Name: Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Impara l'isolamento di cellule staminali retiniche dall'epitelio ciliare dell'occhio di topo. Questo metodo permette di coltivare sfere retiniche clonali per studiare l'autorinnovamento e la multipotenzialità.

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Ringraziamo Laura Clarke per la sua preziosa assistenza. Questo lavoro è supportato da NCE: Rete delle cellule staminali, CIHR e NIH.

1. Preparare le soluzioni Dissecting e soluzioni enzimatiche <ol><li> Rendere il Artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) e il siero senza supporti in anticipo e conservare in frigorifero. </li><li> Pesare l'acido Kynurenic (0,2 mg / ml) e scioglierlo in 10 ml di Hilo ACSF a 37 ° C a bagno-maria in anticipo dal momento che non si dissolvono rapidamente. </li><li> Pesare la tripsina (1,33 mg / mL) e ialuronidasi (0,67 mg / mL) e posto in un tubo di 15 ml e la tiene a -20 ° C fino al momento dell'uso. Aggiungere la soluzione di acido Kynurenic a questo tubo e filtro con un filtro di 22 micron siringa immediatamente prima dell'uso. </li><li> Pesare inibitore della tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e si dissolvono in caldo senza siero Media e filtrare con filtro 22μm siringa. </li><li> Fare dei mass media placcatura: Siero senza supporti contenenti FGF2 (10 ng / ml) ed eparina (2 mg / mL). </li></ol> 2. Isolare cellule staminali della retina dalla Eye mouse <ol><li> Isolamento delle cellule staminali della retina viene eseguita in un locale specifico sterile dedicata agli esperimenti coltura principale. Prima di iniziare questa procedura, impostare il microscopio da dissezione e la luce fredda di origine e quindi tracciare gli strumenti sterili dissezione. Ogni cappa è uno sterilizzatore a caldo tallone per la sterilizzazione degli strumenti tra i passaggi. </li><li> Noi isolare le cellule staminali della retina da occhi che sono stati posti immediatamente in una piastra di Petri sterile contenente artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) dopo la loro rimozione dai topi sacrificati in base a protocolli animali approvati etica. </li><li> Sotto il microscopio da dissezione, pulire l'occhio con le pinze: liberarsi dei capelli e il tessuto connettivo che è attaccato alla cornea / confine sclerale. Poi il trasferimento l'occhio ad un nuovo piatto con ACSF. </li><li> Mentre dolcemente tenendo gli occhi fissi con una pinza dentata, utilizzare angolato micro-dissezione forbici per rimuovere i muscoli oculari. Togliere il nervo ottico anche se è ancora attaccato l'occhio. Cercate di non schiacciare l'occhio durante questo processo. Trasferire gli occhi ad un nuovo piatto con ACSF. </li><li> Uso successivo curve micro-dissezione forbici per tagliare l'occhio a metà: cominciare dal nervo ottico e tagliare il centro della cornea, riuniti di nuovo al nervo ottico, dove è stato avviato il taglio. È l'ideale se i due pezzi di occhi sono più o meno equivalente di dimensioni perché questo farà il prossimo passo più facile. </li><li> Tenendo le cornee con due pinze, buccia delicatamente l'occhio due metà a parte. Rimuovere ed eliminare l'obiettivo, viscere, e la retina neurale dai gusci degli occhi. Trasferire i gusci di un nuovo piatto con ACSF. </li><li> Ora siamo pronti a isolare l'epitelio ciliare. Per iniziare, orientare la conchiglia oculare in modo che la cornea è sulla destra e l'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova sulla sinistra. Delicatamente il guscio pin occhio verso il basso con pinze dritto sul lato RPE. </li><li> Quindi, usare un bisturi per tagliare la cornea e iride lontano dal epitelio ciliare dell'occhio spingendo delicatamente verso il basso il bisturi e non con movimenti di taglio. </li><li> Dopo di che, tagliare l'epitelio ciliare lontano dal RPE. Usa non seghettato pinze per trasferire la striscia di epitelio ciliare ad un nuovo 35-mm piatto contenente ACSF. </li><li> Allo stesso modo, isolare l'epitelio ciliare dal guscio altro occhio. </li><li> Una volta che entrambe le strisce ciglia epiteliali sono stati raccolti, trasferire le strisce in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di dispasi. Posizionare il piatto con le strisce in un incubatore a 37 ° C per 10 minuti. </li><li> Dopo 10 minuti, trasferire le strisce dal dispasi in un piatto contenente 2 ml di tripsina filtrata, ialuronidasi, e Acido Kynurenic. Porre la capsula a 37 ° C per 10 minuti. </li><li> Ora ritorno al microscopio da dissezione. Mentre si tiene la sclera giù con pinza dritta, utilizzare il fondo della curva non seghettato pinze per raschiare delicatamente l'epitelio ciliare lontano dalla sclera. </li><li> Rimuovere la sclera dal piatto. Tutto ciò che dovrebbe essere lasciato nel piatto ora sono le cellule di interesse e la soluzione enzimatica. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato cotone collegato pipetta, trasferire questa soluzione in un tubo di 14 ml. Triturare questa soluzione 30 volte di spezzare le cellule epiteliali delicatamente forzando la soluzione dentro e fuori della pipetta. </li><li> Centrifugare la provetta per 5 minuti a 1500 giri. Quando la centrifugazione è fatto, togliere il tubo dalla centrifuga con attenzione in quanto le cellule sono inclini a staccarsi dal fondo della provetta in questa fase. </li><li> Aspirare delicatamente la maggior parte delle surnatante utilizzando un incendio lucidato pipetta, e si aggiunge 1 ml di inibitore della tripsina nel siero senza supporti alle cellule. Utilizzare un piccolo pozzo di cotone collegato pipetta per triturare il campione di circa 50 volte fino a quando si tratta di una cella singola sospensione. </li><li> Centrifugare la provetta per 5 minuti a 1500 RPM. </li><li> Rimuovere il surnatante e sostituirlo con 1 ml di vostro mezzo di placcatura. Triturare delicatamente con un incendio lucidato pipetta di vetro per risospendere le cellule. </li><li> Dopo che il conteggioING l', le cellule piastra loro alla densità desiderata in un 24-pozzetti. Noi di solito tavola 10 cellule / mL, compilando tutti i pozzetti prima media e quindi aggiungendo la sospensione cellulare per ottenere un volume finale di 500 l di media. </li><li> Posizionare la piastra a 37 ° C CO 2 incubatore dove non verrà spostato fino a contare le sfere che si presentano dopo 7 giorni. </li></ol> 3. Risultati di isolamento di cellule staminali della retina <ol><li> Quando questa procedura viene eseguita con successo, il sezionato cellule epiteliali ciliare dovrebbe essere simile a questo dopo essere stato dissociato e placcato a bassa densità (Figura 1). </li><li> Dopo 7 giorni di cultura, la retina sfere di cellule staminali che si presentano sono contati. Una sfera dovrebbe essere superiore a 75 micron di diametro e fluttuante per essere contato come una cellula staminale sfera derivati. (Figura 2). Tuttavia, alcune cellule avranno limitato sferoidi proliferazione e la forma che non soddisfano i criteri dimensioni e non verranno conteggiati come sfere di cellule staminali derivate; un esempio di uno sferoide è mostrato qui (Figura 2). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo descrive come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare del mouse occhio 1-3. La metodologia per isolare le strisce di epitelio ciliare può variare, tuttavia gli enzimi e la metodologia per il raggiungimento di una singola cella di sospensione sono stati ottimizzati in questo protocollo. E &#39;anche importante che le strisce di epitelio ciliare che sono stati isolati non contengono grandi quantità di RPE o di cornea da quando questi sembrano avere un impatto negativo sul numero totale delle sfere che possono essere isolate da ogni occhio. Inoltre, il siero senza mezzi di comunicazione che facciamo che è stato originariamente formulato per il cervello neurosfere 13, è l&#39;ideale per la coltivazione di cellule staminali della retina sfere. Si dovrebbe anche fare in modo che le cellule non sono disturbati dopo che sono stati placcati e posti nell&#39;incubatrice in modo che le sfere in crescita non aggregato insieme 14. Una volta che le cellule staminali della retina hanno formato sfere clonale, possono essere calcolate per ottenere un numero potenziale di cellule staminali per occhio. Le sfere allora può quindi essere dissociato in cellule singole e diversi passaggi per accertare le capacità di auto-rinnovamento o differenziate in diversi tipi di cellule della retina neurale e RPE utilizzando diverse combinazioni di fattori di crescita e / o proteine.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa a luce fredda</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>luce ottica a doppio braccio</td></tr><tr><td>Forbici Vannas mini curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Vannas angolate</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #7 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>non seghettate</td></tr><tr><td>Pinzette #5 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>dritte</td></tr><tr><td>Pinzette fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>curve seghettate</td></tr><tr><td>Manico per bisturi #3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi #10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perle calde</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Acido chinurenic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipette con tappo di cotone</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>arrotondate a fiamma</td></tr><tr><td>Tubi da 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polistirene</td></tr><tr><td>Mezzo senza siero</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 per la formulazione</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule staminali della retina dalla eye mouse

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Il topo adulto cellule staminali della retina (RSC) è una rara cellula quiescente trovati all&#39;interno dell&#39;epitelio ciliare (CE) dell&#39;occhio dei mammiferi 1,2,3. La marcatura CE è costituito da strati interni e pigmentate non pigmentate cellula esterna, e le colonie clonale RSC che nascono da una singola cellula pigmentata dalla CE sono costituiti da due cellule pigmentate e non pigmentate, che possono essere differenziati per formare tutte le tipi di cellule della retina neurale e la RPE. Vi è una certa polemica sul fatto che tutte le cellule all&#39;interno delle sfere contengono tutti almeno alcuni pigmenti 4; ma le cellule sono ancora in grado di formare i diversi tipi di cellule trovati all&#39;interno della retina neurale 1-3. In alcune specie, come gli anfibi e pesci, i loro occhi sono in grado di rigenerazione dopo una lesione 5, tuttavia, l&#39;occhio dei mammiferi non mostra tali proprietà rigenerative. Cerchiamo di identificare le cellule staminali in vivo e per capire i meccanismi che mantengono le cellule staminali della retina dei mammiferi quiescente 6-8, anche dopo l&#39;infortunio così come servirsi di esse come una potenziale fonte di cellule per riparare i modelli fisici o genetici di lesioni agli occhi attraverso il trapianto di 9-12. Qui si descrive come isolare le cellule ciliari epiteliali dall&#39;occhio del mouse e farle crescere in coltura in modo da formare la retina sfere clonale di cellule staminali. Poiché non ci sono marcatori conosciuti delle cellule staminali in vivo, queste sfere sono l&#39;unico modo conosciuto per identificare in modo prospettico la popolazione di cellule staminali all&#39;interno del epitelio ciliare dell&#39;occhio.

In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell&#39;occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l&#39;auto-rinnovamento e multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

La cellula staminale retinica (RSC) dell'adulto del topo è una rara cellula quiescente che si trova all'interno dell'epitelio ciliare (CE) dell'occhio dei mammiferi1,2,3. Il CE è composto da...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali retiniche dall'epitelio ciliare dell'occhio. Questo viene ottenuto innanzitutto pulendo e tagliando l'occhio a metà, partendo dal nervo ottico, tagliando attraverso la cornea e ricongiungendosi nuovamente al nervo ottico, quindi rimuovendo la retina neurale e il cristallino. Il secondo passaggio della procedura consiste nel prelevare l'epitelio ciliare tagliando via la cornea, l'iride e l'epitelio pigmentato della retina.Il terzo passaggio della procedura consiste nel trattare enzimaticamente l'epitelio ciliare, rimuovere la sclera e dissociare meccanicamente l'epitelio in singole cellule. L'ultimo passaggio della procedura prevede la risospensione delle cellule in un mezzo privo di siero e il loro semina in piastre per colture cellulari contenenti mezzo privo di siero con fattori di crescita. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano in modo prospettico il numero di cellule staminali presenti nell'epitelio ciliare dell'occhio mediante la formazione di sfere clonali in vitro.Ciao, mi chiamo Brenda Coles. Il nostro laboratorio ha sviluppato per la prima volta questo metodo mentre stavamo esaminando articoli sulla capacità rigenerativa degli anfibi e dei pesci a livello oculare, formulando l'ipotesi che forse esistesse una cellula nell'occhio dei mammiferi con le stesse capacità. L'isolamento delle cellule staminali retiniche viene eseguito in una stanza sterile specifica, dedicata agli esperimenti di coltura primaria.Prima di iniziare questa procedura, impostare il microscopio stereoscopico e la sorgente di luce fredda, quindi disporre gli strumenti di dissezione sterili. Ogni cappa è dotata di un sterilizzatore a fiamma per la sterilizzazione degli strumenti tra un passaggio e l'altro. Isoleremo cellule staminali retiniche da occhi che saranno immediatamente posti in una piastra di Petri sterile contenente liquido cerebrospinale artificiale dopo il prelievo da topi sacrificati secondo protocolli etici per la sperimentazione animale approvati. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nel dissezionare un oggetto rotondo sotto il microscopio.È necessario prestare la massima attenzione per non distruggere il tessuto di interesse. Sotto il microscopio stereoscopico, pulire l'occhio con pinzette. Rimuovere i peli e i tessuti connessi attaccati al margine corneosclerale. Successivamente, trasferire l'occhio in una nuova piastra contenente A CSF, tenendo fermo l'occhio con pinzette dentellate.Utilizzare forbici microchirurgiche angolate per rimuovere i muscoli oculari. Rimuovere anche il nervo ottico se è ancora attaccato all'occhio, cercando di non schiacciare l'occhio durante questa operazione. Trasferire gli occhi in una nuova piastra contenente un liquido CSF.Successivamente, utilizzare forbici curvilinee per dissezione microscopica per tagliare l'occhio a metà. Iniziare dal nervo ottico e tagliare attraverso il centro della cornea, terminando nuovamente al nervo ottico dove il taglio è stato iniziato. È ideale che le due parti dell'occhio siano approssimativamente equivalenti per dimensione, poiché ciò renderà più semplice il passaggio successivo.Tenendo le cornee con due pinzette, staccare delicatamente le due metà dell'occhio. Rimuovere e scartare il cristallino, le viscere e la retina neurale dalle capsule oculari. Trasferire le capsule in una nuova piastra con A CSF.Ora siamo pronti per isolare l'epitelio ciliare. Per iniziare, orientare il guscio oculare in modo che la cornea si trovi sulla destra e l'epitelio pigmentato della retina sia sulla sinistra. Fissare delicatamente il guscio oculare con pinze dritte dal lato dell'epitelio pigmentato della retina.Successivamente, utilizzare il bisturi per staccare la cornea e l'iride dall'epitelio ciliare dell'occhio esercitando una leggera pressione verso il basso sul bisturi, invece di compiere movimenti di segagione. Dopodiché, tagliare l'epitelio ciliare dal RPE. Utilizzare pinze non seghettate per trasferire la striscia di epitelio ciliare in una nuova piastra da 35 millimetri contenente A CSF.Nello stesso modo, isolare l'epitelio ciliare dall'involucro dell'altro occhio. Una volta raccolti i frammenti di epitelio ciliare, trasferirli in una piastra da 35 millimetri contenente due millilitri di dis space. Collocare la piastra con i frammenti in un incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo 10 minuti, trasferire le strisce dal dis spazio in una piastra contenente due millilitri di gocce filtrate in Halle ur haase e kind reic acid. Collocare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Tornare ora al microscopio stereoscopico tenendo la sclera ferma con pinze dritte.Utilizzare la parte inferiore della pinzetta curva non graduata per staccare delicatamente l'epitelio ciliare dalla sclera. Rimuovere la sclera dalla piastra. Tutto ciò che deve rimanere nella piastra.Ora si hanno le cellule di interesse e la soluzione enzimatica. Utilizzando una pipetta con punta di cotone sterilizzata, trasferire la soluzione in un tubo da 14 litri. Triturare questa soluzione 30 volte per separare le cellule epiteliali, spingendo delicatamente la soluzione all'interno e all'esterno della pipetta; quindi centrifugare il tubo per cinque minuti a 1500 giri al minuto.Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione il tubo dalla centrifuga. Poiché le cellule potrebbero staccarsi facilmente dal fondo del tubo, in questa fase aspirare delicatamente la maggior parte del SuperNet utilizzando una pipetta a fuoco levigato, quindi aggiungere un millilitro di inibitore della tripsina in un mezzo privo di siero alle cellule.Utilizzare una pipetta con punta di cotone e foro sottile per aspirare e dispensare il campione circa 50 volte, fino a ottenere una sospensione di singole cellule. Centrifugare nuovamente il tubo per cinque minuti. A 1500 giri/min, rimuovere il soprannatante e sostituirlo con un millilitro del mezzo di semina.Riprendere delicatamente le cellule utilizzando una pipetta di vetro levigata a fuoco per risospendere le cellule. Dopo aver contato le cellule, seminarle alla densità desiderata. In una piastra a 24 pozzetti, di solito si seminano 10 cellule per microlitro, riempiendo ogni pozzetto prima con il mezzo, quindi aggiungendo la sospensione cellulare per ottenere un volume finale di 500 microlitri di mezzo.Posizionare la piastra in un incubatore a biossido di carbonio a 37 gradi Celsius, dove non verrà spostata fino al conteggio delle sfere che si formano dopo sette giorni, quando la procedura viene eseguita con successo. Le cellule epiteliali ciliari dissociate dovrebbero apparire così dopo essere state dissociate e seminate a bassa densità. Dopo sette giorni di coltura, vengono contate le sfere di cellule staminali retiniche che si sono formate.Una sfera deve avere un diametro superiore a 75 micron ed essere libera di galleggiare per essere conteggiata come sfera derivata da cellule staminali. Tuttavia, alcune cellule presenteranno una proliferazione limitata e formeranno PHE che non soddisfano il criterio di dimensione e non verranno conteggiate come sfere derivate da cellule staminali. Un esempio di tale asteroide è mostrato qui dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze della visione per esplorare la possibilità di utilizzare cellule staminali retiniche nel trattamento delle malattie retiniche.

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Biologia

Questo video mostra la procedura per isolare le cellule gangliari retiniche primarie murine (RGC) utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio futuro delle RGC, con l'obiettivo di comprendere meglio il principale declino dell'acuità visiva che deriva dalla perdita di RGC funzionali nelle malattie neurodegenerative.

Isolamento delle cellule gangliari retiniche murine mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza

Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l'isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un multi-funzionale dell'epitelio dell'occhio. Qui presentiamo un protocollo standard per stabilire colture cellulari primarie derivate da RPE murino.

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cellule endoteliali retiniche postnatali murine ottimizzate per la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Queste cellule sono adatte per approcci di sequenziamento di prossima generazione.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Le colture primarie di glia di Müller ottenute da retine di topo rappresentano uno strumento molto robusto e affidabile per studiare la conversione gliale in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con microRNA. Singole molecole o combinazioni possono essere testate prima della loro successiva applicazione di approcci in vivo .

Colture cellulari primarie per studiare il potenziale di rigenerazione di Murine Müller Glia dopo il trattamento con microRNA

Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.

Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Impara l'isolamento di cellule staminali retiniche dall'epitelio ciliare dell'occhio di topo. Questo metodo permette di coltivare sfere retiniche clonali per studiare l'autorinnovamento e la multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

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