Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare il grado di movimento da cellula a cellula di una proteina marcata con fluorocromo nell'epidermide vegetale. Questo viene ottenuto ottenendo particelle d'oro rivestite di DNA per esprimere in modo transitorio la proteina di fusione di interesse nell'epidermide vegetale. Come secondo passaggio, il DNA viene introdotto nell'epidermide vegetale, consentendo l'espressione e il movimento della proteina di fusione testata.

Successivamente, la proteina di fusione espressa viene osservata al microscopio confocale al fine di monitorare l'espressione e la localizzazione delle proteine testate marcate con fluorescenza. Si ottengono risultati che mostrano il grado di trasporto da cellula a cellula della proteina marcata con fluorescenza, basato sull'analisi della distribuzione del segnale fluorescente mediante microscopia confocale. Ciao, sono Ben Myers del laboratorio di KY del Dipartimento di Biochimica e Biologia Cellulare della State University of New York a Stony Brook.

Oggi vi mostreremo un procedimento per analizzare il grado di movimento da cellula a cellula di una proteina marcata con un fluorocromo nell'epidermide vegetale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il trasporto da cellula a cellula delle proteine di movimento virali vegetali in diversi contesti vegetali e per confrontare la mobilità intercellulare di diversi tipi di proteine. Cominciamo dunque.

Per iniziare questo protocollo, coltivare una pianta di arabidopsis su Promix bx. In un vaso di dimensioni adeguate, utilizzare una camera controllata ambientalmente con un fotoperiodo corto e un'umidità relativa compresa tra il 40 e il 65% per le piante di nicotiana, hamana e tabacco nicotiana; coltivare ciascuna pianta su Promix BX in un vaso più grande. Ancora una volta, fornire una camera ambientale controllata con un fotoperiodo lungo e un'umidità relativa compresa tra il 40 e il 65%.

Concimare la pianta occasionalmente con prodotti disponibili in commercio, come descritto in precedenza. Dopo aver coltivato la pianta di Opsis per sei-otto settimane, selezionare le foglie per l'esperimento di dimensioni superiori a 15 millimetri per 35 millimetri, dove la misura della lunghezza include il picciolo per le piante di benanna e NAC coltivare le piante per sette-dieci settimane. Quindi selezionare foglie più grandi di 50 millimetri per 70 millimetri per end benanna e di 100 millimetri per 125 millimetri per nac.

In questi casi, le misurazioni della lunghezza non includono i peoli. Prima di iniziare il trasferimento mediato da BIC di microparticelle rivestite con DNA, preparare la cartuccia della pistola genica con microparticelle d'oro rivestite di DNA come descritto in dettaglio in precedenza. Quindi rimuovere le foglie dello stesso stadio di sviluppo utilizzando una lametta affilata e posizionarle immediatamente con il lato AAL rivolto verso l'alto su una superficie piana di polistirolo.

Il lato ABA della foglia rappresenta un substrato migliore per il bombardamento a causa della minore densità di tricomi e di una cuticola più sottile. Foglie piccole, come quelle di rapid opsis, possono essere immobilizzate coprendole con un pezzo di rete metallica per finestre e fissando la rete con puntine da disegno sulla superficie in polistirolo. Mantenere le foglie piatte per aumentare l'efficienza del rilascio delle particelle e ridurre al minimo i danni al tessuto durante il bombardamento microballistico.

Inserire quindi la cartuccia con microparticelle rivestite di DNA nella pistola. Per un'analisi su coniglio. Eseguire lo sparo a pressioni comprese tra 140 e 160 PSI per microparticelle di 0,6 micron.

Bombardare il campione utilizzando un cartuccia per foglia per distribuire le microparticelle su un'area superficiale di 10-12 millimetri di diametro. Per end benanna e end baum. Eseguire il bombardamento a pressioni comprese tra 160 e 180 PSI per microparticelle di 0,6 micron, con foglie più grandi di end benanna e di tabacco.

Sono possibili più bombardamenti della stessa foglia; tuttavia, devono essere eseguiti in posizioni simmetriche rispetto alla nervatura centrale, al fine di colpire aree fogliari allo stesso stadio di sviluppo. Il segnale fluorescente delle proteine marcate espressi in modo transitorio viene visualizzato mediante microscopia confocale. È necessario prestare attenzione nell’individuare le condizioni ottimali di microscopia per la rilevazione di ciascuna proteina testata.

Utilizzare un obiettivo 40x per osservare proteine che mostrano un accumulo intracellulare limitato con intensità di segnale deboli, come la localizzazione della proteina di movimento del virus del mosaico del tabacco, o T-M-V-M-P, sulla membrana plasmatica. Questo consente una risoluzione più elevata e una sensibilità migliorata. Tuttavia, un obiettivo 10x con funzione di ingrandimento confocale può essere utilizzato per un'acquisizione più rapida di proteine che mostrano una distribuzione citoplasmatica con intensità di segnale elevate, come la proteina fluorescente gialla libera o YFP. Un trasporto semplice è deducibile dall'apparizione di aggregati multi-cellulari contenenti il segnale fluorescente.

Il numero di tali aggregati e il numero di cellule in ciascun aggregato indicano il grado di trasporto da cellula a cellula. Per ottenere dati affidabili, registrare almeno 100 espressioni. Per ogni sistema sperimentale, assicurarsi di eseguire gli esperimenti contemporaneamente.

Quando verranno effettuati i confronti. In questo caso, è stato rilevato il trasporto semplificato di proteine marcate con fluorescenza. Vengono mostrate immagini tipiche ottenute mediante microscopia confocale dopo il bombardamento microballistico di una foglia di end hamana con un costrutto esprimente A TMV mp YFP.

Viene osservato un movimento semplicistico della MP del TMV-YFP in base alla comparsa di aggregati multi-cellulari del segnale YFP. Tuttavia, non tutta la MP del TMV-YFP espressa in modo transitorio è in grado di muoversi, come dimostrato dal segnale in singole cellule. In alcuni casi di microbombardamento.

Statisticamente, in meno del 40% dei cluster di segnale contati, la proteina TMV MP YFP non è in grado di spostarsi tra le cellule. Invece, in più del 60% dei cluster, la proteina si sposta da due a cinque cellule. La diffusione a due cellule è la più frequente; le proteine con dimensione molecolare relativamente piccola e senza attività intrinseca di movimento possono diffondere attraverso la SMA plasmatica per spostarsi da cellula a cellula.

Ad esempio, la YFP libera o un XYFP si diffonde tra diverse cellule e in più del 30% degli ammassi contati. Al contrario, questa diffusione non specifica non avviene per un dimero traduzionale di YFP o per due XYFP, che ha dimensioni paragonabili a quelle della proteina fusa TMV MP-YFP ed è completamente autonoma a livello cellulare. Vi abbiamo appena mostrato come analizzare il movimento da cellula a cellula di proteine marcate con fluorescenza mediante espressione transitoria indotta da un sistema a microridotti in epidermide vegetale.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare piante sane e vigorose, particelle d'oro rivestite con DNA di alta qualità per il trasferimento del DNA e di analizzare un numero sufficiente di cluster di espressione per ottenere risultati statisticamente affidabili. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.