Name: Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-27T17:35:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di cellule endocardiali valvolari HH14 e mesenchimali HH25 da embrioni aviari. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo cardiaco e la trasformazione mesenchimale in vitro.

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Questa ricerca è sostenuta dalla Fondazione Hartwell, l&#39;American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) e la Fondazione Leducq: 07CVD04 mitrale.

1. Preparazione <ol><li> Incubare uova di quaglia fertile o pollo allo stadio 14 - (circa 2 giorni) o 25 (circa 4,5 giorni) a 60% di umidità e 37 ° C. </li><li> Preparare la soluzione Balanced Salt Earl è sterile (EBSS) <ol><li> Aggiungere 100 mL EBSS 10X a 600 ml di acqua 18 MΩ </li><li> Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato </li><li> Regolare il pH della soluzione a 7,2 </li><li> Portare la soluzione fino a 1000 ml </li><li> Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron </li></ol></li><li> Preparare sterile M199 terreno di coltura. <ol><li> Aggiungere 1 confezione di M199 in polvere a 700 ml di acqua 18 MΩ. </li><li> Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato </li><li> Regolare il pH della soluzione a 7,2. </li><li> Aggiungere 10 ml (1%) Penicillina-Streptomicina </li><li> Portare la soluzione fino a 1000 ml </li><li> Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron </li><li> Aggiungere 1 ml sterile 100X Insulin-transferrina-selenio-G supplemento </li><li> Aggiungere 10 ml (1%) siero di pollo sterile </li></ol></li><li> Preparare tre gel tridimensionale di collagene ad una concentrazione di collagene di 1,5 mg / ml. Lavoro precedente nel nostro laboratorio ha dimostrato che una concentrazione di collagene di più di 1,5 mg / ml fornisce una matrice che è troppo rigida biomeccanico per le cellule per spostarsi. Concentrazioni di gel di collagene inferiore a 1,5 mg / ml sono fibre di collagene così pochi che il ciuffo cellula può distruggere le fibre a livello locale, producendo un 'isola di cellule. <ol><li> Aggiungere la seguente ghiacciata reagenti ad una provetta sterile 15 ml in ordine: <ul><li> 3X M199: Volume = volume totale necessario / 3 </li><li> 18 MΩ acqua sterile: Volume = volume totale necessario (M199 volume + volume di pollo siero + 0,1 M di NaOH il volume + volume collagene) </li><li> Siero di pollame sterile: Volume = volume totale necessario * 0.01 </li><li> Rat collagene coda I: Volume = (gel di concentrazione di collagene * volume totale necessario) / collagene concentrazione magazzino </li><li> Sterile 0,1 M NaOH: Volume = volume collagene * 0,2 Nota: La quantità di acqua, 0,1 M di NaOH, e collagene aggiunto varierà a seconda della concentrazione della soluzione di riserva collagene. </li></ul></li><li> Miscelare la soluzione collagene bene con una pipetta sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il 0,3 mL della soluzione di collagene in 1,9 cm 2 pozzi di crescita dell'area. Questa è la soluzione di collagene sufficiente a coprire completamente il bene e per fornire un gel che è di circa 3 mm di spessore. Un gel spessore di almeno 250 micron è necessario per gli studi di invasione delle cellule. </li><li> Lasciare che la soluzione di collagene gel per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2, e 100% di umidità. </li></ol></li></ol> 2. Pre-EMT endocardica isolamento delle cellule e Cultura <ol><li> Embrione isolamento <ol><li> Posizionare un pezzo pollice di lunghezza del nastro di laboratorio oltre l'estremità più grande di un uovo. Questo è dove la cellula d'aria si trova. Il nastro stabilizza il fragile guscio d'uovo di quaglia. </li><li> Delicatamente forare la superficie registrata dell'uovo nella cella d'aria con la punta delle forbici curve sterilizzati. </li><li> Praticare un foro nella parte registrata dell'uovo che è grande abbastanza per permettere il tuorlo di passare attraverso. Avviare il foro alla puntura e tagliare verso l'esterno a forma di spirale. Assicurati di tagliare la membrana esterna, ma evitare di forare il tuorlo. </li><li> Quando il buco nella shell è completo, visualizzare l'embrione di quaglia. L'embrione è normalmente situato sul lato superiore del tuorlo. </li><li> Cominciate a versare il tuorlo attraverso il taglio foro nell'uovo con una mano. Tenere un # 55 pinzetta nell'altra mano. Come l'embrione esce l'uovo sul lato superiore del tuorlo, scorrere delicatamente il # 55 pinzette sotto l'embrione e rimuoverlo dal tuorlo. Nota: per uova di gallina, l'isolamento embrione comporta rottura le uova di pollo su un forte, superficie pulita e rompere l'uovo in un piatto da 100 mm di Petri. L'embrione deve essere posizionato sul lato superiore del tuorlo. Far scorrere delicatamente # 55 pinzette sotto l'embrione e rimuoverlo dal tuorlo. </li><li> Mettere l'embrione in un piatto 100 mm Petri contenenti ghiacciata, EBSS sterile. </li></ol></li><li> Fase gli embrioni secondo i criteri di Hamburger e Hamilton 1. Embrioni allo stadio 14 - sono stadio ultimi 13, ma non ancora in fase di 15, con 20-21 somiti ed una gemma coda. Una caratteristica chiave della tappa 14 - embrioni è l'angolo di testa, che è leggermente superiore a 90 ° rispetto al corpo. </li><li> Rimuovere i cuori da embrioni di quaglia allo stadio 14 - con N ° 55 pinzette, tagliando trasversalmente in cui il canale AV e OFT entrare in contatto con la parete toracica. Mettere i cuori insieme su un lato della piastra di Petri. </li><li> Raccogliere i cuori isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS. </li><li> Tagliare il OFTs e canali AV trasversalmente dai ventricoli con # 55 pinzette. </li><li> Sezione i canali restanti AV e / o vie di deflusso (OFTs) longitudinalmente. </li><li> Impostare una pipetta ad un volume di 20 uL. Utilizzare questa pipetta per aspirare sei tagliato longitudinalmente canali AV e OFTs. </li><li> Espellere i canali AV e OFTs sul gel di collagene. Aspirare qualsiasi EBSS eccesso dalla superficie del gel. </li><li> Utilizzare # 55 pinzette per orientare la espianti in modo che siano piatte e quindi il lume lato si affaccia sul gel di collagene. Cercate di non forare il gel di collagene con le pinzette. </li><li> Dopo 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2, rimuovere il miocardio dal espianti con # 55 pinzette. Le cellule endocardico dovrebbe essere lasciato sulla superficie del gel di collagene. In alternativa, il miocardio può essere lasciato sul espianto. Con la rimozione miocardio, le cellule endocardici con non sottoposti EMT senza alcun intervento. Con il miocardio presente un sottogruppo di cellule endocardico si trasformerà in mesenchima, ma il grado di trasformazione può essere modulata da fattori esterni. Nota: Anche se il miocardio sarà lasciato, l'espianto deve essere consentito almeno 2 ore da allegare al gel prima media viene aggiunto. </li><li> Aggiungere 0,4 ml M199 medio pozzetti contenenti ciascuno espianti. </li><li> Coltura le cellule a 37 ° C, 5% CO 2, e 100% di umidità. </li></ol> 3. Post-EMT AV Cuscino isolamento delle cellule mesenchimali e Cultura <ol><li> Rompere le uova di pollo su un forte, superficie pulita e rompere l'uovo in un piatto da 100 mm di Petri. L'embrione deve essere posizionato sul lato superiore del tuorlo. Raccogliete l'embrione con # 5 pinzette afferrando membrane che circondano l'embrione e poi posto l'embrione in un piatto 100 millimetri Petri riempite con ghiaccio freddo, EBSS sterile. </li><li> Fase gli embrioni secondo i criteri di Hamburger e Hamilton 1. Caratteristiche di una fase embrionale 25 sono distinte gomito e ginocchio e la pigmentazione degli occhi leggermente. </li><li> Isolare i cuori di tutti HH25 embrioni e il luogo del cuore insieme su un lato della piastra di Petri. </li><li> Raccogliere i cuori isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS. </li><li> Isolare la regione AV da tutti i cuori in una volta. L'AVS posto insieme su un lato della piastra di Petri. Agitare delicatamente la regione AV per rimuovere tutto il sangue, che può influenzare la vitalità cellulare. </li><li> Raccogliere il isolato AVS con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS. </li><li> Sequenziale isolare i cuscini dal AV. Assicurarsi che non sia presente miocardio sui cuscini AV. </li><li> Raccogliere i cuscini isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in una provetta sterile 15 ml per centrifuga. </li><li> Spin i cuscini sul fondo della provetta da centrifuga a 15 xg per 3 minuti. </li><li> Utilizzare una punta sterile 1000 ml per rimuovere la maggior quantità di surnatante EBSS possibile senza disturbare i cuscini. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA che è stato pre-riscaldato a 37 ° C. Lasciare i cuscini ad incubare in tripsina fino a quando sono completamente sciolti, che normalmente è di circa 3-5 minuti. </li><li> Aggiungere 100 ml di siero di pollo al tubo di centrifuga per spegnere la tripsina. </li><li> Agglomerare le cellule a 160 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante con una sterile, punta di 1000 ml. </li><li> Risospendere le cellule in 2 ml di medium M199 e mescolare pipettando. Prendere 10 microlitri della sospensione cellulare contare su emocitometro e determinare il numero totale di cellule che sono state isolate </li><li> Determinare il numero di gel di collagene verrà effettuato in base al numero di cellule isolate. Celle devono essere placcati con una densità di 2 x 10 5 cellule / ml con un volume di 250 microlitri di gel. </li><li> Agglomerare le cellule a 160 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante con una sterile, punta di 1000 ml. </li><li> Utilizzando il protocollo di cui sopra, aggiungere 3X M199, acqua, pollo siero, collagene, e 0,1 M di NaOH, in questo ordine, al pellet. Mescolare pipettando gentile. </li><li> Aggiungere 250 microlitri per ogni cm 1,9 2 area di crescita bene. </li><li> Lasciare che la soluzione di collagene gel per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2, e 100% di umidità. </li><li> Aggiungere 0,4 ml di terreni di coltura e incubare una notte. </li><li> Per continuare a coltivare il gel in condizioni di stress, liberare il gel dai lati della cultura e con una sterile 200 microlitri punta della pipetta. Culture meccanicamente vincolato sono gel che rimangono attaccati ai lati della cultura del bene. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Esempi di embrioni (A) HH14-quaglia embrione, e (B) HH25 embrione di pollo sono mostrati qui. fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/&gt; Figura 2: HH14 valvole espianti endocardico dopo 2 ore di cultura (A) con il presente miocardio, o (B) con il miocardio rimosso.. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. HH14 valvole espianti endocardico (A) Con la presente miocardio, molte delle cellule subiscono endocardica alla trasformazione mesenchimali ed avere un mandrino a forma di fenotipo mesenchimale dopo 48 ore di cultura. (B) Quando il miocardio è stato rimosso tutte le cellule mantenere una forma di ciottoli, fenotipo endocardico dopo 48 ore di cultura. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="Figura 4 " data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4:. HH25 valvola cellule mesenchimali in un gel di collagene Le cellule sono arrotondati subito dopo la semina. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="Figura 5 " data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5:. HH25 cellule mesenchimali in coltura (A) Dopo 48 ore di cultura in un gel di collagene limitato la HH25 cellule mesenchimali stanno cominciando a diffondersi. (B) HH25 cellule in uno stress senza gel di collagene 7 giorni dopo la semina e 6 giorni dopo la liberazione hanno compattato il gel a circa il 50% della superficie originale.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li>
<li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho%2FPI+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo per isolare le cellule endocardico da stadio HH14 - Cuori originariamente sviluppato da Runyan e Markwald fornisce una controllata, in ambiente vitro per studiare i fattori che innescano e modulano embrionale EMT 2. HH14 - espianti endocardico colta senza miocardio non subirà EMT senza l&#39;intervento biomeccanici o biochimici. Se il miocardio è lasciato sul espianto sarà il segnale di un sottogruppo di cellule endocardico a subire la trasformazione mesenchim...

<table><tbody><tr><td>Forbici Bonn extra fini, curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Pipette per trasferimento sterili</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 4 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti monouso sterili, PES, 0,2 &amp;mu;membrana con pori di dimensione m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da centrifuga sterili da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili, 100 mm x 15 mm</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>VWR international</td><td>89097-920</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I da coda di ratto</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>10X Earl&amp;rsquo;Soluzione salina equilibrata</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-064-131</td><td></td></tr><tr><td>polvere di M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Integratore Insulina-Transferrina-Selenio-G (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Invitrogen</td><td>16110-082</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio, 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Uova di quaglia feconde (&lt;em&gt;Coturnix coturnix&lt;/em&gt;)</td><td>Fattoria di Allevamento di Uccelli da Richiamo di Lake Cumberland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uova di gallina feconde (&lt;em&gt;Gallus gallus&lt;/em&gt;)</td><td>Azienda Avicola della Cornell University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Un&#39;adeguata formazione e la funzione delle valvole cardiache embrionali è fondamentale per la progressione di sviluppo. Il cuore embrionale precoce è un tubo a U di endocardio circondato da miocardio. Miocardio secerne pappa cardiaci, un acido ialuronico ricco di matrice gelatinosa, nel nodo atrioventricolare (AV) e del tratto di efflusso (OFT) lumen. Nella fase HH14 valvulogenesis inizia quando un sottogruppo di cellule endocardico ricevere segnali dai miocardio, sottoposti endocardico alla trasformazione mesenchimale (EMT), e invadono la pappa cardiaci. Nella fase HH25 i cuscini sono completamente valvolare mesenchymalized, ed è questo mesenchima che forma poi l&#39;apparato valvolare e del setto del cuore. La comprensione dei meccanismi che innescano e modulano il processo di differenziazione delle cellule EMT e sono importanti per la loro connessione con gravi difetti cardiaci congeniti. In questo studio presenteremo i metodi per isolare pre-EMT endocardico e post-EMT cellule mesenchimali, che sono le due fenotipi cellulari diversi del cuscino prevalvular. Pre-EMT cellule endocardico possono essere coltivate con o senza il miocardio. Post-EMT cuscino AV cellule mesenchimali possono essere coltivate gel di collagene all&#39;interno meccanicamente vincolato o senza stress. Queste 3D in modelli in vitro imitare principali eventi morfogenici valvolare e sono utili per decostruire i meccanismi di valvulogenesis fase precoce e tardiva.

Questo articolo fornisce un metodo per isolare e quaglia coltura o pollo HH14<sup&gt; -</sup&gt; Valvola di cellule endocardico e HH25 cellule mesenchimali cuscino valvola.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

La corretta formazione e funzione delle valvole cardiache embrionali è fondamentale per la progressione dello sviluppo. Il cuore embrionale precoce è un tubo a forma di U di...

Per isolare in coltura le cellule valvolari aviarie HH 14 prive di cellule endocardiche o le cellule mesenchimali della cuscinetto HH 25, si incubano uova feconde per due giorni. Prima fase HH 14 priva di endocardio oppure 4,5 giorni per HH 25.Gli embrioni vengono quindi isolati ed estratti i cuori. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'isolamento dei canali atrioventricolari HH 14 privi di tratti di efflusso, oppure dei canali atrioventricolari HH 25. I canali atrioventricolari HH 14 privi di tratti di efflusso vengono tagliati longitudinalmente oppure vengono isolati i cuscinetti valvolari atrioventricolari HH 25.Gli espianti HH 14 meno x vengono posizionati con la faccia luminale rivolta verso il basso su gel di collagene. I cuscinetti valvolari HH 25 vengono digeriti con tripsina e le cellule seminate all'interno di gel di collagene, quindi entrambi vengono coltivati. Alla fine, questi modelli tridimensionali in vitro riproducono eventi morfogenetici valvolari chiave e sono utili per analizzare i meccanismi dell'agenesi valvolare nelle fasi iniziali e tardive.Ciao, mi chiamo Gretchen Mahler e lavoro nel dipartimento di ingegneria biomedica della Cornell Universi

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