Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare i fenotipi circadiani e del sonno in Drosophila analizzando i ritmi giornalieri di attività locomotoria. Questo viene ottenuto generando moscerini transgenici, ottenendo mutanti specifici o impostando gli incroci necessari per preparare gli animali sperimentali. Come secondo passaggio, è necessario preparare tubi di vetro per l'attività contenenti una fonte di cibo, che fungeranno da habitat per le mosche durante l'esperimento.

Successivamente, moscerini di età compresa tra uno e cinque giorni vengono posizionati in tubi di attività, che vengono inseriti nei monitor di attività DAM al fine di registrare i ritmi dell'attività locomotoria. Utilizzando il sistema DAM, si ottengono risultati che evidenziano difetti e variazioni nei parametri circadiani e del sonno, basati sull'analisi dei ritmi giornalieri di attività locomotoria mediante software come far sex e insomniac. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia circadiana, ad esempio quali proteine e meccanismi regolatori siano coinvolti nella generazione di ritmi corretti, e come fattori ambientali come la luce e la temperatura modulino i ritmi comportamentali attraverso specifiche vie molecolari.

Il sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria richiede diversi componenti, come dispositivi specializzati per il monitoraggio, incubatori ambientali dotati di controllo della luce per il ciclo giorno-notte, dispositivi per la raccolta dei dati, computer e materiali periferici come cavi. Scegliere una stanza buia con controllo della temperatura ben ventilata per ospitare il sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria, al fine di evitare un carico eccessivo sugli incubatori e possibili malfunzionamenti nel mantenimento della temperatura; sigillare la stanza da fonti di luce esterne all'interno della stanza buia. Non è necessario lavorare completamente al buio, poiché il sistema circadiano dei moscerini della frutta non è sensibile alla luce infrarossa.

Pertanto, nei casi in cui è necessario vedere all'interno della stanza buia, si utilizza semplicemente una torcia standard coperta con un filtro rosso, insieme a un'unità di alimentazione di emergenza (UPS) dotata di capacità sufficiente in termini di wattaggio per alimentare i componenti del sistema di monitoraggio dell'attività. In caso di picchi di tensione o interruzione di corrente nell'edificio, collegare l'unità di backup di emergenza UPS al circuito di emergenza dell'edificio, se disponibile. Se il sistema che controlla l'illuminazione nell'incubatrice non è regolato direttamente dall'incubatrice, allora è sufficiente collegare l'incubatrice all'alimentazione di emergenza senza UPS, poiché la perdita di corrente per alcuni secondi non influirà sulla temperatura della camera.

Successivamente, configurare un computer, PC o Macintosh, completamente dedicato alla raccolta dei dati e/o al controllo degli incubatori. Disporre manualmente la rete telefonica in modo ordinato intorno agli scaffali degli incubatori a condizioni ambientali controllate, in modo da facilitare il collegamento e lo scollegamento dei dispositivi di monitoraggio. Configurare più linee telefoniche in modo che convergano in un'unica linea principale, estendendosi all'esterno dell'incubatore per connettersi al computer; collegare i dispositivi di monitoraggio all'interno degli incubatori al computer tramite un'unità di interfaccia di alimentazione, che ha la funzione di alimentare il monitor di attività attraverso la linea telefonica.

Infine, schermare possibili fonti di luce provenienti dai LED di dispositivi elettronici o da una porta dell'incubatrice non sigillata correttamente, utilizzando nastro adesivo o un panno nero. Per garantire la misurazione di ritmi liberi in assenza di luce indesiderata, è fondamentale valutare questi fenotipi utilizzando animali di controllo adeguati, allevati nelle stesse condizioni ambientali e della stessa età.

Inoltre, esiste un dimorfismo sessuale nella ritmicità circadiana. La pratica comune è utilizzare moscerini adulti di sesso maschile, allevati a 25 gradi Celsius e di età compresa tra uno e cinque giorni, poiché l'attività di deposizione delle uova nelle femmine potrebbe influenzare la misurazione reale dell'attività locomotoria. Quando si esaminano i parametri circadiani e del riposo/sonno di specifici moscerini mutanti di interesse, è opportuno incrociare la linea mutante con una ceppo selvatico dello stesso background genetico.

Ad esempio, W 1118 o yw. Poiché nei maschi di drosophila non avviene il crossing over, è preferibile effettuare l'incrocio esterno incrociando femmine mutanti con maschi di tipo selvatico, seminando contemporaneamente sia il controllo di tipo selvatico sia le drosofile mutanti. Dopo circa 10-14 giorni su comune cibo per drosophila prima dell'esperimento sul ritmo dell'attività locomotoria, alla chiusura della progenie raccogliere maschi di età compresa tra uno e cinque giorni e metterli da parte per essere utilizzati negli esperimenti.

I tubi di attività rappresentano l'habitat della mosca. Durante l'esperimento, si tratta di sottili tubi di vetro da cinque millimetri che contengono al loro interno una sostanza alimentare a un'estremità e sono tappati con un tappo di lana o di plastica all'altra estremità. È preferibile utilizzare tubi di attività appena preparati.

Di norma vengono preparati alcuni giorni fino a una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Poiché le provette per attività possono essere riutilizzate più volte, le seguenti procedure di preparazione descrivono l'uso di provette per attività già utilizzate e non pulite come punto di partenza. Se si utilizzano provette nuove, passare direttamente alla sterilizzazione in autoclave delle provette, come mostrato successivamente.

Rimuovere i tappi dai tubi di attività usati e posizionarli in un grande becher di vetro. I tubi devono riempire il becher solo fino a metà. Riempire il becher con acqua del rubinetto, assicurandosi di immergere completamente i tubi.

Riscaldare al microonde il becher riempito con i tubi di vetro fino a quando l'acqua raggiunge un bollore rapido e completo. Per sciogliere la cera e l'alimento a base di agar, prestare attenzione poiché l'acqua è calda. Rimuovere il becher dal microonde e mescolare i tubi con una spatola o in plastica.

Pipetta da 10 millimetri per permettere alla cera intrappolata di salire in superficie. Quindi ripetere il passaggio di riscaldamento al microonde. Rimuovere il becher dal microonde e attendere che si raffreddi.

Mettere il becher in ambiente refrigerato accelererà il processo. Raffreddandosi, l'acqua farà sì che la cera si accumuli sulla superficie e si solidifichi gradualmente. Rimuovere la cera solidificata a mano.

Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte della cera dai tubi. Trasferire i tubi per l'attività in un nuovo becher contenente acqua corrente fresca e ripetere il processo di riscaldamento a microonde e rimozione della cera. Poiché la maggior parte della cera è già stata rimossa nel passaggio precedente, non è necessario attendere che la cera si solidifichi.

Versare semplicemente l'acqua dal becher e trasferire le provette in un nuovo becher. Prestare attenzione poiché l'acqua è ancora calda. Ripetere il processo di microonde per l'ultima volta.

Versare l'acqua fuori dal becher e attendere che i tubi per l'attività si raffreddino. Successivamente, posizionare i tubi per l'attività in verticale all'interno di becher di vetro da 250 millilitri o da 500 millilitri. Assicurarsi che non siano troppo stipati.

Sterilizzarli utilizzando un autoclave con un ciclo di asciugatura oppure asciugare semplicemente i tubi in un forno asciugatore per preparare il cibo da caricare nei tubi di attività. Preparare una soluzione di saccarosio al 5% e agar al 2% in acqua distillata o di rubinetto e sterilizzare la soluzione in autoclave. Il cibo sterilizzato in autoclave può essere utilizzato immediatamente oppure conservato a quattro gradi Celsius per un periodo prolungato.

Il cibo dovrebbe essere a circa 65 gradi Celsius durante il riempimento dei tubi per l'attività. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la soluzione liquida di cibo lungo la parete interna del becher di vetro, riempiendo i tubi fino a un terzo della loro altezza partendo dal fondo. Ruotare delicatamente il becher per assicurarsi che tutti i tubi vengano riempiti in modo uniforme con la soluzione di cibo.

Attendere che il cibo si solidifichi completamente a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius. Una volta che la condensa all'interno dei tubi di vetro si sarà dissipata, i tubi potranno essere rimossi dal becher. Per rimuovere i tubi di attività dal becher, spingere i tubi verso il fondo del becher e ruotarli contemporaneamente in modo che il cibo solidificato all'interno dei tubi e il fondo del becher si separino.

Estrarre i tubi dal becher, preferibilmente tutti insieme come un singolo fascio. Successivamente, pulire i tubi uno alla volta con tovaglioli di carta per rimuovere l'eccesso di terreno dalla superficie esterna dei tubi. Mettere da parte i tubi in un contenitore pulito.

Prendere un riscaldatore a blocco da laboratorio generico senza il portaprovetta e coprire attentamente il pozzetto di riscaldamento. Aggiungere pastiglie di paraffina nel pozzetto di riscaldamento rivestito di alluminio in modo che si sciolgano, tenere le provette all'estremità non alimentare e immergere l'estremità alimentare nella cera fusa. Immergere la parte ricoperta di cera in un becher di vetro riempito con acqua fredda per accelerare la solidificazione della cera. Ripetere.

Immergere una volta i tubicini di cera nell'acqua impedirà che si attacchino tra loro. I tubicini possono essere utilizzati immediatamente o conservati in un contenitore ermetico a quattro gradi Celsius per l'uso successivo. Se conservati per più di una settimana, il cibo si seccherà eccessivamente.

Se i tubi sono conservati a quattro gradi Celsius, portarli alla temperatura ambiente lasciandoli sul banco prima dell'uso. Prima di caricare le mosche nei tubi di attività, accendere gli incubatori che verranno utilizzati per ospitare i monitor di attività. Regolare la temperatura mediante i comandi dell'incubatore e impostare il regime luce-buio utilizzando il controllore della luce del sistema DAM o il sistema di controllo della luce dell'incubatore, in base al disegno sperimentale desiderato.

Successivamente, anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Quindi, utilizzando un pennello fine, trasferire delicatamente una singola mosca in un tubo di attività. Afferrare con pinzette fini la parte centrale di un singolo pezzo di filo di circa mezzo pollice e inserire il filo nell'estremità del tubo di attività senza cibo per tappare l'apertura e impedire alla mosca di uscire durante l'esperimento.

Nel frattempo, consentendo l'ingresso di aria nel tubo, mantenere il tubo disteso su un lato finché la mosca non si sveglia. Per evitare che la mosca rimanga intrappolata nel cibo, inserire i tubi nei monitor di attività. Con il modello più recente e compatto dei monitor Tri Kinetics, è necessario tenere fermi i tubi con fascette di gomma per garantire che il fascio infrarosso attraversi il tubo nella posizione centrale. Infine, posizionare i monitor di attività negli incubatori e collegarli al sistema di raccolta dati tramite i cavi telefonici di controllo.

Utilizzando il software di raccolta dati del sistema DAM, verificare che tutti i monitor siano correttamente collegati e che i dati vengano raccolti da ciascuno di essi. Ora che le mosche sono state inserite nei tubi di attività e che il sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria è pronto, i dati possono essere registrati. Le mosche vengono sincronizzate e adattate esponendole al regime desiderato di luce, buio o cicli luce/buio (LD) e temperatura per due-cinque giorni completi.

La condizione di sincronizzazione più comunemente utilizzata è un ciclo luce-buio di 12 ore di luce e 12 ore di buio a 25 gradi Celsius. Per lo studio dei ritmi circadiani rispetto a questo protocollo, il momento in cui si accende la luce nell'incubatrice è definito come Zeitgeber Time zero, e tutti gli altri tempi sono relativi a questo valore. Nelle condizioni standard 12:12 LD, i *Drosophila melanogaster* tipici mostrano generalmente due periodi di attività, uno centrato intorno a ZT zero denominato picco mattutino e un altro intorno a ZT 12 denominato picco serale. I ritmi di attività locomotoria in libera espressione sono misurati in condizioni costanti di buio e temperatura, dopo il periodo di sincronizzazione.

La configurazione del ciclo luminoso può essere modificata in qualsiasi momento durante la fase scura nell'ultimo giorno di ld, in modo che il giorno successivo dell'esperimento rappresenti il primo giorno di dd. La raccolta di dati per sette giorni di DD è sufficiente per calcolare il periodo circadiano e l'ampiezza o intensità del ritmo delle mosche. In generale, è necessaria una dimensione del campione di almeno 16 mosche per ottenere periodi liberi affidabili per un particolare genotipo.

Alla fine dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti mediante il software del sistema DAM vengono scaricati su un dispositivo portatile di archiviazione dati. Ad esempio, una chiavetta USB. I dati binari grezzi vengono elaborati utilizzando DAM file scan 1 0 2 x e sommati in intervalli di 15 e 30 minuti durante l'analisi dei parametri circadiani oppure in intervalli da uno a cinque minuti durante l'analisi del sonno.

Parametri di riposo. Attualmente, cinque minuti consecutivi di inattività rappresentano la definizione standard di riposo del sonno in Drosophila. Al termine di questo protocollo, è possibile utilizzare lo stesso set di dati per confrontare i parametri circadiani e del sonno tra animali sperimentali e di controllo per quanto riguarda i parametri circadiani.

Grafici di dazione che illustrano le attività locomotorie giornaliere o le attività medie delle mosche durante diversi giorni in condizioni LD o DD possono essere generati utilizzando fast x oph melanogaster, che in genere mostrano due periodi di attività, uno centrato intorno a ZT zero denominato picco mattutino e un altro intorno a ZT 12 denominato picco serale. Questi due periodi di attività sono controllati dall'orologio endogeno e possono essere osservati anche in condizioni di libera espressione (DD). I cambiamenti nel momento di comparsa di questi picchi di attività possono essere facilmente osservati nei grafici di dazione e possono indicare una variazione nelle proprietà dell'orologio endogeno.

Un’altra proprietà indicativa di un corretto funzionamento dell’orologio biologico è l’aumento anticipatorio dell’attività locomotoria osservato nei cicli LD, che si verifica prima delle effettive transizioni da buio a luce o da luce a buio. Questo comportamento è chiaramente osservabile nelle mosche di tipo selvatico, ma è assente e aritmico nei mutanti per zero. In questo mutante.

I picchi osservati al mattino e alla sera nell'LD sono semplici risposte di startle dovute a bruschi cambiamenti nelle condizioni di luce e buio. Le mosche prive di orologio non anticipano i cambiamenti ambientali, ma reagiscono semplicemente a essi. La perdita della ritmicità comportamentale è molto più pronunciata in DD e si manifesta generalmente con la totale assenza di picchi mattutini o serali dell'attività locomotoria, come osservato nelle mosche per zero.

Oltre ai grafici di induzione, i dati sull'attività locomotoria possono essere rappresentati come un doppio diagramma per ciascun insetto singolo o genotipo di moscerino, in cui due giorni di dati vengono tracciati in sequenza su ogni riga, ma il profilo dell'ultimo giorno inizia la riga successiva, corrispondente a due giorni di attività. Ad esempio, LD uno e due vengono tracciati sulla prima riga del diagramma ACTO. La riga successiva inizia con una ripetizione di LD due, seguita da LD tre e così via.

Seguendo questo formato, i dati sull'attività locomotoria relativi all'intero esperimento sono illustrati nell'ACTOgramma. Un vantaggio degli ACTOgrammi rispetto ai grafici di riduzione è che un cambiamento nella lunghezza del periodo dell'attività giornaliera risulti facilmente osservabile, oltre alla generazione di grafici di induzione e ACTOgrammi.

I dati sull'attività locomotoria ottenuti dalla condizione DD possono essere inviati a far X per calcolare la lunghezza del periodo utilizzando diversi programmi, tra cui cycle P per l'analisi dei parametri di sonno e riposo, definito come cinque minuti consecutivi di inattività. È possibile analizzare i dati registrati dai saggi di attività locomotoria ed esaminare multipli parametri del sonno utilizzando insomniac, un programma basato su MATLAB; la percentuale di tempo che i moscerini trascorrono dormendo può essere calcolata in diversi intervalli di tempo. Ad esempio, la percentuale di sonno ogni ora o ogni 12 ore.

Altri parametri del sonno più comuni che possono essere esaminati includono la durata media dei periodi di riposo, che rappresenta una misura del grado di consolidamento del sonno e può indicare la qualità del sonno. Un altro parametro è il numero di attività durante la veglia, che misura la frequenza di attività quando i moscerini sono svegli. Questo parametro aiuta a distinguere tra moscerini effettivamente alterati nei comportamenti di sonno e riposo e quelli che sono malati o iperattivi.

Ad esempio, le mosche semplicemente malate possono sembrare più addormentate perché sono meno mobili. Per queste mosche, l'attività da sveglie sarà inferiore rispetto agli animali di controllo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare i fenotipi circadiani e del sonno in Drosophila mediante saggio. Ritmi quotidiani di attività locomotoria.