Valutazione della risposta stomatica a Live cellule batteriche utilizzando Imaging Whole Leaf

In questo procedimento, l'analisi dell'immagine fogliare viene utilizzata per valutare il movimento delle cellule di guardia in risposta a cellule batteriche vive. Innanzitutto, i batteri vengono rianimati da una riserva glicerolata e viene preparato un inocolo. Successivamente, vengono raccolte foglie giovani e sane e colorate con ioduro di propidio.

Le foglie colorate vengono tagliate e i pezzi di foglia sono incubati sulla superficie di una sospensione batterica. Infine, la superficie della foglia viene osservata al microscopio e le aperture degli stomi possono essere misurate. I risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza mostrano variazioni nell'apertura stomatica in risposta ai batteri.

Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di peeling epidermici, è che la foglia a contatto con i batteri rimane integra, simulando le condizioni naturali di penetrazione batterica nelle foglie. Per iniziare questa procedura, si seminano i semi di Arabidopsis in un rapporto uno a uno, uno V a V a V di substrato di coltivazione. Si aggiunge vermiculite e si coltivano le piante in una camera di crescita, innaffiando secondo necessità.

Le piante sono pronte per l'uso dopo quattro-sei settimane, quando presentano foglie giovani completamente espanse e precedenti alla fioritura. Due giorni prima di iniziare l'esperimento, preparare la coltura batterica per striscio. Pseudomonas ringe da stock glicerolato su mezzo LB modificato e incubare per 24 ore a 28 gradi Celsius.

Utilizzare una coltura fresca per preparare l'inoculo e avviare sempre le piastre di coltura da stock glicerolati. Poiché i batteri diventano meno virulenti dopo il subcultivo, utilizzare batteri cresciuti sulla piastra per avviare una coltura liquida di 10 millilitri di pseudomona singe. In un matraccio erlenmeyer da 50 millilitri, incubare la coltura tutta la notte a 28 gradi Celsius con agitazione vigorosa fino a raggiungere una densità ottica (od) a 600 nanometri compresa tra 0,8 e 1.

Misurare l'OD a 600 e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.360 ×g per 10 minuti. Ri-sospendere le cellule in acqua distillata in modo che l'OD finale sia 0,2. Questo valore di OD corrisponde a 10 alla potenza di otto unità formanti colonie per millilitro.

Con i batteri pronti, procedere a preparare le foglie ed eseguire il saggio per colorare le foglie. Preparare innanzitutto una soluzione di propidio ioduro, o PI, di 20 micromolari in acqua. Una quantità di 10 millilitri di soluzione è sufficiente per colorare tre piccole foglie alla volta.

Prelevare le piante dalla camera di crescita e, con pinzette, staccare tre foglie giovani completamente espanse. Immergere interamente le foglie nella soluzione di ioduro di propidio (PI) per cinque minuti. Successivamente, rimuovere le foglie e risciacquarle brevemente con acqua distillata.

Successivamente, posizionare una foglia con la superficie inferiore rivolta verso il basso su un vetrino da microscopio. Tagliare la foglia in quattro pezzi con una lametta affilata, escludendo la nervatura centrale in modo che la foglia giaccia piatta sul vetrino per incubare i batteri con le foglie. Aggiungere 300 microlitri di sospensione batterica sotto i pezzi di foglia sul vetrino, assicurandosi che la superficie inferiore della foglia sia a contatto con l'inoculo.

Incubare i campioni nelle stesse condizioni ambientali utilizzate per la crescita delle piante. Quando è il momento di osservare le foglie al microscopio, trasferire i pezzi di foglia su un nuovo vetrino con la superficie inferiore rivolta verso l'alto. Si noti che non viene utilizzata una lamella durante il montaggio dei vetrini.

Lo stesso campione di foglia può essere sottoposto a ripetute acquisizioni di immagini durante l'incubazione, e un corso temporale può essere impostato in base agli obiettivi della ricerca. In questo caso, si utilizza un microscopio confocale a scansione laser per esaminare le foglie, osservare la superficie inferiore delle foglie al fine di rilevare la fluorescenza del PI utilizzando gli stessi campioni di foglia, e acquisire immagini degli stomi nel tempo. Salvare le immagini per misurare l'ampiezza dell'apertura stomatica.

Misurare la larghezza dell'apertura stomatica di almeno 60 stomi per ogni trattamento in ciascun punto temporale. Utilizzando il browser delle immagini LSM, calcolare la media e l'errore standard della larghezza dell'apertura stomatica. La significatività statistica dei risultati può essere calcolata mediante test t di Student a due code per campioni appaiati.

Il test T qui mostrato è un'immagine microscopica tipica della superficie di una foglia di arabidopsis osservata al microscopio confocale a scansione laser. In visione campo chiaro, l'ioduro di propidio colora la parete cellulare delle cellule vitali, aumentando la visibilità delle cellule di guardia e permettendo inoltre l'identificazione di cellule non danneggiate. In questi micrografici è possibile osservare una gamma di aperture stomatiche, da stomata completamente chiusi a stomata completamente aperti.

Gli stomi completamente chiusi vengono identificati in base alla forma delle cellule di guardia. Per gli stomi aperti, la larghezza dell'apertura è considerata pari a zero micrometri. La larghezza dell'apertura mostrata viene misurata tracciando una linea retta lungo l'area più larga del poro stomatale.

Questi sono risultati sperimentali tipici del saggio di inoculazione su foglie vive. Le foglie di Arabidopsis sono state incubate al buio con tre ceppi diversi di Pseudomonas Cy Ringe; soltanto il batterio P-S-T-D-C 3000 è stato in grado di aprire gli stomi al buio, come misurato dall'ampiezza dell'apertura di 60 stomi scelti casualmente per ogni ceppo batterico. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni pianta-batterio per esplorare i meccanismi della risposta precoce ai patogeni nelle specie vegetali.