supporto della carta da filtro1 che consente la coltura di embrioni di pollo completamente immersi in un terreno di coltura liquido.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine Ex Ovo Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Questo protocollo descrive tre metodi su come ottenere e utilizzare embrioni di pollo di età compresa tra 5 e 8 giorni e la loro membrana corioallantoica (CAM) come modello in vivo per studiare l'imaging ecografico con contrasto e la somministrazione di farmaci mediata da microbolle.

La preparazione di embrioni di pollo ex ovo e vasi della membrana corioallantoica come modello in vivo per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto e studi di somministrazione di farmaci mediati da microbolle

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.

In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Impara a coltivare embrioni di pollo ex-ovo per studi di embriogenesi con accesso ottico completo. Questa tecnica consente microiniezioni, imaging e microchirurgia in biologia dello sviluppo.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Esplora altri video