Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la velocità con cui i virus vengono prodotti nelle comunità microbiche acquatiche. Questo viene ottenuto innanzitutto riducendo l'abbondanza di virus liberi nel campione di interesse, mantenendo al contempo la comunità microbica nativa. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'incubare i campioni in condizioni induttive e nel prelevare sottocampioni ogni due o tre ore per un massimo di 10 ore.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel enumerare i virus all'interno dei sottocampioni raccolti in ciascun punto temporale. L'ultimo passaggio della procedura è determinare la velocità con cui è aumentata l'abbondanza delle particelle virali all'interno del campione e calcolare i tassi di produzione virale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i tassi di produzione virale all'interno della comunità microbica a partire dalle enumerazioni, consentendo ai ricercatori di dedurre i tassi di mortalità microbica dovuti all'attività virale.

Ciao a tutti. Mi chiamo Audrey Madison e lavoro nel laboratorio del Dottor Steven Milham e nel Dipartimento di Microbiologia dell'Università del Tennessee. Oggi, con l'aiuto di Charles Budoff e Claire Campbell, vi mostreremo un procedimento per analizzare i tassi di produzione dei virus nei sistemi acquatici.

Per fare ciò, riduciamo il numero di virus liberi nei campioni e quantifichiamo la velocità con cui ricompaiono in seguito alla lisi di microorganismi infettati da virus. Attualmente utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'ecologia dei virus e il modo in cui possono modellare le comunità microbiche. Ora che abbiamo fatto l'introduzione, procediamo pure.

Prima di iniziare questa procedura, raccogliere circa 20 litri di acqua di mare in modo il più asettico possibile. Una volta raccolto il campione, prefiltrare l'acqua attraverso un filtro da 142 millimetri di diametro e 0,8 micron. Per sistemi biologicamente produttivi, si può prevedere una filtrazione preliminare attraverso un filtro a porosità maggiore o un filtro in fibra di vetro.

Per ottenere acqua ultrafiltrata, impostare un sistema di ultrafiltrazione come il sistema AmCon M 12 con una cartuccia a membrana avvolta a spirale per escludere tutti i virus. I virus nel campione vengono quindi rimossi e concentrati a circa il 25% della velocità massima con una pressione retrostante di 15-16 chilopascal. Il concentrato, pari a circa 500 millilitri, contiene la comunità virale ormai concentrata, che può essere conservata per altri studi, mentre il permeato privo di virus verrà utilizzato per saggi di produzione virale.

Dopo ogni giornata di utilizzo, pulire il sistema Omicron M 12 per prevenire danni alla membrana della cartuccia filtrante. Quando si lavora con acqua di mare, risciacquare la membrana con almeno sei litri di acqua Milli Q, seguito da un lavaggio con soluzione di idrossido di sodio 0,1 molare per 30-45 minuti. Successivamente, risciacquare la cartuccia con almeno altri sei litri di acqua Milli Q.

Una volta terminato, il cartuccia a spirale può essere conservata in una soluzione di acido fosforico 0,05 molare a quattro gradi Celsius. Per iniziare il metodo di riduzione virale, 500 millilitri di campione di acqua di mare proveniente dallo stesso luogo in cui è stata ottenuta l'acqua priva di virus vengono posti in un'unità filtrante stereo dotata di un filtro con dimensione nominale dei pori di 0,2 micro, a basso legame proteico. A questo punto, raccogliere anche un sottocampione per determinare l'abbondanza totale di virus e batteri nell'acqua iniziale.

Applicare delicatamente una pressione di vuoto inferiore a 200 millimetri di mercurio mentre si sospende continuamente il campione utilizzando una pipetta sterile per trasferimenti, al fine di impedire che le cellule batteriche si concentrino sul filtro. Aggiungere lentamente tre volumi, pari a 500 millilitri, di ultrafiltrato per ridurre l'abbondanza di virus liberi nel campione, mantenendo al contempo le popolazioni batteriche a una densità costante. Infine, diluire nuovamente la frazione batterica fino a raggiungere un volume di 500 millilitri con acqua ultrafiltrata priva di virus. Successivamente, dividere il campione in tre replicati da 150 millilitri e posizionare i replicati in bottiglie trasparenti in policarbonato da 250 millilitri.

Questo rappresenta il tuo set di campioni al tempo zero. Preleva campioni per le stime dell'abbondanza batterica e virale dai tuoi campioni al tempo zero. Trasferisci i campioni in provette criogeniche con una concentrazione finale di glutaraldeide sterile compresa tra il 2,0% e il 2,5%.

Come fissativo, congelare immediatamente e rapidamente questi campioni con azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'elaborazione. In alternativa, è possibile utilizzare un sistema a flusso tangenziale per concentrare i microrganismi marini. Per utilizzare il metodo TFF, ottenere circa 500 millilitri del campione naturale.

Concentrare questo campione utilizzando un sistema di filtrazione tangenziale con dimensione nominale dei pori di 0,2 micron quando la frazione batterica è ridotta a circa 10-15 millilitri in acqua ultrafiltrata priva di virus come descritto per il metodo di riduzione dei virus, quindi incubare le bottiglie replicate risultanti in condizioni di incitamento. Utilizzando camere ambientali in mare, impieghiamo incubatori a circolazione di acqua di mare collegati a una fonte di acqua di superficie che mantiene temperature ambientali. I livelli di luce possono essere adattati alle condizioni di superficie utilizzando acrilico tinto in blu o una rete schermante di densità neutra per ridurre l'intensità luminosa.

Quando si lavora da una stazione di campo o da un laboratorio, oppure quando l'acqua di mare non è disponibile, si può utilizzare un incubatore per la crescita con illuminazione. Continuare a prelevare sottocampioni ogni 2,5 ore per almeno 10 ore, seguendo il metodo utilizzato per il campione al tempo zero. Oltre ai campioni per microscopia, alcuni ricercatori vorranno raccogliere acqua per l'analisi di PCR quantitativa di virus specifici.

Per i campioni di QPCR, aggiungere cinque millilitri del campione in una provetta criogenica senza agente fissativo e congelare immediatamente in azoto liquido in previsione della microscopia per la produzione virale; scongelare i campioni congelati sul ghiaccio e preparare frescamente le soluzioni come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, posizionare un filtro a disco da 25 millimetri con pori di dimensione 0,02 micron sopra un filtro di supporto in cellulosa da 0,45 micron. Quindi aggiungere 850 microlitri del campione fissato sulla parte superiore del filtro anadi e sottoporre a vuoto a una pressione inferiore a 20 chilopascal fino a completa essiccazione.

Una volta che il filtro ano è asciutto, pipettare 100 microlitri di soluzione working di cyber green in una piastra di Petri sterile. Con il vuoto ancora attivo, rimuovere con attenzione il disco ano dalla torre del filtro e posizionarlo sulla soluzione di cyber green. Incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 20 minuti.

Rimuovere con attenzione il filtro dalla soluzione di cyber green e asciugare il retro del filtro con un fazzoletto Kim per eliminare tutto il colorante residuo. Quindi aggiungere una piccola goccia di soluzione Antifa a un vetrino da microscopio e posizionare un coprioggetto sulla parte superiore. Rimuovere il coprioggetto e aggiungere il filtro essiccato al vetrino da microscopio.

Aggiungere nuovamente una piccola quantità di soluzione Antifa sul vetrino e posizionarlo lentamente sulla parte superiore del filtro, assicurandosi di rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero formarsi. Enumerare i virus mediante microscopia a fluorescenza con un ampio filtro blu, contando almeno 20 campi per ogni filtro, assicurandosi di quantificare il numero totale di virus per ogni campo della griglia per garantire una distribuzione uniforme dei virus attraverso la membrana del filtro. Calcolare le velocità medie di ricorrenza virale a partire dalle tre repliche indipendenti e determinare la deviazione standard a partire dai tassi di produzione. Infine, correggere questi tassi per il diluimento dei microorganismi, passando dall'abbondanza iniziale a quella diluita nel campione con riduzione di virus.

Il set primario di dati risultante da questo studio è costituito dalle frequenze di ricorrenza dell'abbondanza virale nei sottocampioni provenienti dalle incubazioni. Questi risultati formano regressioni indipendenti dell'abbondanza virale rispetto al tempo per ciascuno dei campioni. La produzione di particelle simili a virus è stata monitorata durante un'incubazione di 10 ore in condizioni di luce naturale mediante microscopia a fluorescenza episcopica.

Questi campioni sono stati raccolti durante un fiore di fitoplancton al largo della costa della Nuova Zelanda nel settembre 2008. Vi abbiamo appena mostrato come stimare i tassi di produzione virale. Questo include l'uso di diversi sistemi di ultrafiltrazione e la conduzione di esperimenti per misurare i tassi di produzione virale.

Inoltre, vi abbiamo mostrato come enumerare questi virus mediante microscopia a fluorescenza episcopica. Durante questa procedura, è importante ricordare di utilizzare attrezzature pulite, manipolare con cura i virus colorati, ridurre l'esposizione alla luce, elaborare rapidamente i campioni e pulire correttamente le cartucce di ultrafiltrazione dopo ogni utilizzo. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.