Name: Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara a identificare cellule HIV-positive con un vettore lentivirale Rev-dipendente che esprime GFP. Questo metodo utilizza citometria a flusso per rilevare l'infezione virale in cellule CD4 T umane vive.

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Il lavoro è stato sostenuto in parte da Public Health Service concedere 1R01AI081568 dal NIAID a YW e dalle generose donazioni dei donatori e piloti del giro 2009 NYCDC Aids organizzato da M. Rosen e Day2 Inc.

1. Trasfezione di plasmidi per la produzione delle particelle lentivirali Rev-dipendente Set up: The Rev-dipendente GFP vettori lentivirali, PNL-GFP-RRE-SA, è stato descritto in precedenza 4,5,6. Per assemblare in una particella virale, il plasmide è stato contransfected in cellule HEK293 T con HIV-1 costruire imballaggi, pCMVΔ8.2 (gentilmente fornito dal Dr. Didier Trono), e un plasmide porta la glicoproteina VSV-G (pHCMV-G) . La trasfezione è stata effettuata utilizzando il metodo di fosfato di calcio. Preparazione di tamponi: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) è stata preparata sciogliendo 5 g di Hepes, 8 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 1 g di destrosio, 0,103 g di Na 2 HPO 4 (anidro) in 100 ml di H 2 O. Aliquota the10 X tampone HBS in 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C. Al momento della transfezione, convertire il X 10 HBS a 2 x HBS con H 2 O (1: 5 diluizione), e portare il pH compreso tra 7,05-7,12. (Per 10 ml 2 X HBS, che di solito richiede circa 50 ml di NaOH 1M). Filtro sterilizzare il tampone HBS 2X passando attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampone 2 è stata preparata sciogliendo CaCl 2 in 10 mm ad un Hepes 2M concentrazione finale. Regolare il pH a 5,8, filtro sterilizzare il buffer e conservare a 4 ° C. Procedimento: <ol><li> Un giorno prima della transfezione, semi di 2 x 10 6 cellule HEK293T in un 100 mm Petri-piatto, e far crescere le cellule durante la notte in 10 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dopo, togliere surnatante dalle cellule e sostituirlo con 5 ml fresca DMEM + 10% FBS, continuamente le cellule di coltura per 4 ore. </li><li> In un tubo di polistirene da 5 ml, aggiungere 480 microlitri di buffer HBS 2X. </li><li> In un secondo tubo 5 ml in polistirolo, aggiungere 60 microlitri 2M CaCl 2 buffer, il DNA plasmidico e trasfezione di buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) per un volume totale di 480 microlitri. Per ogni Petri-piatto, plasmidi deve essere aggiunto nella proporzione di 10 mcg di PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mcg di pCMVΔR8.3, e 2,5 mg di pHCMV-G. </li><li> Aggiungere il plasmide DNA CaCl 2 miscela goccia a goccia nella provetta 2 X HBS, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Un precipitato bene si formerà. </li><li> Aggiungere il 960 microlitri della miscela goccia a goccia dalla pipetta per le cellule. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 durante la notte. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di fresca DMEM + 10% FBS, e continuamente incubare le cellule a 37 ° C CO, 5% 2 durante la notte. </li><li> A 48 ore dopo la transfezione, raccogliere il virus eliminando il supernatante e trasferirlo in 50 mL sterile. Aggiungere 10 ml fresca fresca FBS DMEM + 10% in ogni Petri-piatto e continuare a cultura durante la notte. Conservare il supernatante virus a 4 ° C. </li><li> Continuare a raccogliere a 72 ore dopo la trasfezione raccogliendo il sopranatante. Unire tutti i surnatanti, e centrifugare il surnatante a 500 xg per 15 minuti per far sedimentare e rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Il supernatante sono stati raccolti e filtrata attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. Il virus si è ulteriormente concentrata nella dimensione-esclusione colonne. </li></ol> 2. Concentrare le particelle virali e determinare titolo virale <ol><li> Particelle virali si sono concentrati da una dimensione di esclusione colonna (100.000 MW tagliati fuori, Centricoin). Surnatante virale è stato caricato in colonna, e centrifugati a 6.000 xga 4 ° C per 15 minuti. </li><li> Surnatante concentrato virale è stato raccolto, frazionare e conservati a -80 ° C. </li><li> Il titolo virale è stata determinata da infezione di un TNF-trattati, l'HIV-1 positivi linea cellulare Jacket, J1.1 7. Le cellule sono state coltivate in una piastra da 96 pozzetti a 2,5 x 10 5 cellule per ml (100 ml in totale), e infettati con 100 ml di diluito serialmente VNL-GFP-RRE-SA per una settimana. Il titolo (TCID50) della particella è stata stimata contando i pozzi GFP positivo seguendo il metodo di Reed e Muench 8. </li></ol> 3. Marcatura di HIV-1 Cellule positive con la particella lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA Set up: un essere umano linea di cellule T CD4, CEM-SS, per la prima volta infettati con HIV-1. A 48 ore dopo l'infezione, le cellule sono state superinfezione con le particelle lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA. A seguito di una superinfezione per altri due giorni, GFP-positive cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Come controllo, l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule sono state infettate con identico VNL-GFP-RRE-SA. Solo l'HIV-1-infetti le cellule CEM-SS ha dato luogo a cellule GFP positive ma non l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Procedimento: <ol><li> Due ore prima dell'infezione, aggiungere polybrane ad una concentrazione finale di 4 mg / ml. Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per ogni infezione. Infettare le cellule con 200 ng (p24) del virus HIV-1 NL4-3 per 2 ore. </li><li> Lavaggio cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti, risospenderecellule in 2 x 10 5 cellule / ml, e la cultura a 37 ° C per 48 ore. </li><li> Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per infezione da VNL-GFP-RRE-SA. Aggiungere 100 ml di VNL-GFP-RRE-SA e incubare a 37 ° C durante la notte. Lavare le cellule e risospendere in 2 x 10 5 cellule / ml. </li><li> Effettuare analisi di citometria a flusso a 48 dopo una superinfezione ore. Cellule infette sono state pellettato e risospese in 500 ml paraformaldehede 1%, incubate a temperatura ambiente per 20 minuti, e poi analizzati in un analizzatore FACScan (Becton Dickinson). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, una popolazione consistente GFP sarà rilevata in HIV-1-infetti le cellule CEM-SS dal citometro a flusso, mentre, nel controllo, le cellule GFP positive non verranno rilevati in HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il Rev-dipendente vettori lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA, permetterà la rilevazione altamente specifici di replicazione HIV in popolazioni di cellule viventi, attraverso la misurazione della proteina verde fluorescente (GFP) espressione. In questo esempio, raccolte CEM-SS cellule sono state colorate con un PE-anticorpo marcato topo topo monoclonale contro CD24, HSA, e quindi analizzati su un citometro di flusso sia per HSA e di espressione della GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Come si vede qui, una popolazione GFP consistente è stata rilevata in HIV-1-cellule infettate con superinfezione VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Al contrario, le cellule GFP positive non sono state rilevate in entrambi i non infetti da HIV-1 CEM-SS cellule senza superinfezione lentivirali (figura 1a) o di HIV-1 le cellule non infette con superinfezione lentivirali (Figura 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come per il precedente sviluppato Tat-dipendente vettori di espressione, il sistema Rev qui descritto è uno sfruttamento di un processo evoluto HIV. L&#39;inclusione di Rev-dipendenza rende l&#39;LTR-based vettore di espressione altamente dipendente dalla presenza di replicazione dell&#39;HIV. L&#39;applicazione di questo vettore come riportato qui, un dipendente del virus HIV-reporter, offre un approccio nuovo romanzo di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore consente di esame delle cellule viventi, può esprimere qualsiasi gene per la sperimentazione clinica o di base, e come uno pseudo-digitato lentivirus ha accesso alla maggior parte dei tipi di cellule e tessuti.

<table><tbody><tr><td>Cappa di sicurezza biologica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a 37&amp;#x00B0;C e 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore a 4&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore a -20&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore a -80&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore cellulare</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare HEK293T</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare CEM-SS</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare Jurkat J1.1</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>FBS inattivato termicamente (HI FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>preparato mediante trasfezione di cellule HeLa con DNA provirale clonato</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>delezione completa di tutti gli ORF di HIV in pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Inserire HIV-1 A5 e D4 in pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>fornito dal Dott. Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS (soluzione salina tampone Hepes)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2M</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide al 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>Provette tonde da 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore da 0,45&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore da 0,20&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Colonna a esclusione dimensionale (cutoff 100.000 MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>Provetta congelata da 2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>Provetta microcentrifuga da 1,7 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

marcatura specifica di hiv-1 cellule positive con un rev-dipendente vector lentivirali esprimendo la proteina fluorescente verde

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

La maggior parte di HIV-reattiva vettori di espressione sono basati sul promotore di HIV, la ripetizione terminale lunga (LTR). Mentre risponde ad una proteina HIV in fase precoce, Tat, la LTR è anche sensibile agli stati di attivazione cellulare e per l&#39;attività di cromatina locale dove l&#39;integrazione è avvenuta. Questo può portare ad alta HIV-indipendente attività, e ha limitato l&#39;utilità di LTR-reporter per marcare le cellule HIV positivi 1,2,3. Qui, abbiamo costruito un vettore di espressione lentivirali che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, numerose sequenze di DNA dell&#39;HIV che includono l&#39;Ap-risposta elemento e dei siti di splicing HIV 4,5,6. Il vettore è stato incorporato in un virus giornalista lentivirale, consentendo il rilevamento altamente specifici di replicare l&#39;HIV in popolazioni di cellule viventi. L&#39;attività del vettore è stata misurata l&#39;espressione della proteina fluorescente verde (GFP). L&#39;applicazione di questo vettore come riportato qui offre un nuovo approccio alternativa ai metodi esistenti, come la PCR in situ o colorazione dell&#39;antigene HIV, di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore può anche esprimere geni terapeutici per la sperimentazione clinica o di base per indirizzare le cellule HIV-positive.

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l&#39;Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l&#39;espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l&#39;individuazione specifica di replicare l&#39;HIV nelle cellule viventi attraverso l&#39;espressione di GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

La maggior parte dei vettori di espressione responsivi all'HIV si basa sul promotore dell'HIV, la ripetizione terminale lunga (LTR). Sebbene siano responsivi a una proteina precoce dell'HIV, Tat, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le cellule positive all'HIV utilizzando un vettore lentivirale dipendente dalla proteina rev dell'HIV-1 che esprime la proteina verde fluorescente. Questo viene ottenuto innanzitutto producendo le particelle lentivirali dipendenti da rev mediante cotrasfezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'infettare cellule T umane CD4 con l'HIV-1.Successivamente, le cellule T CD4 umane positive per l'HIV vengono superinfettate con particelle lentivirali portatrici del gene GFP. L'ultimo passaggio consiste nell'identificare le cellule positive per l'HIV misurando le cellule positive per GFP mediante citometria a flusso. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano la percentuale di cellule positive per GFP attraverso la citometria a flusso.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'infezione da HIV poiché il vettore dipendente da rev può anche trasportare ed esprimere in modo selettivo geni terapeutici nelle cellule infette da HIV, inducendo la morte delle cellule positive al virus. A dimostrazione della procedura sarà presente gi, un professore assistente del nostro laboratorio, per produrre particelle lentivirali dipendenti da rev. Le cellule HEK 293T vengono trasfettate con tre plasmidi: il vettore lentivirale dipendente da rev che esprime GFP, il costrutto di impacchettamento di HIV-1 e un plasmide contenente la glicoproteina VSVG. Un giorno prima della trasfezione, seminare due volte 10 alla sesta cellule HEK 293T in 10 millilitri di mezzo di coltura.In una piastra di Petri da 100 millimetri, coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo sovrastante delle cellule con cinque millilitri di mezzo fresco.Quindi proseguire la coltura cellulare per quattro ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Preparare i reagenti per la trasfezione prima della fine dell'incubazione di quattro ore. Le cellule HEK 293T verranno trasfettate con i tre plasmidi in un rapporto di 10 microgrammi di vettore lentivirale GFP dipendente da rev, 7,5 microgrammi di costrutto di impacchettamento di HIV-1 e 2,5 microgrammi di glicoproteina VSVG.Prima mescolare i tre DNA plasmidici nel rapporto desiderato. Quindi preparare due tubi in polistirene da cinque millilitri. Aggiungere 480 microlitri di buffer HBS due volte al primo tubo e al secondo tubo.Aggiungere 60 microlitri di tampone di cloruro di calcio 2 M ai DNA plasmidici e al tampone di trasfezione, portando il volume totale a 480 microlitri. Successivamente, aggiungere la miscela di DNA plasmidico e cloruro di calcio. Gocciolare nella provetta con HPS 2× e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Si formerà gradualmente un precipitato fine. Aggiungere ora tutti i 960 microlitri della miscela in modo goccia a goccia mediante peppe alle cellule HEK 2 9 3 T. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, durante la notte.Il giorno successivo, rimuovere il sopranatante S e aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco. Incubare nuovamente le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, durante la notte. A 48 ore dal transfezione, raccogliere il virus rimuovendo il sopranatante e trasferendolo in un tubo sterile da 50 millilitri.Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco nella piastra di Petri e continuare la coltura per tutta la notte. Conservare il virus in posizione supina a quattro gradi Celsius. Proseguire con la raccolta a 72 ore post trasfezione raccogliendo il sopranatante e combinandolo con il sopranatante raccolto in precedenza.Quindi centrifugare il sopranatante S a 500 ×g per 15 minuti per formare un pellet ed eliminare i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, raccogliere il sopranatante S e trasferirlo in un nuovo tubo. Successivamente, filtrare il sopranatante attraverso un filtro Millipore da 0,22 micrometri.Il virus verrà ulteriormente concentrato mediante una colonna a esclusione dimensionale, che verrà mostrata successivamente per concentrare le particelle virali. Caricare il sopranatante virale in una colonna a esclusione dimensionale e centrifugare a 6.000 × g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogliere il sopranatante virale concentrato, mettendo da parte circa 100 microlitri per determinare il titolo virale.Aliquotare il resto e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. La determinazione del titolo virale è uno degli aspetti più critici di questa procedura. È necessaria una maggiore diffusione di infezione per un'infezione sovrapposta delle cellule con il vettore virale GFP.Al fine di ottenere una percentuale di cellule GFP positive rilevabili mediante citometria a flusso per determinare il titolo virale, una linea cellulare di gatto TNF-trattata positiva per HIV V1 verrà infettata con il sopernatante virale. Queste cellule positive per HIV V1 vengono coltivate.In una piastra a 96 pozzetti, a 2,5 volte 10 alla cinque cellule per millilitro in un volume totale di 100 microlitri. Preparare sei diluizioni seriali decimali di particelle lentivirali dipendenti da rev per infettare le cellule positive per HIV-1; aggiungere 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale del virus in ogni pozzetto contenente cellule. Incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica per sette giorni.Il titolo della particella viene stimato osservando le cellule GFP positive al microscopio a fluorescenza. I calcoli vengono effettuati seguendo il metodo di Reid e MU e il titolo viene determinato come il punto di diluizione che può produrre pozzetti GFP positivi. Nel 50% dei pozzetti infettati fino al livello IV, si osservano cellule positive con le particelle lentivirali dipendenti da rev.Una linea cellulare umana di linfociti T CD4 verrà innanzitutto infettata con HIV-1. Utilizziamo due volte 10 alla cinque cellule per ogni infezione. Due ore prima dell'infezione.Aggiungere poli-brain alle cellule fino a una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, infettare le cellule aggiungendo la soluzione di HIV in uno dei tubi da cinque millilitri.I due altri tubi di cellule non vengono infettati e fungeranno da controlli. Incubare tutte le cellule a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, centrifugare le cellule a 300 ×g per 10 minuti, rimuovere il virus privo di cellule scartando il sopranatante e risospendere le cellule in mezzo fresco a una concentrazione di 2 × 10⁵ cellule per millilitro di coltura a 37 gradi Celsius per 48 ore.Dopo 48 ore, le cellule infette da HIV sono pronte per l'infezione. Utilizzare due volte 10 alla cinque cellule per l'infezione con 100 microlitri di particelle lentivirali dipendenti da rev sulle cellule umane CD4 T infette da HIV V1 come controllo; le cellule umane CD4 T non infette da HIV V1 vengono inoltre infettate con 100 microlitri di particelle lentivirali. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte e procedere il giorno seguente.Sostituire il mezzo usato con mezzo fresco e risospendere le cellule a una concentrazione di due volte 10 alla cinque cellule per millilitro. A 48 ore dall'infezione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, quindi risospendere in 500 microlitri di paraformaldeide al 1% e trasferire le cellule risospese in un tubo per citometria a flusso per l'analisi. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, le cellule possono essere analizzate su un analizzatore FACS per la positività alla GFP.Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il vettore lentivirale dipendente da rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permetterà il rilevamento altamente specifico dell'HIV in replicazione in popolazioni cellulari vive mediante la misurazione dell'espressione della proteina fluorescente verde GFP. In questo esempio, le cellule C-E-M-S-S raccolte sono state marcate con un anticorpo monoclonale di ratto coniugato a PE contro il CD 24 HSA murino e successivamente analizzate al citometro a flusso per l'espressione sia di HSA che di GFP, come mostrato qui. Una popolazione GFP di notevoli dimensioni è stata rilevata nelle cellule infettate da HIV-1 e superinfettate con V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.Al contrario, le cellule positive per GFP non sono state rilevate né nelle cellule C-E-M-S-S non infette da HIV V prive di superinfezione lentivirale, né nelle cellule non infette da HIV una con superinfezione lentivirale. Non dimenticare che lavorare con l'HIV può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'adozione di adeguati livelli di sicurezza biologica, devono essere sempre osservate durante l'esecuzione di questa procedura.

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In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di...

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Dalla scoperta del gene della proteina fluorescente verde, le proteine fluorescenti hanno avuto un impatto sulla biologia cellulare molecolare. Questo protocollo descrive come l'espressione di proteine fluorescenti distinte attraverso l'ingegneria genetica viene utilizzata per il barcoding di singole cellule. La procedura consente di tracciare popolazioni distinte in una miscela di cellule, ideale per applicazioni multiplexate.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Descriviamo un'analisi basata sulle celle per segnalare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Può essere utilizzato per testare gli inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell'impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell'effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.

Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Impara a identificare cellule HIV-positive con un vettore lentivirale Rev-dipendente che esprime GFP. Questo metodo utilizza citometria a flusso per rilevare l'infezione virale in cellule CD4 T umane vive.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde (Video) | JoVE Journal

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

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