Name: Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Impara a isolare mitocondri cardiaci di ratto ad alta accoppiatura per studi di bioenergetica cellulare. Questo protocollo garantisce preparati puri e funzionali per analisi biochimiche avanzate.

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Ringraziamo il Prof. A. Vinogradov e il dottor Vera Grivennikova per l&#39;introduzione degli autori nel campo della biologia dei mitocondri e molti utili suggerimenti e consigli in questa procedura. Gli autori sono grati alla signora Amanda McKintock dall&#39;ufficio Queens University mezzi per l&#39;aiuto con la preparazione video.

Introduzione Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare. Essi possono essere ottenuti in modo rapido e affidabile in grande quantità dal tipo selvaggio o animali knock-out. La procedura generale consiste di digestione del tessuto dalla tripsina, il frazionamento e centrifugazione differenziale. Ci sono diverse condizioni che devono essere tenuti in isolamento dei mitocondri da vari tessuti, compreso il cuore (Fig. 1). <ul><li> Il tessuto deve essere accuratamente tritata, in quanto influisce direttamente sulla produzione dei mitocondri ottenuti. Tessuto cardiaco è meglio tritare con piccole forbici curve e può essere seguita da utilizzare una smerigliatrice Latapie tessuto o, se un macinino tessuto non è disponibile, una pressa aglio con fori di diametro di uscita di circa 1,0 mm di diametro. </li><li> E 'necessario mantenere la temperatura delle soluzioni ad ogni passo. Pertanto l'intera procedura deve essere effettuata in una stanza fredda e tutti gli strumenti e le soluzioni devono essere preparati e raffreddato in anticipo. Se le condizioni di temperatura non sono mantenuti stabili varie proprietà della preparazione può essere perso. Struttura mitocondriale è molto sensibile al gelo così overfreezing della sospensione (per esempio durante la centrifugazione) non è consentito, specialmente se gli studi di trasporto attivo sono importanti. </li><li> Un parametro importante è il tempo-durata della procedura, l'isolamento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la preparazione ottenuto deve essere utilizzato immediatamente. Pertanto, strumenti chirurgici, le soluzioni e gli apparecchi devono essere preparati in anticipo. </li></ul> Materiali e strumenti Strumenti <ol><li> Dritti forbici operativo, punta aguzza </li><li> Forbici curve </li><li> Forcipe </li><li> Scatola di Petri </li><li> Piccolo imbuto + pezzo di nylon filtro (lavata) </li><li> 6 bicchieri da 50 ml </li><li> Due agitatori magnetici e due bagni di ghiaccio </li><li> Un bagno di ghiaccio grande </li><li> 2 barre magnetiche piccoli </li><li> Spatole per raschiare pellet </li><li> Centrifuga tubi </li><li> Stampa del tessuto Latapie (può essere sostituito con stampa aglio) </li><li> Teflon-vetro omogeneizzatori 20ml e 1-2ml </li><li> Rifiuti coppa </li><li> Provette Eppendorf per la finale sospensione mitocondriale e campioni per la determinazione delle proteine </li><li> Bagni di ghiaccio </li></ol> Le soluzioni (calcolato per 2 ratti): <ol><li> Soluzione di lavaggio: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Isolamento tampone: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml di BSA (Sigma A6003) (preparato dal buffer di lavaggio 100 ml). BSA può essere sostituito da meno costosa grassi acidi analoghi. Lo stesso buffer o le sue variazioni isotonica può essere utilizzata come buffer di risospensione. </li><li> Tripsina (Sigma T8003) soluzione: 2.5mg/ml a 1 mM HCl (0,5 ml) </li><li> Tripsina inibitore di soia (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml di tampone di isolamento </li></ol> Protocollo Lo schema generale della procedura è riportato in fig. 1. Cuore deve essere raffreddato e lavato in tampone di lavaggio, il tessuto asportato ventricolare, tritato e omogeneizzato fotolitica durante il trattamento con tripsina. La sospensione è centrifugata a bassa velocità e il supernatante ottenuto viene centrifugato di nuovo alle alte velocità per raccogliere mitocondri. A seconda degli esperimenti previsti nel buffer risospendere può essere sostituito da qualsiasi altra soluzione isotonica. Gli animali sono stati terminati in conformità con il Regno Unito "Animali (procedure scientifiche) Act". dalla dislocazione cervicale seguita da decapitazione. E 'necessario estrarre il cuore subito dopo la decapitazione dell'animale, in modo che non vi è alcun ritardo tra la fine degli animali e di estrazione del cuore. Se l'isolamento parallelo di fegato mitocondri si aspetta i ratti vanno lasciati a digiuno durante la notte prima dell'esperimento. <ol><li> Preparare tre bicchieri contenenti 40 ml di tampone di lavaggio. Raffreddarli nel ghiaccio-sale da bagno da 3 a 5 minuti prima di procedere alla fase successiva. Assicurarsi di non overfreeze e utilizzare immediatamente subito dopo nuvole di cristalli di ghiaccio iniziano a comparire. </li><li> Aprire il torace del ratto decapitato ed estrarre il cuore. Fare piccole incisioni e poi subito a trasferire il cuore alla gelida soluzione nel becher prima. Spremere il cuore per rimuovere il sangue e lo mise nel secondo becher. Ripetere questa operazione per ogni cuore. </li><li> Secco il cuore sulla carta da filtro. Togliere tutto il grasso, sangue rappreso, orecchiette e fasce e la piscina del tessuto ventricolare. </li><li> Tritare il tessuto in pool con piccole forbici curve sul piatto di Petri in ghiaccio per circa 5 minuti fino a quando la dimensione delle particelle è di circa 1-2 mm. </li><li> Mettere il trito in tessuto la stampa dei tessuti e passareattraverso. Essere consapevoli del fatto che una notevole quantità di materiale può rimanere sulla stampa in modo da raccogliere tutto il tessuto cardiaco dalle pareti e fondo della stampa. </li><li> Trasferire il materiale nel becher con 50 ml di tampone di lavaggio e mescolate. Quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro di nylon. Lavare il tessuto tritato sul filtro 3 volte con il tampone di lavaggio e scartare il filtrato. </li><li> Trasferire il tessuto lavato in 20 ml di tampone di lavaggio e posizionarlo nel bagno di ghiaccio sul agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina sotto agitazione costante e avviare il timer. Preparare un altro agitatore magnetico, bagno di ghiaccio e un secondo 50 bicchiere ml. </li><li> Sul 4 ° minuto brevemente omogeneizzare la porzione sospensione da parte con un piccolo vagamente dotato di vetro teflon omogeneizzatore (10-15ml) con diversi colpi su e giù per disperdere la sospensione. Dopo omogeneizzazione trasferire la sospensione nel becher secondo. Ripetere la procedura per il 9 ° minuto, in modo da eseguire l'omogeneizzazione della sospensione due volte in totale. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 10 ml di isolare tampone contenente inibitori della tripsina e incubare per 1 min. </li><li> Filtrare la sospensione di nuovo attraverso un filtro di nylon e salvare il filtrato. Raccogliere la frazione di particolato a sinistra su un filtro e omogeneizzare per 1 min a 15-20 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Combina l'omogeneizzato con il filtrato e centrifugare per 15 minuti a 600g. </li><li> Con attenzione filtrare il supernatante risultante in una provetta da centrifuga nuovo. Evitare la contaminazione del pellet e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. </li><li> Dopo la centrifugazione ad alta velocità scartare il surnatante e lavare il pellet di 2-3 volte con 1 ml di buffer di scartare il soffice strato bianco bordo esterno. Spezzare il pellet con la spatola, ma evitare la macchia rossa di eritrociti in basso. Se le cellule del sangue ottenuto Loos, rimuovere i bit rossi dalla sospensione prima di omogeneizzazione. </li><li> Risospendere il pellet con un piccolo omogeneizzatore o, in alternativa pipettando gentile. Diluire la sospensione con più Isolationbuffer e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in risospensione tampone (un buffer isotonica di scelta) e centrifugare di nuovo. </li><li> La risultante marrone pellet contiene lavato mitocondri intatti. Risospendere il pellet in un volume molto piccolo di tampone isotonica di vostra scelta. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schema dimostrando la procedura passo-passo di isolamento del cuore di ratto mitocondri. Parte superiore, Fasi 1-9: disgregazione del tessuto, il trattamento tripsina e omogeneizzazione; parte inferiore, tappe 10-15: centrifugazione differenziale.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dettagliato protocollo rapido per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento è descritto. Preparato ottenuto può essere utilizzato per la ricerca funzionale o strutturale bioenergetica cellulare, studi di proteomica o analisi del DNA mitocondriale e contenuto di lipidi. Studi biofisici di trasporto attivo di ioni e metaboliti intermedi può essere eseguita anche. E &#39;possibile elaborare ulteriormente la preparazione mitocondriale al fine di isolare particelle submitocondriali, membrana esterna o purificare componenti separati della fosforilazione ossidativa. Il metodo descritto è una modifica del protocollo standard di isolamento da Jacobus e Saks 1. Il rendimento atteso dei mitocondri preparato è di circa 10-15 mg di proteine ​​mitocondriali per cuore e il rapporto di controllo respiratorio sul malato / glutammato di tale preparazione varia da 8 a 12 con la respirazione Stato IV di circa 0,12 mmol O 2 proteine ​​xmin -1 XMG -1 a 23 ° C nel medio composto da saccarosio 0,25 M, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato di potassio (pH 8,0) con 150 ADP mM per la respirazione iniziazione Stato III (per le esatte condizioni sperimentali ed integrazioni, vedi rif . 2). Particolare attenzione dovrebbe essere data ad alcuni dettagli tecnici prima dell&#39;inizio della procedura di isolamento. E &#39;fondamentale utilizzare pulire in policarbonato o provette da centrifuga in polipropilene, quindi i tubi devono essere accuratamente lavati con un pennello pulito e acqua calda, tuttavia il trattamento detergente deve essere mantenuto al minimo. Inoltre, è meglio per raccogliere tutta la vetreria e gli strumenti necessari nella stanza fredda un giorno prima l&#39;isolamento. Durante l&#39;isolamento durante il trasferimento dal buffer di palloni bicchieri, а attenzione particolare deve essere posta per evitare che gocce d&#39;acqua ghiacciata nelle soluzioni. Durante la manipolazione dei tessuti è opportuno sottolineare che l&#39;estrazione cuore deve essere effettuata nel più breve tempo possibile, dal momento che anche a breve tempo di ritardo tra la decapitazione dell&#39;animale e il raffreddamento del tessuto si tradurrebbe in mitocondri parzialmente disaccoppiato. Rapido raffreddamento e lavaggio accurato dei cuori rimosso è essenziale per ottenere la preparazione standard, privo di emoglobina e NADase eritrociti. Tripsina viene utilizzato per connettivo degradazione delle proteine ​​per aumentare la suscettibilità del tessuto per forza di taglio durante l&#39;omogeneizzazione. L&#39;esposizione prolungata del tessuto della proteasi deve essere evitata in quanto si traduce in mitocondri di qualità inferiore. Dopo centrifugazioni ad alta velocità le mura del provette devono essere pulite con la carta velina per rimuovere eventuali depositi di materiale grasso accumulato sulle pareti. Per la risospensione finale è meglio utilizzare un basso volume del buffer finale al fine di minimizzare la perdita di funzioni mitocondriali durante lo stoccaggio (da 150 a 200 ul di buffer per ogni cuore). Per gli studi del trasporto di cationi bivalenti non agenti chelanti devono essere presenti nella preparazione finale così mitocondri devono essere lavati più volte con EGTA-free medio e utilizzato entro prime ore dopo l&#39;isolamento.

preparazione del cuore rat altamente accoppiato mitocondri

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

La funzione dei mitocondri nella generazione di cellulari di ATP nel processo di fosforilazione ossidativa è ampiamente riconosciuto. Negli ultimi decenni ci sono stati significativi progressi nella nostra comprensione delle funzioni delle altre mitocondri rispetto alla generazione di energia. Questi includono il loro ruolo nella apoptosi, in qualità di segnalazione organelli, lo sviluppo e l&#39;invecchiamento dei mammiferi e il loro contributo al coordinamento tra il metabolismo cellulare e la proliferazione cellulare. La nostra comprensione dei processi biologici modulata dai mitocondri si basa su metodi robusti per l&#39;isolamento e trattamento dei mitocondri intatti dai tessuti degli animali da laboratorio. Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare tra cui studi su animali knock-out. Qui si descrive un metodo dettagliato per il rapido isolamento di mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento. Tale preparazione del cuore di ratto mitocondri è un oggetto ottimo per la ricerca funzionali e strutturali sulla bioenergetica cellulare, trasporto di biomolecole, studi di proteomica e analisi del DNA mitocondriale, proteine ​​e lipidi.

Descriviamo а protocollo per l&#39;isolamento di puro cuore di ratto altamente accoppiato mitocondri per studi funzionali o strutturali di bioenergetica cellulare, misure biofisica, proteomica o il DNA mitocondriale e analisi di lipidi.

Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

La funzione dei mitocondri nella generazione di ATP cellulare attraverso il processo di fosforilazione ossidativa è ampiamente riconosciuta. Nel corso degli ultimi decenni...

Sono il dottor Ska. Oggi vi mostrerò come isolare le mitocondri dal cuore rosso. I passaggi chiave per l'isolamento dei mitocondri dai tessuti consistono innanzitutto nella rottura del tessuto e delle cellule mediante trattamento meccanico o enzimatico.In secondo luogo, centrifugazione differenziale a bassa velocità per rimuovere detriti, cellule rotte e nuclei. In terzo luogo, centrifugazione ad alta velocità per raccogliere i mitocondri. Gli strumenti e le soluzioni sono stati preparati e conservati in anticipo in ambiente refrigerato.È necessario mantenere diverse condizioni durante l'isolamento. Primo, una completa rottura del tessuto, poiché influisce direttamente sul rendimento di mitocondri. Secondo, mantenere bassa la temperatura in tutti i passaggi, ma fare attenzione a non congelare eccessivamente le soluzioni, specialmente durante la centrifugazione.In terzo luogo, maggiore è la velocità di esecuzione, migliore sarà la qualità dei mitocondri ottenuti. Gli animali sono stati soppressi in conformità con la normativa britannica sulle procedure scientifiche sugli animali e tutte le operazioni seguenti sono state eseguite in ambiente refrigerato. Preparare tre becher contenenti 40 mil di tampone di lavaggio.Raffreddare questo in un bagno di ghiaccio solido per tre a cinque minuti prima di passare al passaggio successivo. Assicurarsi di non congelare eccessivamente i campioni e utilizzarli immediatamente non appena iniziano ad apparire rapidamente nuvole di cristalli di ghiaccio; aprire rapidamente il torace del rosso decapitato ed estrarre il cuore. Effettuare piccole incisioni, quindi trasferire immediatamente il cuore nella soluzione fredda di ghiaccio.Nel primo becher, spremere il cuore per rimuovere il sangue e metterlo nel secondo becher. Ripetere questa operazione per ogni cuore. Il raffreddamento rapido e il lavaggio dei cuori asportati sono essenziali per ottenere una preparazione standard priva di emoglobina, eritrociti e adas.Asciugare i cuori sulla carta da filtro. Rimuovere tutto il grasso, il sangue coagulato e l'arteria. E prelevare il tessuto ventricolare.Quindi significa tirare il tessuto con forbici piccole e curve sulla piastra di Petri. Per cinque minuti, inserire il tessuto del MIT nel tessuto stesso. Premere e farlo passare attraverso. Dopo aver compresso il tessuto, trasferire il materiale nel becher contenente 50 ml di buffer di lavaggio e agitare.Quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro ad isola. Lavare il tessuto maschile sul filtro tre volte con il tampone di lavaggio e scartare il filtro. Trasferire il tessuto lavato in 20 ml di tampone di lavaggio e posizionarlo nel bagno di ghiaccio sul magnete esterno.Aggiungere le triplice soluzione sotto agitazione costante e avviare il cronometro al quarto minuto di incubazione. Omogeneizzare brevemente la sospensione porzione per porzione, un po' alla volta, utilizzando un omogeneizzatore in vetro e teflon di piccole dimensioni con accoppiamento lasco. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire la sospensione in un altro becher posto su un secondo agitatore.Ripetere la procedura al nono minuto, in modo da eseguire l'omogeneizzazione due volte in totale dopo la seconda omogeneizzazione. Al quindicesimo minuto di incubazione, aggiungere 10 ml di buffer di isolamento contenente inibitore della tripsina e incubare per un minuto aggiuntivo. Filtrare nuovamente la sospensione attraverso un filtro in nylon. In questo caso, però, conservare il filtrato, trasferire il resto del tessuto nell'omogeneizzatore e omogeneizzare.Per un ulteriore minuto, unire l'omogenato con il filtrato nel tubo da centrifuga. Assicurarsi che i tubi siano bilanciati in modo uniforme ed eseguire una centrifugazione a bassa velocità per 15 minuti. A 600 G, filtrare con attenzione il soprannatante ottenuto in un nuovo tubo da centrifuga.Cercare di evitare contaminazioni da pellet e centrifugare nuovamente per 15 minuti a 8.500 ×g. Dopo la centrifugazione ad alta velocità, eliminare il soprannatante e risciacquare il pellet con un buffer, cercando di rimuovere lo strato esterno bianco e soffice. Aggiungere un volume di buffer di isolamento. Inclinare il tubo da un lato all'altro e rimuovere il resto del buffer.Disaggregare il pellet con la pipetta cercando di evitare la macchia rossa di eritrociti sul fondo; risospendere il pellet con un piccolo omogeneizzatore o, in alternativa, mediante pipettaggio delicato, diluire la sospensione con ulteriore buffer di isolamento e centrifugare nuovamente per 15 minuti a 8.500 ×g. Eliminare il soprannatante S. Risospendere il pellet in buffer di risospensione e centrifugare nuovamente a 8.500 ×g. Il pellet marrone risultante contiene mitocondri integri lavati. Risospendere il pellet in un volume molto ridotto di buffer di risospensione.Più basso è il volume utilizzato, maggiore sarà la stabilità della preparazione delle mitocondrie. Di solito, sono sufficienti 200 microlitri di tampone per cuore. Il rendimento atteso delle mitocondrie preparate è di circa 10-15 milligrammi di proteina mitocondriale per cuore.E il rapporto di controllo respiratorio su substrati del complesso I di tale preparazione dovrebbe essere compreso tra otto e 12. Buona fortuna con la tua preparazione.

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