Isolamento di cellule endoteliali valvolare

In questo protocollo video viene dimostrata l'isolazione di cellule endoteliali interstiziali residenti e specifiche per lato provenienti da una valvola aortica cardiaca. La valvola viene prelevata dal cuore e posta in una soluzione salina fredda. Lo strato endoteliale può essere rimosso da entrambi i lati della valvola mediante delicato raschiamento del tessuto immerso in soluzione di collagenasi con un bastoncino di cotone; per l'isolamento specifico per lato, la valvola viene fissata su un letto di paraffina in modo da esporre la superficie endoteliale.

Vengono quindi aggiunte alcune gocce di collaghenasi fredda alla valvola, e le cuspidi vengono incubate per cinque-dieci minuti. Dopo l'incubazione con la collaghenasi, lo strato endoteliale specifico del lato viene rimosso mediante un delicato taglio del tessuto. Con un tampone, le cellule endoteliali rilasciate vengono quindi raccolte, lavate e seminate.

I lembi rimanenti vengono quindi digeriti durante la notte per isolare le cellule interstiziali, che vengono raccolte e lavate. Tutte le cellule isolate vengono coltivate e possono essere utilizzate per comprenderne il ruolo nella riparazione e nel rimodellamento delle valvole cardiache in risposta a segnali meccanici e biologici locali. Ciao, mi chiamo Russell Gould.

Sono qui all'Università di Cornell, presso il dipartimento di ingegneria biomedica, dove lavoro nel laboratorio del professor Butcher. Oggi vi mostrerò come isolare le cellule endoteliali valvolari. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la comprensione di come le cellule V residenti riparino e rimodellino costantemente i tessuti in risposta a segnali meccanici e biologici.

Iniziamo. Per prima cosa, procurarsi un'aorta suina presso un macello locale ed eseguire in condizioni asettiche l'escissione della radice aortica. Risciacquare accuratamente la radice aortica del sangue.

Con DPBS freddo e sterile, è fondamentale rimuovere il più rapidamente possibile tutti i componenti del sangue per limitare la morte delle cellule endoteliali valvolari o VEC e la contaminazione batterica. In questa fase non si consigliano antibiotici e antimicotici poiché potrebbero essere dannosi per le ecs. Successivamente, isolare direttamente dalla radice tre.

Campionare le valvole da ciascuna valvola. Avere cautela durante l'isolamento della valvola, poiché qualsiasi tessuto anulare potrebbe contaminare la popolazione cellulare. Posizionare le valvole isolate in un tubo conico sterile da 15 millilitri riempito con 12 millilitri di DPBS freddo.

Agitare più volte per rimuovere i detriti e ricompilare con DPBS fresco. Infine, trasportare le valvole valvolari di nuovo in laboratorio su ghiaccio. All'arrivo in laboratorio, posizionare il contenitore con il tessuto sotto la cappa sterile ed eseguire l'isolamento dello strato endoteliale; sterilizzare in autoclave quanto segue in un vassoio per strumenti coperto: pinze per tessuti dentate, forbici per tessuti e bastoncini di cotone.

Preparare anche soluzione sterile di collaghenasi, mezzo endoteliale e mezzo interstiziale. Come specificato nel protocollo scritto allegato. Riempire una piastra sterile da 35 millimetri con tre millilitri di soluzione di collaghenasi fredda per valvola, e posizionare tutte e tre le valvole dal tubo da 15 millilitri nella piastra.

Incubare il tessuto per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere delicatamente lo strato endoteliale da entrambi i lati della valvola ruotando un tampone sterile asciutto sulla superficie. La direzione della rotazione e la quantità di forza di taglio applicata sono fondamentali per la purezza del campione.

La rotazione del tampone avviene in direzione opposta al movimento lineare della mano che tiene il bastoncino di cotone. Questo crea una forza di taglio controllata che solleva le cellule endoteliali dal tessuto. L'intensità della forza applicata deve essere sufficiente da percepire la resistenza del tessuto, ma senza penetrare la membrana basale; tamponare occasionalmente il bastoncino nella soluzione di collagenasi per staccare le cellule dalle fibre della punta.

Al termine della procedura di strofinamento, la consistenza dello strato endoteliale dovrebbe risultare leggermente più liscia rispetto a prima. Raccogliere le cellule sospese nella soluzione di collagenasi e trasferirle in un nuovo tubo sterile da 15 litri. Dopo aver rimosso le cellule endoteliali dalle valvole, posizionare immediatamente le valvole in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione di collagenasi per l'isolamento delle cellule interstiziali.

Centrifugare i tubi a 1000 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente per formare il pellet delle cellule isolate, quindi aspirare il soprannatante. Aggiungere tre millilitri di mezzo endoteliale nei tubi da 15 millilitri. Centrifugare una seconda volta come in precedenza ed aspirare il mezzo.

Questa seconda centrifugazione aiuta a filtrare alcuni materiali indesiderati, come le fibre dei puntali. Ri-sospendere le cellule endoteliali in cinque millilitri di mezzo endoteliale e seminare le cellule in un fiasco T25 pre-ricoperto con collagene. Utilizzando un fiasco per ogni provetta da centrifuga, lasciare crescere le cellule per almeno due o tre giorni prima di cambiare il mezzo endoteliale.

Questo aiuta le cellule a riprendersi e a dividersi. Poiché il processo di isolamento è piuttosto aggressivo e il rendimento cellulare potrebbe essere basso, è fondamentale passare le cellule in coltura quando sono prossime alla confluenza. Poiché l'inibizione da contatto potrebbe portare a trasformazione cellulare, le cellule endoteliali possono anche essere isolate da un lato specifico.

A tal fine, preparare innanzitutto una piastra di Petri contenente una striscia di letto di paraffina. Piastre di Petri di vetro da 60 millimetri con foglio di alluminio. Calcolare due piastre di vetro per ogni fogliolina.

La carta d'alluminio aiuta a rimuovere la paraffina per riutilizzare la piastra di Petri. Successivamente, inserire le perle di paraffina nelle piastre fino a riempirle circa a metà e coprirle per l'autoclavatura. Al termine dell'autoclavatura e dopo che la paraffina è fusa, trasferire l'insieme delle piastre su una superficie piana e fresca.

Mentre la paraffina si raffredda, si indurisce e forma uno strato che sosterrà le punture dell'ago. Dopo 60 minuti, la piastra sterilizzata può essere utilizzata per immobilizzare il tessuto della valvola. Rimuovere i lembi isolati dalla valvola dai tubi da 15 millilitri e posizionarli sul letto di paraffina.

Manipolare le valvole in modo che la faccia ventricolare sia rivolta verso il basso sulla superficie di paraffina, lasciando esposta la faccia fibrotica. Fissare i bordi della valvola per esporre il strato endoteliale. Successivamente, applicare alcune gocce di collagenasi fredda su ciascuna superficie endoteliale rivolta verso l'alto e incubare il tessuto per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, rimuovere delicatamente lo strato endoteliale come in precedenza ruotando un tampone sterile e asciutto sulla superficie della valvola. Di tanto in tanto, tamponare leggermente all'interno della soluzione di collaghenasi per staccare le cellule dalle fibre della punta. Al termine del tamponamento, la consistenza dello strato endoteliale dovrebbe risultare leggermente più liscia rispetto a prima.

Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri. Indicare la specificità laterale sulle etichette: i lembi provenienti dalla stessa valvola possono essere raggruppati insieme. Risciacquare la valvola immobilizzata utilizzando alcune gocce di DPBS freddo per eliminare eventuali cellule o detriti residui.

Trasferire le valvole in una nuova piastra di coltura in modo che ora sia esposta la faccia ventricolare e raccogliere le cellule endoteliali come appena illustrato. Una volta completata la raccolta delle cellule endoteliali dalla valvola G, porre immediatamente le valvole in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione di collagenasi. Lavare le cellule, sospenderle e coltivarle come mostrato per l'isolamento non specifico per faccia delle cellule endoteliali.

Se il rendimento cellulare è molto basso, si consiglia di passare a una fiasca più piccola o di utilizzare una piastra a pozzetti. Poiché l'adesione tra cellule favorisce la crescita cellulare, ricordare di passaggiare le cellule in prossimità della confluenza. Poiché l'inibizione da contatto potrebbe portare a trasformazione cellulare, iniziare l'isolamento delle cellule interstiziali mentre si centrifugano le cellule endoteliali, incubando i tubi contenenti le valvole per circa 12-18 ore.

Nella soluzione di collaghenasi, agitare delicatamente se desiderato. Al termine del periodo di incubazione, utilizzare una pipetta sierologica per mescolare delicatamente il tessuto digerito finché la sospensione cellulare non diventa omogenea. Questa omogeneizzazione contribuisce a frammentare il tessuto e a rilasciare le cellule interstiziali; centrifugare e lavare le cellule come mostrato per le cellule endoteliali.

Tranne per l'uso di cinque millilitri di mezzo interstiziale resus, sospendere le cellule interstiziali del centrifugato in 15 millilitri di mezzo interstiziale e seminare le cellule in una fiasca T75, utilizzando una fiasca per ogni provetta da centrifuga. Lasciare crescere le cellule per almeno uno o due giorni prima di cambiare il mezzo interstiziale, prevedendo una maggiore quantità di detriti tissutali rispetto a quanto osservato con le cellule endoteliali. Inoltre, le cellule interstiziali raggiungono la confluenza più rapidamente rispetto alle cellule endoteliali per loro natura e forniscono rese cellulari più elevate in queste immagini rappresentative.

La morfologia delle cellule endoteliali valvolari V Cs coltivate e delle cellule interstiziali valvolari è mostrata a due-tre giorni. Le BECs mostrano una morfologia endoteliale tipica, in cui le cellule presentano un aspetto a selciato e iniziano a formare aggregati.

Il VS. Esibisce una morfologia simile a quella dei miofibroblasti, in cui le cellule sono generalmente a forma di fuso e scarsamente popolate quando coltivate fino a confluenza; le ECS mostrano una morfologia endoteliale tipica, in cui le cellule formano un modello a selciato e la crescita è inibita dal contatto. Le VI CS esibiscono una morfologia simile a quella dei miofibroblasti, in cui le cellule sono generalmente a forma di fuso e la crescita non è inibita dal contatto. Le caratteristiche funzionali sia delle VEC che delle VIC possono essere dedotte dalla colorazione. Per un uptake di LDL marcati.

Le cellule VEC sono associate a elevati livelli di captazione di LDL acetilata. Mentre le cellule VIC sono associate a bassi livelli di captazione di LDL acetilata, qui vengono mostrati i marcatori cellulari di VEC e VIC. Le cellule ECS risultano positive alla colorazione per il fattore di von Willebrand, mentre vs.

Non mostrano colorazione per il fattore di von Willebrand. Inoltre, le VCS sono negative per l'actina alfa del muscolo liscio, mentre le VCS sono positive per l'actina alfa del muscolo liscio. Beh, spero che abbiate imparato molto dalle nostre isolazioni di oggi.

È importante ricordare, tuttavia, che la membrana basale delle cellule endoteliali è molto fragile e qualsiasi alterazione della matrice sottostante spesso libera cellule contaminanti dal resto del tessuto. Per confermare un isolamento riuscito, la caratterizzazione è fondamentale per valutare la purezza dei vostri isolati. Buona fortuna.