Name: Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri i saggi in vitro per studiare le interazioni tra cellule di Schwann e astrociti. Questi metodi aiutano a comprendere i meccanismi di rigenerazione del midollo spinale e migliorare le strategie terapeutiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Philippa Warren per il suo gentile aiuto.

1. Contorno di analisi: <ol><li> Preparazione di base: le diapositive Camera sono rivestiti con poli-D-lisina vetrini durante la notte e sterile vengono preparati prima di iniziare l'esperimento. Terreno è preparato utilizzando Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM), integrato con il 10% di siero fetale bovino (FCS), e 1% di penicillina-streptomicina-Fungizon (FPF). Anche una bottiglia di calcio / magnesio soluzione salina bilanciata libero Hanks (HBSS) è preparato. </li><li> Primarie di cellule di Schwann ratto coltivate in matraccio trypsinized per 3 minuti con 0,1% tripsina. Primaria cultura astrociti di ratto è trypsinized per 5 minuti con 0,1% tripsina. Tripsina è inactived aggiungendo DMEM supplementato con 10% FCS e 1% FPF. </li><li> Trypsinized cellule di Schwann e gli astrociti vengono trasferiti a separare i tubi falcon da 15 ml e centrifugato a 300G per 5 minuti. </li><li> Cellule di Schwann e gli astrociti sono risospese alla densità di 2 x 10 6 (vedere la sezione dei risultati rappresentativi delle variazioni di densità delle cellule). </li><li> 50 goccia l di sospensione delle cellule di Schwann è posta ad una estremità di pozzi camera PDL rivestiti di diapositive. Una striscia di vetro è stato utilizzato per spalmare la caduta verso il centro della camera per generare un bordo dritto. (Utilizzando un tagliatore di vetro, un coprioggetto di vetro rettangolare vengono tagliate longitudinalmente in modo che fosse in base alla larghezza della camera di diapositive utilizzate per le analisi di confine) </li><li> Una seconda goccia di 50 ml di sospensione astrociti è stato posto dalla parte opposta del pozzo stesso e spalmato verso il centro per creare un bordo dritto parallelo alla prima goccia striscio con un piccolo spacco 0,2 millimetri tra di loro. </li><li> La camera di diapositive contenenti le gocce sono posti in incubatore a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo 2 ore, le culture sono stati lavati con DMEM per rimuovere non iscritti detriti cellulari e mezzo fresco contenente DMEM / 10% FCS / 1% PSF aggiunto. Nota: DMEM / 10% FCS / 1% PSF può essere completato con forskolina (2μM) ed estratto di ipofisi bovina (BPE) (10μg / mL) a stimolare la proliferazione delle cellule di Schwann. BPE fornirà i fattori di crescita necessari per consentire a lungo termine cultura delle cellule di Schwann e forskolina aumenta i livelli di adenosina monofosfato ciclico all'interno delle cellule di Schwann di indurre la proliferazione </li><li> Le cellule sono coltivate per circa 8-10 giorni a 37 ° C, 7% di CO 2 incubatore. Il mezzo deve essere cambiata ogni 3 giorni. I due fronti cellula alla fine raggiungere l'altro e un confine netto si forma tra i due tipi di cellule. In questa fase gli esperimenti possono essere effettuate analisi di fattori coinvolti nella formazione di confine. </li><li> Co-coltura può essere fissato con 4% di formaldeide e le cellule di Schwann può essere immunoistochimica con anticorpi anti-P75 e astrociti con anticorpi anti-GFAP per identificare le cellule in co-coltura. P75 anticorpo riconosce a bassa affinità dei recettori NGF su cellule di Schwann che gli astrociti mancanza. Anti-GFAP anticorpo riconosce proteina acida gliale firbrillary che localizza al citoplasma astrociti. (Si veda la Figura 1A per contorno rappresentante) </li></ol> 2. Migrazione di analisi: <ol><li> 4 piastre bene (15mm pozzi) sono coperti per una notte PDL e preparato per la creazione di monostrati astrociti. </li><li> Primaria cultura astrociti è trypsinized per 5 minuti con 0,1% tripsina. Tripsina viene inattivato con l'aggiunta di DMEM supplementato con 10% FCS e 1% PSF e cellulari centrifugati a 300G per 5 minuti. (Vedi figura 2) </li><li> Astrociti vengono nuovamente sospesi a 1x10 5 cellule / ml. 1 ml di questa soluzione è aggiunto ad ogni rivestito PDL bene in 4 piatti bene. Astrociti sono in coltura per 24-48 ore fino a quando il monostrato è completamente confluenti. </li><li> Per valutare la migrazione delle cellule di Schwann su monostrati astrociti, parallelamente alla creazione di monostrati astrociti, circolare PDL rivestite coprioggetto di vetro sono posti in una provetta da 50 ml e schiacciato con una pipetta di plastica per creare piccoli frammenti di vetro. </li><li> Frammenti di vetro vengono trasferiti in un pozzo in 6 piatto piatto bene e usando pinze adatte frammenti imprese sono scelti e collocati in altri pozzi. 5 frammenti di vetro vengono inseriti in ciascun pozzetto in 6 piastre. </li><li> Primarie di cellule di Schwann coltivate in matraccio trypsinized per 3 minuti con 0,1% tripsina. Trypsinized cellule di Schwann sono trasferiti a separare tubo falcon da 15 ml e centrifugato a 300 g per 5 minuti. Cellule di Schwann sono risospese a 2x 10 6 cellule / ml in DMEM/10% FCS / 1% FPF. </li><li> 20 gocce l di sospensione delle cellule di Schwann si aggiunge oltre ogni 5 frammenti coprioggetto posti in 6 piastre e le cellule vengono incubate a 37 ° C CO, 7% 2 per 2 ore. </li><li> Dopo 2 ore, le cellule di Schwann sono collegati ai frammenti coprioggetto e DMEM/10% FCS / 1% PSF (Integrato con 2μM di forskolina e 10μg / mL di BPE è aggiunto a ciascun bene in modo che i frammenti sono completamente coperti di media) . </li><li> I 6 piastre contenenti i frammenti vengono poi messi in incubatrice per 24-48 ore fino a quando i frammenti di vetro sono completamente confluente con cellule di Schwann. </li><li> Una volta che i frammenti sono confluenti con le cellule di Schwann, ogni frammento viene raccolto con cura utilizzando pinze taglienti e immersa in HBSS per rimuovere le cellule distaccati e poi faccia rovesciata verso il basso a monostrato astrociti. </li><li> Ogni bene è poi coperto con 1 ml di DMEM/10% sono consentiti FCS / 1% di cellule di Schwann PSF e di migrare dalle 24 alle 48 periodo. Durante questo periodo reagenti sperimentali come fattori di crescita possono essere aggiunti per valutare il loro effetto sul numero e la distanza di migrazione delle cellule di Schwann. </li><li> Dopo il periodo di migrazione, i frammenti di vetro sono fissati al fondo di ciascun pozzetto con l'aggiunta del 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti. A seguito di fissazione, immunostain le cellule di Schwann di p75 (riconoscimento del recettore a bassa affinità NGF) poi li macchia con ABC strepavidin kit-diaminobenzidina (DAB), per consentire la visualizzazione delle cellule di Schwann sotto microscopio ottico. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: A seguito di 8-10 giorni di Schwann-co-culture astrociti mostrano un confine netto tra i due tipi di cellule. Questo confine è più marcato se forskolina e BPE è usato nella cultura, come la proliferazione delle cellule di Schwann è migliorata. Se nessun confine è osservata durante il periodo di 10 giorni, il tempo della cultura può essere aumentata ulteriormente fino a quando i confini sono stabiliti. Modifica del rapporto di densità delle cellule è un modo alternativo per aumentare la formazione di confine. Un rapporto di 3:1 di Schwann: la densità delle cellule astrociti possono essere utilizzati per la preparazione sospensioni cellulari 8,18. A seguito di immunostaining per identificare le cellule di Schwann e gli astrociti, cellule mescolanza di valutare una linea possono essere tratte dove il confine è stabilito ed il numero di cellule di Schwann migrazione nel territorio astrociti possono essere contate al microscopio a fluorescenza. Di seguito sono riportati due esempi di immagini ottenute confini, uno con ben formato segregazione delle cellule di Schwann e gli astrociti (Figura 1A) e uno in cui le cellule non hanno segregato e in diversi territori a causa della scarsa tecnica (Figura 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 test Boundary: Schwann-astrociti interazione. A) Un giorno 10 co-coltura saggio in presenza di forskolin e BPE per stimolare la proliferazione delle cellule di Schwann dimostra un confine netto tra i due tipi di cellule (rosso = P75, verde = GFAP). B) Un giorno 10 co-coltura saggio in cui il confine non è formato e le due fronti cella mista. Ciò era dovuto alla miscelazione dei due gocce pur ponendo gocce astrociti e cellule di Schwann uno accanto all'altro durante la preparazione del confine (rosso = P75, verde = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un'immagine rappresentativa della confluenti monostrato astrociti Saggi di migrazione valutare il movimento di un tipo di cellule sulla superficie di un altro tipo di cellula e quindi valutare un fenomeno diverso da quello della formazione di confine. La pratica è necessaria per garantire invertendo i coprioggetti su monostrati non porta a danni alla cellule di Schwann-coperto frammenti di vetro e monostrati astrociti dal pinze taglienti. Per valutare la migrazione delle cellule di Schwann, la distanza massima della migrazione e del numero di cellule migrano dal bordo del vetrino può essere misurato con microscopio ottico. Di seguito l'immagine di cellule di Schwann colorate con anticorpi P75 con colorazione DAB sulla superficie del monostrato astrociti (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Test di migrazione utilizzando test invertita coprioggetto. A) cellule di Schwann (marrone, immunoistochimica con anticorpi p75) migrare lontano dal bordo del vetrino. La freccia indica la direzione della migrazione delle cellule dal vetrino.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I saggi di cui sopra sono stati utilizzati in diversi studi che dimostrano il ruolo dei molteplici fattori coinvolti nella formazione di confine tra il Schwann-astrociti e limitato la migrazione delle cellule di Schwann in ambiente astrocitaria. Comprendere la meccanismi alla base di queste manifestazioni è essenziale in quanto consentirebbe lo sviluppo di strategie per ottimizzare e migliorare l&#39;integrazione di innesti cell Schwann dopo il trapianto e in tal modo di facilitare l&#39;usc...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti (rettangolari)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini con camera</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 4 pozzetti, piastre a 6 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>Piastre a 4 pozzettiPiastre a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p75 da ratto</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi secondari (coniugati con Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Capra anti-topo 568Capra anti-coniglio 488</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari biotinilati</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Capra anti-topo</td></tr><tr><td>Compresse di DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>Kit ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di schwann-astrociti interazioni utilizzo in vitro saggi

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Cellule di Schwann sono una delle celle utilizzate nelle strategie di riparazione dopo le lesioni del midollo spinale. Cellule di Schwann sono in grado di supportare la rigenerazione assonale e germinazione da 1,2 secernono fattori di crescita e fornendo la promozione della crescita molecole di adesione 3 e molecole della matrice extracellulare 4. Inoltre essi mielinizzare gli assoni demielinizzati nel sito di lesione 5. Tuttavia dopo il trapianto, le cellule di Schwann non migrano dal sito di impianto e non si mescolano con il astrociti ospite 6,7. Ciò si traduce nella formazione di un confine netto tra le cellule di Schwann e gli astrociti, creando un ostacolo per gli assoni in crescita cercando di uscire dal retro innesto nel tessuto ospite prossimale e distale. Astrociti in contatto con le cellule di Schwann anche subire l&#39;ipertrofia e up-regolazione delle molecole inibitori 8-13. Test in vitro sono stati utilizzati per modellare cellule di Schwann-astrociti interazioni e sono stati importanti per capire il meccanismo alla base del comportamento cellulare. Questi test in vitro includono test di confine, dove viene effettuata una co-coltura con due cellule diverse con ogni tipo di cellula che occupa diversi territori con solo un piccolo spazio che separa i due fronti della cella. Come le cellule si dividono e migrano, i due fronti cellulare avvicinarsi gli uni agli altri e, infine, si scontrano. Questo consente il comportamento delle due popolazioni cellulari da analizzare al confine. Un&#39;altra variante della stessa tecnica è quello di mescolare le due popolazioni cellulari in coltura e nel corso del tempo i due tipi di cellule segregare con le cellule di Schwann insieme a blocchi come isole in mezzo astrociti insieme creazione di più di Schwann-astrociti confini. Secondo test utilizzato per studiare l&#39;interazione di due tipi di cellule è il test di migrazione in cui il movimento cellulari possono essere rintracciati sulla superficie del tipo di cellula monostrato 14,15. Questo test è comunemente noto come test coprioggetto invertita. Cellule di Schwann sono coltivati ​​su piccoli frammenti di vetro e sono invertiti a faccia in giù sulla superficie dei monostrati astrociti e la migrazione viene valutata dal bordo del vetrino. Entrambi i saggi sono stati strumentali per lo studio dei meccanismi connessi alla esclusione cellulare e la formazione di confine. Alcune delle molecole identificate utilizzando queste tecniche includono N-caderine 15, proteoglicani Condroitin Solfato (CSPGs) 16,17, FGF / eparina 18, Ef / efrine 19. Questo articolo si propone di descrivere test confine e il dosaggio della migrazione in modo graduale e chiarire gli eventuali problemi tecnici che potrebbero verificarsi.

Questo articolo si propone di descrivere in modo graduale comunemente usato<em&gt; In vitro</em&gt; I test eseguiti nello studio delle cellule di Schwann-asrtocyte interazioni.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Le cellule di Schwann sono tra le cellule più comunemente utilizzate nelle strategie di riparazione a seguito di lesioni al midollo spinale. Le cellule di Schwann sono in grado di supportare l'assonale...

Le cellule di Schwann sono cellule gliali del sistema nervoso periferico utilizzate nel ripristino delle lesioni del midollo spinale. Fondamentalmente, producono fattori di crescita che supportano la rigenerazione assonica e forniscono molecole adesive e della matrice extracellulare che promuovono la crescita. Inoltre, mielinizzano gli assoni nel sito della lesione.Purtroppo, le cellule di swan trapiantate non migrano dal sito degli impianti e non si mescolano con gli astrociti dell'ospite. Ciò porta alla formazione di un confine netto e impedisce agli assoni in crescita di integrarsi con il tessuto ospite. In questo video, vengono utilizzati due metodi per studiare le interazioni tra cellule di swan e astrociti in vitro.Prima di tutto, viene dimostrato un saggio di confine in cui vengono stabiliti su un vetrino i territori di cellule swan e di astrociti e coltivati. Successivamente vengono aggiunti diversi reagenti al vetrino e si procede con un'ulteriore coltura. I vetrini vengono quindi sottoposti a imaging e analizzati per determinare l'effetto dei reagenti sulla migrazione delle cellule swan nel territorio astrocitario o viceversa.Successivamente, viene dimostrato un saggio di migrazione in cui frammenti di coprioggetti ricoperti di nidi di cellule di Schwann vengono capovolti su monocapati di astrociti. Ancora una volta, vengono aggiunti diversi reagenti al mezzo di coltura e, dopo la coltivazione, viene effettuata un'analisi mediante imaging per valutare l'entità e la distanza della migrazione delle cellule di Schwann sui monocapati di astrociti. In definitiva, questo tipo di saggio dovrebbe facilitare lo sviluppo di strategie per ottimizzare e potenziare l'integrazione degli innesti di cellule di Schwann dopo il trapianto.Il vantaggio di questi saggi in vitro rispetto ai metodi esistenti, in cui viene valutata la migrazione su substrati puri, è che essi sono più pertinenti rispetto ai saggi in vivo in cui le cellule trapiantate vengono a contatto con gli astrociti. Inoltre, questi saggi in vitro possono essere utilizzati in altri ambiti, come la biologia cellulare, per rispondere a domande fondamentali quali l'invasione e la migrazione delle cellule tumorali. Prima di iniziare il saggio, procurarsi i seguenti materiali: camere per colture cellulari rivestite con poli-D-lisina, vetrini sterili, mezzo di coltura cellulare e una bottiglia di calcio.Per la soluzione equilibrata di Hanks priva di magnesio, iniziare trattando le cellule di Schwann primarie con tripsina per tre minuti e gli astrociti primari di ratto per cinque minuti. Una volta che le cellule si sono staccate, inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura cellulare. Successivamente, trasferire le cellule di Schwann e gli astrociti in provette Falcon da 15 millilitri separate e centrifugarle a 300 ×g per cinque minuti.Nel frattempo, utilizzando un tagliavetro, tagliare longitudinalmente vetrini rettangolari in modo che si adattino alla larghezza delle camere portavetrino utilizzate per i saggi di contorno e possano facilitare la stesura della goccia di sospensione cellulare. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule di Schwann e gli astrociti a una densità di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. In corrispondenza di un'estremità di una camera portavetrino rivestita con polilisina, depositare una goccia da 50 microlitri di sospensione di cellule di Schwann.Utilizzare una stecca di vetro per spalmare la goccia verso il centro della camera al fine di creare un bordo dritto. Successivamente, posizionare una seconda goccia da 50 microlitri di sospensione di astrociti all'estremità opposta della stessa pozzetta e spalmarla verso il centro. Per ottenere un bordo dritto parallelo al primo, deve essere presente un intervallo di 0,2 millimetri tra le due gocce.Posizionare la camera per colture contenente le gocce nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, lavare le colture con DMEM per rimuovere eventuali detriti cellulari non aderenti.Per stimolare la proliferazione delle cellule di schwan, aggiungere il mezzo nei vetrini a camera. Questo mezzo è integrato con quattro galin ed estratto di ipofisi bovina. I quattro galin aumentano i livelli di AMP ciclico all'interno delle cellule di schwan per indurre la proliferazione, mentre l'estratto di ipofisi bovina fornisce i fattori di crescita necessari per una coltura a lungo termine.Incubare il vetrino per otto-dieci giorni. I due fronti cellulari alla fine si incontreranno e si formerà un confine netto tra i due tipi cellulari. A questo stadio, è possibile eseguire esperimenti.Analizzare i fattori coinvolti nella formazione del confine per esaminare il confine, fissare la co-coltura con formaldeide al 4%. Per distinguere le cellule di Schwann e gli astrociti, eseguire una colorazione immunoistochimica con un anticorpo anti P 75 e un anticorpo anti GFAP rispettivamente. L'anticorpo anti P 75 riconosce il recettore per il NGF a bassa affinità sulle cellule di Schwann, che gli astrociti non possiedono; l'anticorpo anti GFAP riconosce la proteina acida fibrillare gliale, localizzata negli astrociti, per eseguire un saggio di migrazione.Iniziare la semina cellulare. Seminare 1 × 10⁵ astrociti in un millilitro di mezzo in ciascun pozzetto di una piastra a quattro pozzetti con pozzetti da 15 millimetri. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 °C per 24-48 ore fino a quando il monostrato è completamente confluenziale.Nel frattempo, per preparare le cellule swan per valutare la migrazione su monocapotti di astrociti, posizionare coprioggetti circolari rivestiti di polilisina in un tubo da 50 millilitri e utilizzare una pipetta di plastica per frantumarli, creando piccoli frammenti di vetro. Trasferire i frammenti di vetro in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti usando pinzette. Selezionare frammenti di circa cinque millimetri di diametro e trasferirne cinque in ciascuno degli altri pozzetti.Incubare le cellule di Schwann con tripsina per tre minuti. Trasferire quindi le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 300 × g per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule di Schwann a una concentrazione di 2 × 10⁶ cellule per millilitro in mezzo di coltura.Quindi aggiungere 20 microlitri di sospensione di cellule di Schwann su ciascun frammento e incubare a 37 gradi Celsius e 7% di anidride carbonica per due ore. Trascorse due ore, rimuovere le cellule di Schwann dall'incubatore. Aggiungere in ciascun pozzetto una quantità sufficiente di mezzo di coltura integrato con due micromolari, quattro scale in e 10 microgrammi per millilitro di BPE.Quindi, coprire completamente i frammenti con le cellule attaccate con il mezzo e incubare per 24-48 ore fino a quando i frammenti di vetro non siano completamente ricoperti di cellule swan. Una volta che i frammenti sono ricoperti di cellule swan, prelevare sia le cellule swan che gli astrociti dall'incubatore. Utilizzare pinzette per sollevare con attenzione ciascun frammento con le cellule swan attaccate.Immergere il frammento in HBSS per rimuovere le cellule non aderenti, quindi capovolgerlo a faccia in gi&ugrave; sul monostrato di astrociti. Una volta trasferiti tutti i frammenti, aggiungere un millilitro di mezzo di coltura cellulare in ogni pozzetto.Se si devono valutare gli effetti di reagenti sperimentali come i fattori di crescita, questi devono essere inclusi nel mezzo. Rimettere la piastra nell'incubatore e lasciare che le cellule di Schwann migrino per 24-48 ore dopo il periodo di migrazione. I frammenti di vetro vengono fissati sul fondo di ogni pozzetto aggiungendo paraformaldeide al 4% per 30 minuti dopo la fissazione.Colorare immunoistochimicamente le cellule di Schwann per P 75, quindi colorarle utilizzando il kit A BC Strept ADIN fornito con diammine benzidina per permettere la visualizzazione delle cellule di Schwann al microscopio ottico dopo 10 giorni. La coltura co-colturale di cellule di Schwann e astrociti mostra un confine netto tra i due tipi cellulari. Qui, le cellule di Schwann sono identificate tramite P 75.La colorazione del recettore del NGF a bassa affinit&agrave; &egrave; mostrata in rosso, mentre gli astrociti sono identificati mediante colorazione del GFAP mostrata in verde. Il confine tra queste cellule &egrave; pi&ugrave; evidente se nel coltura vengono utilizzati forskolina e BPE, poich&eacute; la proliferazione delle cellule di Schwann &egrave; potenziata. Al contrario, in questo saggio di co-coltura di 10 giorni, le cellule non si sono ben separate in territori distinti.Ciò era dovuto alla scarsa tecnica e alla miscelazione dei due tipi cellulari. Durante la preparazione del saggio di delimitazione, i saggi di migrazione valutano il movimento di un tipo cellulare sulla superficie di un altro tipo cellulare, e pertanto analizzano un fenomeno diverso rispetto alla formazione del confine. Questa immagine mostra cellule swan che migrano lontano dal bordo del coverslip, la freccia indica la direzione della migrazione cellulare.Nel condurre questi saggi in vitro, è importante ricordare che l'effetto dei reagenti può riguardare sia gli astrociti che le cellule di Schwann, e pertanto sono necessari esperimenti successivi per determinare esattamente quale tipo cellulare sia responsabile della migrazione aumentata o ridotta osservata. Inoltre, possono essere eseguite altre tecniche, come l'immunochimica, in particolare nel saggio del confine, al fine di evidenziare quali molecole sono sovraespresso o sottoespresso al confine tra cellule di Schwann e astrociti.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Qui descriviamo una delle cellule di Schwann (SC) saggio transizione, in cui SC sono in grado di sviluppare lungo gli assoni si estendono.

Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.

Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata

Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare la retina dall'occhio del topo per una sperimentazione ex vivo estesa. Questo protocollo sottolinea l'importanza di rendere accessibile questo approccio tecnicamente impegnativo per i ricercatori che desiderano sfruttare le vie di ricerca offerte dal mantenimento della glia retinica in situ nel tessuto vivo.

Un modello di espianto ex vivo per lo studio delle interazioni gliali nella retina del topo

Scopri i saggi in vitro per studiare le interazioni tra cellule di Schwann e astrociti. Questi metodi aiutano a comprendere i meccanismi di rigenerazione del midollo spinale e migliorare le strategie terapeutiche.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Esplora altri video