Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali retiniche dall'epitelio ciliare dell'occhio. Ciò si ottiene pulendo e tagliando l'occhio a metà, partendo dal nervo ottico, tagliando la cornea e incontrandosi di nuovo al nervo ottico, quindi rimuovendo la retina neurale e il cristallino. Il secondo passo della procedura consiste nel tagliare l'epitelio ciliare tagliando la cornea, l'iride e l'epitelio pigmentato retinico.

La terza fase della procedura consiste nel trattare enzimaticamente l'epitelio ciliare, rimuovere la sclera e dissociare meccanicamente l'epitelio in singole cellule. La fase finale della procedura consiste nel risospendere le cellule in terreni privi di siero e piastarle in piastre di coltura tissutale contenenti terreni privi di siero con fattori di crescita. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano in modo prospettico il numero di cellule staminali presenti nell'epitelio ciliare dell'occhio attraverso la sfera clonale, formazione in vitro.

Ciao, mi chiamo Brenda Coles. Il nostro laboratorio ha ideato per la prima volta questo metodo quando stavamo facendo ricerche sulle capacità rigenerative degli anfibi e dei pesci nei loro occhi, e abbiamo ipotizzato che forse ci fosse una cellula nell'occhio dei mammiferi con le stesse capacità. L'isolamento delle cellule staminali retiniche viene eseguito in una specifica camera sterile dedicata agli esperimenti di coltura primaria.

Prima di iniziare questa procedura, impostare il microscopio da dissezione e la fonte di luce fredda, quindi disporre gli strumenti di dissezione sterili. Ogni cappa è dotata di uno sterilizzatore a battito caldo per la sterilizzazione degli strumenti tra un passaggio e l'altro. Isoleremo le cellule staminali retiniche dagli occhi che sono state poste immediatamente in una capsula di Petri sterile contenente liquido cerebrospinale artificiale Dopo la rimozione dai topi sacrificati secondo i protocolli di etica animale approvati, l'aspetto più difficile di questa procedura è sezionare un oggetto rotondo al microscopio.

È necessario prestare molta attenzione per non distruggere il tessuto di interesse Sotto il microscopio da dissezione, pulire l'occhio con una pinza. Sbarazzati dei peli e del tessuto collegato che è attaccato al bordo sclerale della cornea. Quindi trasferire l'occhio in un nuovo piatto con A CSF tenendo fermo l'occhio con una pinza seghettata.

Utilizzare forbici da micro dissezione angolate per rimuovere i muscoli oculari. Rimuovi anche il nervo ottico se è ancora attaccato all'occhio, cerca di non schiacciare l'occhio durante questo processo. Trasferisci gli occhi in un nuovo piatto con un liquido cerebrospinale.

Successivamente ho usato le forbici da micro dissezione curve per tagliare l'occhio a metà. Inizia dal nervo ottico e taglia il centro della cornea incontrando di nuovo il nervo ottico dove è stato avviato il taglio. È l'ideale se i due pezzi dell'occhio sono di dimensioni più o meno equivalenti perché questo renderà più facile il passaggio successivo.

Tenendo le cornee con due pinze, staccare delicatamente le due metà dell'occhio. Rimuovere ed eliminare i visceri delle lenti e la retina neurale dai gusci oculari. Trasferire i gusci in un nuovo piatto con A CSF.

Ora siamo pronti per isolare l'epitelio ciliare. Per iniziare, orienta il guscio dell'occhio in modo che la cornea sia alla tua destra e l'epitelio pigmentato retinico sia alla tua sinistra. Fissare delicatamente il guscio oculare con una pinza dritta sul lato RPE.

Quindi, usa il bisturi per tagliare la cornea e l'iride dall'epitelio ciliare dell'occhio spingendo delicatamente verso il basso il bisturi piuttosto che usare movimenti di segatura. Successivamente, tagliare l'epitelio ciliare dall'RPE. Utilizzare una pinza non seghettata per trasferire la striscia di epitelio ciliare in un nuovo piatto da 35 millimetri contenente A CSF.

Allo stesso modo, isolare l'epitelio ciliare dall'altro guscio oculare. Una volta raccolte le strisce di epitelio ciliare, trasferirle in una capsula da 35 millimetri contenente due millilitri di spazio. Mettere il piatto con le strisce in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, trasferire le strisce dalla fessura in una pirofila contenente due millilitri di gocce filtrate in Halle Ur haase e acido reico gentile. Posizionare il piatto a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ora torna al microscopio da dissezione tenendo premuta la sclera con una pinza dritta.

Utilizzare la pinza non classificata della parte inferiore della curva per raschiare delicatamente l'epitelio ciliare lontano dalla sclera. Togliete la sclera dal piatto. Tutto ciò dovrebbe essere lasciato nel piatto.

Ora sono le cellule di interesse e la soluzione enzimatica. Utilizzando una pipetta di cotone lucidato a fuoco, trasferire la soluzione in una provetta da 14 litri. Tritrare questa soluzione 30 volte per rompere le cellule epiteliali forzando delicatamente la soluzione dentro e fuori dalla pipetta, centrifugare la provetta per cinque minuti a 1500 giri/min.

Al termine della centrifugazione, rimuovere con cura la provetta dalla centrifuga. Poiché le cellule tendono a staccarsi dal fondo della provetta. A questo punto, aspirare delicatamente la maggior parte del SuperNet utilizzando una pipetta lucidata a fuoco e quindi aggiungere alle cellule un millilitro di inibitore della tripsina in terreni privi di siero.

Utilizzare una piccola pipetta di cotone con tappo per estrarre il campione circa 50 volte fino a quando non è una sospensione a cellula singola. Centrifugare nuovamente la provetta per cinque minuti. A 1500 giri/min, rimuovere il surnatante e sostituirlo con un millilitro della placcatura.

Refrigerare delicatamente con una pipetta di vetro lucidato a fuoco per risospendere le cellule. Dopo aver contato le cellule, piastrelarle alla densità desiderata. In una piastra a 24 pozzetti, di solito impiattiamo 10 celle per microlitro riempiendo prima ogni pozzetto con il terreno e poi aggiungendo la sospensione cellulare per ottenere un volume finale di 500 microlitri di terreno.

Posizionare la piastra in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius dove non verrà spostata fino a quando non si contano le sfere che si formano dopo sette giorni quando questa procedura viene eseguita con successo. Le cellule epiteliali ciliari sezionate dovrebbero apparire in questo modo dopo essere state dissociate e piastrate a bassa densità. Dopo sette giorni di coltura, vengono contate le sfere di cellule staminali retiniche che si presentano.

Una sfera dovrebbe avere un diametro superiore a 75 micron e fluttuare liberamente per essere contata come una sfera derivata da cellule staminali. Tuttavia, alcune cellule avranno una proliferazione limitata e formeranno PHE che non soddisfano i criteri di dimensione e non saranno conteggiate come sfere derivate da cellule staminali. Un esempio di tale asteroide è mostrato qui Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze della vista per esplorare la possibilità di utilizzare le cellule staminali retiniche nel trattamento delle malattie retiniche.