Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde
23 settembre 2010
Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le cellule positive all'HIV utilizzando un vettore lentivirale dipendente dalla proteina rev dell'HIV-1 che esprime la proteina verde fluorescente. Questo viene ottenuto innanzitutto producendo le particelle lentivirali dipendenti da rev mediante cotrasfezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'infettare cellule T umane CD4 con l'HIV-1.
Successivamente, le cellule T CD4 umane positive per l'HIV vengono superinfettate con particelle lentivirali portatrici del gene GFP. L'ultimo passaggio consiste nell'identificare le cellule positive per l'HIV misurando le cellule positive per GFP mediante citometria a flusso. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano la percentuale di cellule positive per GFP attraverso la citometria a flusso.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'infezione da HIV poiché il vettore dipendente da rev può anche trasportare ed esprimere in modo selettivo geni terapeutici nelle cellule infette da HIV, inducendo la morte delle cellule positive al virus. A dimostrazione della procedura sarà presente gi, un professore assistente del nostro laboratorio, per produrre particelle lentivirali dipendenti da rev. Le cellule HEK 293T vengono trasfettate con tre plasmidi: il vettore lentivirale dipendente da rev che esprime GFP, il costrutto di impacchettamento di HIV-1 e un plasmide contenente la glicoproteina VSVG. Un giorno prima della trasfezione, seminare due volte 10 alla sesta cellule HEK 293T in 10 millilitri di mezzo di coltura.
In una piastra di Petri da 100 millimetri, coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo sovrastante delle cellule con cinque millilitri di mezzo fresco.
Quindi proseguire la coltura cellulare per quattro ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Preparare i reagenti per la trasfezione prima della fine dell'incubazione di quattro ore. Le cellule HEK 293T verranno trasfettate con i tre plasmidi in un rapporto di 10 microgrammi di vettore lentivirale GFP dipendente da rev, 7,5 microgrammi di costrutto di impacchettamento di HIV-1 e 2,5 microgrammi di glicoproteina VSVG.
Prima mescolare i tre DNA plasmidici nel rapporto desiderato. Quindi preparare due tubi in polistirene da cinque millilitri. Aggiungere 480 microlitri di buffer HBS due volte al primo tubo e al secondo tubo.
Aggiungere 60 microlitri di tampone di cloruro di calcio 2 M ai DNA plasmidici e al tampone di trasfezione, portando il volume totale a 480 microlitri. Successivamente, aggiungere la miscela di DNA plasmidico e cloruro di calcio. Gocciolare nella provetta con HPS 2× e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Si formerà gradualmente un precipitato fine. Aggiungere ora tutti i 960 microlitri della miscela in modo goccia a goccia mediante peppe alle cellule HEK 2 9 3 T. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, durante la notte.
Il giorno successivo, rimuovere il sopranatante S e aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco. Incubare nuovamente le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, durante la notte. A 48 ore dal transfezione, raccogliere il virus rimuovendo il sopranatante e trasferendolo in un tubo sterile da 50 millilitri.
Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco nella piastra di Petri e continuare la coltura per tutta la notte. Conservare il virus in posizione supina a quattro gradi Celsius. Proseguire con la raccolta a 72 ore post trasfezione raccogliendo il sopranatante e combinandolo con il sopranatante raccolto in precedenza.
Quindi centrifugare il sopranatante S a 500 ×g per 15 minuti per formare un pellet ed eliminare i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, raccogliere il sopranatante S e trasferirlo in un nuovo tubo. Successivamente, filtrare il sopranatante attraverso un filtro Millipore da 0,22 micrometri.
Il virus verrà ulteriormente concentrato mediante una colonna a esclusione dimensionale, che verrà mostrata successivamente per concentrare le particelle virali. Caricare il sopranatante virale in una colonna a esclusione dimensionale e centrifugare a 6.000 × g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogliere il sopranatante virale concentrato, mettendo da parte circa 100 microlitri per determinare il titolo virale.
Aliquotare il resto e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. La determinazione del titolo virale è uno degli aspetti più critici di questa procedura. È necessaria una maggiore diffusione di infezione per un'infezione sovrapposta delle cellule con il vettore virale GFP.
Al fine di ottenere una percentuale di cellule GFP positive rilevabili mediante citometria a flusso per determinare il titolo virale, una linea cellulare di gatto TNF-trattata positiva per HIV V1 verrà infettata con il sopernatante virale. Queste cellule positive per HIV V1 vengono coltivate.
In una piastra a 96 pozzetti, a 2,5 volte 10 alla cinque cellule per millilitro in un volume totale di 100 microlitri. Preparare sei diluizioni seriali decimali di particelle lentivirali dipendenti da rev per infettare le cellule positive per HIV-1; aggiungere 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale del virus in ogni pozzetto contenente cellule. Incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica per sette giorni.
Il titolo della particella viene stimato osservando le cellule GFP positive al microscopio a fluorescenza. I calcoli vengono effettuati seguendo il metodo di Reid e MU e il titolo viene determinato come il punto di diluizione che può produrre pozzetti GFP positivi. Nel 50% dei pozzetti infettati fino al livello IV, si osservano cellule positive con le particelle lentivirali dipendenti da rev.
Una linea cellulare umana di linfociti T CD4 verrà innanzitutto infettata con HIV-1. Utilizziamo due volte 10 alla cinque cellule per ogni infezione. Due ore prima dell'infezione.
Aggiungere poli-brain alle cellule fino a una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, infettare le cellule aggiungendo la soluzione di HIV in uno dei tubi da cinque millilitri.
I due altri tubi di cellule non vengono infettati e fungeranno da controlli. Incubare tutte le cellule a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, centrifugare le cellule a 300 ×g per 10 minuti, rimuovere il virus privo di cellule scartando il sopranatante e risospendere le cellule in mezzo fresco a una concentrazione di 2 × 10⁵ cellule per millilitro di coltura a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Dopo 48 ore, le cellule infette da HIV sono pronte per l'infezione. Utilizzare due volte 10 alla cinque cellule per l'infezione con 100 microlitri di particelle lentivirali dipendenti da rev sulle cellule umane CD4 T infette da HIV V1 come controllo; le cellule umane CD4 T non infette da HIV V1 vengono inoltre infettate con 100 microlitri di particelle lentivirali. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte e procedere il giorno seguente.
Sostituire il mezzo usato con mezzo fresco e risospendere le cellule a una concentrazione di due volte 10 alla cinque cellule per millilitro. A 48 ore dall'infezione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, quindi risospendere in 500 microlitri di paraformaldeide al 1% e trasferire le cellule risospese in un tubo per citometria a flusso per l'analisi. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, le cellule possono essere analizzate su un analizzatore FACS per la positività alla GFP.
Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il vettore lentivirale dipendente da rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permetterà il rilevamento altamente specifico dell'HIV in replicazione in popolazioni cellulari vive mediante la misurazione dell'espressione della proteina fluorescente verde GFP. In questo esempio, le cellule C-E-M-S-S raccolte sono state marcate con un anticorpo monoclonale di ratto coniugato a PE contro il CD 24 HSA murino e successivamente analizzate al citometro a flusso per l'espressione sia di HSA che di GFP, come mostrato qui. Una popolazione GFP di notevoli dimensioni è stata rilevata nelle cellule infettate da HIV-1 e superinfettate con V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.
Al contrario, le cellule positive per GFP non sono state rilevate né nelle cellule C-E-M-S-S non infette da HIV V prive di superinfezione lentivirale, né nelle cellule non infette da HIV una con superinfezione lentivirale. Non dimenticare che lavorare con l'HIV può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'adozione di adeguati livelli di sicurezza biologica, devono essere sempre osservate durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo vettore lentivirale progettato per rilevare le cellule positive all'HIV mediante l'espressione di GFP in modo dipendente dalla proteina Tat e Rev dell'HIV-1. Il metodo consente l'identificazione dell'HIV in replicazione in cellule vive, con significative implicazioni per applicazioni terapeutiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Virologia
- Terapia Genica
Sfondo
- L'infezione da HIV rimane un importante problema sanitario globale.
- I metodi attuali per rilevare le cellule positive all'HIV sono limitati.
- I vettori lentivirali possono essere ingegnerizzati per esprimere geni specifici.
- L'elemento di risposta alla proteina Rev (RRE) migliora la specificità del rilevamento.
Scopo dello studio
- Sviluppare un vettore lentivirale che consenta il rilevamento delle cellule positive all'HIV.
- Utilizzare l'espressione di GFP come marcatore per identificare le cellule infette.
- Esplorare le implicazioni terapeutiche del vettore nel trattamento dell'HIV.
Metodi Utilizzati
- Cotrasfezione di cellule HEK 293T per produrre particelle lentivirali.
- Infezione di linfociti T CD4 umani con HIV-1 seguita da superinfezione con il vettore lentivirale.
- Citometria a flusso per misurare le cellule positive per GFP.
- Determinazione del titolo virale mediante diluizioni seriali e osservazione della GFP.
Risultati principali
- Produzione riuscita di particelle lentivirali dipendenti da Rev.
- Identificazione di cellule positive per HIV mediante espressione di GFP.
- I risultati della citometria a flusso hanno indicato una percentuale quantificabile di cellule infette.
- Il vettore ha dimostrato potenzialità nel trasferire geni terapeutici.
Conclusioni
- Il vettore lentivirale sviluppato è efficace nel rilevare le cellule positive all'HIV.
- Questo metodo potrebbe migliorare le strategie terapeutiche per l'infezione da HIV.
- Studi futuri potrebbero concentrarsi sull'ottimizzazione del vettore per applicazioni di terapia genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una rilevazione altamente specifica dell'HIV in replicazione in popolazioni cellulari vive, affrontando una sfida fondamentale nella validazione di bersagli antivirali, in cui l'attività nonspecifica del reporter complica l'interpretazione meccanicistica. Collegando l'espressione di GFP sia alla dipendenza da Tat che da Rev, il vettore riduce i falsi positivi derivanti dagli stati di attivazione cellulare, migliorando l'affidabilità predittiva nei test iniziali di composti terapeutici contro l'HIV. L'approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo un segnale quantificabile basato sulla fluorescenza per valutare gli effetti dei composti sui cicli di replicazione virale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della regolazione trascrizionale e post-trascrizionale specifica per HIV mediante espressione di un reporter dipendente da Tat e Rev.
- Valore operativo: Riduce il rumore di fondo proveniente da vettori contenenti solo LTR, aumentando la specificità del saggio nelle campagne di validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Permette di selezionare composti in grado di interferire con l'export dipendente da Rev o con la replicazione virale in fase tardiva.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un'uscita quantitativa compatibile con la citometria a flusso per misurare le cellule positive per GFP come indicatore di HIV replicante.
- Valore operativo: Permette flussi di lavoro standardizzati e riproducibili di infezione e superinfezione nei modelli di cellule T CD4+.
- Scalabilità: La determinazione del titolo virale mediante diluizione seriale supporta la normalizzazione del saggio tra diverse piastre di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega il rilevamento precoce di cellule positive all'HIV al successivo trasferimento genico terapeutico all'interno dello stesso sistema vettoriale.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Permette di valutare se i composti candidati riducono il segnale GFP inibendo la replicazione piuttosto che attraverso citotossicità.
- Sistema rilevante per la malattia: Utilizza linfociti T umani CD4+ superinfettati per modellare contesti di replicazione dell'HIV fisiologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, in cui il rilevamento specifico del virus in replicazione fornisce informazioni per studi sul meccanismo d'azione e supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla riduzione del segnale GFP.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni tra fattori ospite e HIV e sulla funzione dei geni virali mediante l'espressione regolata di un reporter.
- Screening: Permette la prontezza del saggio grazie all'espressione quantificabile di GFP rilevabile mediante citometria a flusso dopo superinfezione.
- Analisi: Genera risultati espressi in percentuale di cellule GFP-positive, consentendo il confronto tra diverse condizioni di trattamento e titoli virali.
- Ricerca traslazionale: Collega la capacità di rilevamento al potenziale terapeutico tramite il trasferimento di geni effettori nello stesso vettore.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma può essere adattata per altri virus a RNA sostituendo gli elementi regolatori, mantenendo al contempo il design a doppia dipendenza.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo distinguendo i segnali veramente dipendenti dall'HIV dagli artefatti di attivazione cellulare.
- Valore operativo: Standardizza il flusso di lavoro di rilevamento utilizzando la produzione lentivirale, la titolazione e la lettura mediante citometria a flusso.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo i falsi positivi nei test di screening antivirali.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su una riduzione misurabile del segnale virale replicante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella produzione di vettori lentivirali, nei protocolli di biosicurezza per l'HIV e nell'uso della citometria a flusso.
- Presuppone l'accesso a cellule HEK 293T per il confezionamento virale e a modelli di cellule T umane CD4+ per l'infezione.
- Necessita della standardizzazione dei tempi di superinfezione e della quantificazione del titolo virale tra diversi laboratori.
- L'adattamento a cellule primarie o a modelli alternativi potrebbe richiedere un'ottimizzazione dell'efficienza di infezione e dell'attività del promotore.
- Limite pratico: il segnale dipende dall'espressione attiva di Rev, che potrebbe non rilevare stadi latenti o precoci post-integrazione.
