Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Le cellule di Schwan sono cellule gliali del sistema nervoso periferico che sono state utilizzate nella riparazione delle lesioni del midollo spinale. Fondamentalmente, fattori di crescita che supportano la rigenerazione assonale e forniscono l'adesione che promuove la crescita e le molecole della matrice extracellulare. Inoltre, mielinano gli assoni nel sito della lesione.

Sfortunatamente, le cellule di cigno trapiantate non migrano dal sito degli impianti e non si mescolano con gli astrociti ospiti. Ciò si traduce nella formazione di un confine netto e impedisce agli assoni in crescita di integrarsi con il tessuto ospite. In questo video, vengono utilizzati due metodi per studiare le interazioni tra cellule di cigno e astrociti in vitro.

In primo luogo, viene dimostrato un saggio di confine in cui i territori delle cellule di cigno e degli astrociti vengono stabiliti su un vetrino e coltivati. Diversi reagenti vengono quindi aggiunti al vetrino e successivamente vengono ulteriormente coltivati. I vetrini vengono quindi ripresi e analizzati per determinare l'effetto dei reagenti sulla migrazione delle cellule di cigno nel territorio astrocitario o viceversa.

Successivamente, viene dimostrato un saggio di migrazione in cui frammenti di vetrino coprioggetto ricoperti da nidi di cellule di cigno vengono invertiti su monostrati di astrociti. Anche in questo caso, vengono aggiunti diversi reagenti al terreno di coltura e, successivamente, viene eseguito l'imaging della coltura per valutare l'entità e la distanza della migrazione delle cellule di schwan sui monostrati di astrociti. In definitiva, questo tipo di test dovrebbe facilitare lo sviluppo di strategie per ottimizzare e migliorare l'integrazione degli innesti di cellule di schwan dopo il trapianto.

Il vantaggio di questi saggi in vitro rispetto ai metodi esistenti in cui viene valutata la migrazione su substrati puri è che è più rilevante per i saggi in vivo in cui una cellula trapiantata entra in contatto con gli astrociti. Inoltre, questi saggi in vitro possono essere utilizzati in altri campi, come la biologia cellulare, per rispondere a domande chiave come l'invasione e la migrazione delle cellule tumorali. Prima di iniziare il test, tenere a portata di mano i seguenti elementi, vetrini da camera rivestiti in poli-D, vetrini sterili, terreno di coltura cellulare e una bottiglia di calcio.

La soluzione di origine dell'equilibrio di Hanks senza magnesio inizia con tripsina cellule di rashwan primarie per tre minuti e astrociti primari di ratto per cinque minuti. Una volta che le cellule si sono staccate e attivate la tripsina aggiungendo terreno di coltura cellulare. Quindi, trasferisci le cellule di schwan e gli astrociti in provette di falco separate da 15 millilitri e centrifugali a 300 volte la gravità per cinque minuti.

Nel frattempo, utilizzando un tagliavetro, il coperchio di vetro rettangolare tagliato scivola longitudinalmente in modo da adattarsi alla larghezza dei vetrini della camera utilizzati per i saggi di confine e può facilitare lo spalmamento della goccia di sospensione cellulare. Dopo lo spin Resus, sospendere le cellule di schwan e gli astrociti a una densità di due volte 10 per sei cellule per millilitro. A un'estremità di un vetrino da camera rivestito in polilisina, posizionare una goccia da 50 microlitri di sospensione cellulare di schwan.

Utilizzare una striscia di vetro per spalmare la goccia verso il centro della camera per generare un bordo dritto. Successivamente, posizionare una seconda goccia da 50 microlitri di sospensione di astrociti all'estremità opposta dello stesso pozzetto e spalmarla verso il centro. Per creare un bordo dritto parallelo al primo, dovrebbe esserci uno spazio di 0,2 millimetri tra di loro.

Posizionare il vetrino da camera contenente le gocce nell'incubatore a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore. Lavare le colture con DMEM per rimuovere eventuali detriti cellulari non attaccati.

Per stimolare la proliferazione delle cellule di cigno, aggiungere del terreno ai vetrini della camera. Questo terreno è integrato con quattro galline ed estratto di ipofisi bovina. Le quattro galline aumentano i livelli ciclici di A MP all'interno delle cellule di schwan per indurre la proliferazione e il BPE fornirà i fattori di crescita necessari per la coltura a lungo termine.

Incubare il vetrino per otto-10 giorni. I due fronti cellulari alla fine si raggiungeranno e si formerà un confine netto tra i due tipi di cellule. In questa fase è possibile effettuare esperimenti.

Analizzando i fattori coinvolti nella formazione del confine per esaminare il confine, fissare la co-coltura con il 4% di formaldeide. Per distinguere le cellule di cigno e gli astrociti, eseguire l'immunocolorazione con un anticorpo anti P 75 e un anticorpo anti GFAP, rispettivamente. L'anticorpo P 75 riconosce il recettore NGF a bassa affinità sulle cellule di schwan, che mancano agli astrociti L'anticorpo anti GFAP riconosce la proteina acida fibrillare gliale, che si localizza negli astrociti per eseguire un saggio di migrazione.

Inizia la mia impiattamento. Uno per 10 ai cinque astrociti in un millilitro di terreno in ogni pozzetto di una piastra a quattro pozzetti con pozzetti da 15 millimetri. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24-48 ore fino a quando il monostrato non è completamente confluito.

Nel frattempo, per preparare le cellule di cigno a valutare la migrazione sui monostrati di astrociti, posizionare dei vetrini di vetro rivestiti di polilisina circolare in una provetta da 50 millilitri e utilizzare un perpet di plastica per frantumarli, creando piccoli frammenti di vetro. Trasferire i frammenti di vetro in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, quindi utilizzando una pinza. Scegli frammenti di circa cinque millimetri di diametro e trasferiscine cinque in ciascuno degli altri pozzetti.

Le cellule primarie del cigno della tripsina i per tre minuti. Quindi trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri e centrifugarle a 300 volte la gravità per cinque minuti. Risospendere le cellule di schwan a due volte 10 a sei cellule per millilitro nel terreno di coltura.

Quindi aggiungere 20 microlitri della sospensione di cellule di schwan su ogni frammento e incubare a 37 gradi Celsius e 7% di anidride carbonica per due ore. Dopo due ore, rimuovere le cellule di schwan dall'incubatrice. Aggiungere a ciascun pozzetto una quantità sufficiente di terreno di coltura integrato con due micromolari, quattro scale in e 10 microgrammi per millilitro di BPE.

Quindi i frammenti con le celle attaccate vengono completamente ricoperti di terreno in incubazione per 24-48 ore fino a quando i frammenti di vetro non sono completamente conenti con le cellule del cigno. Una volta che i frammenti sono collegati con le cellule di cigno, recupera sia le cellule di cigno che gli astrociti dall'incubatrice. Usa il forcipe per raccogliere con cura ogni frammento con le celle del cigno attaccate.

Immergere il frammento in HBSS per rimuovere le cellule non attaccate e poi capovolgerlo a faccia in giù sul monostrato di astrociti. Una volta che tutti i frammenti sono stati trasferiti. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto.

Se si valuteranno gli effetti di reagenti sperimentali, come i fattori di crescita, questi dovranno essere inclusi nel terreno. Rimettere la piastra nell'incubatore e lasciare che le cellule di Schwan migrino per 24-48 ore dopo il periodo di migrazione. I frammenti di vetro vengono fissati sul fondo di ciascun pozzetto aggiungendo il 4% di para formaldeide per 30 minuti dopo il fissaggio.

Immuno colorare le cellule di schwan per P 75, quindi colorarle utilizzando il kit A BC Strept ADIN fornito con DIAM benadine per consentire la visualizzazione delle cellule di schwan al microscopio ottico dopo 10 giorni. La co-coltura di astrociti di Schwan mostra un netto confine tra i due tipi di cellule. Qui. Le cellule di Schwan sono identificate da P 75.

La colorazione del recettore NGF a bassa affinità e quella mostrata negli astrociti rossi è identificata dalla colorazione GFAP mostrata in verde. Il confine tra queste cellule è più pronunciato se la forskolina e il BPE vengono utilizzati in coltura perché la proliferazione delle cellule di schwan è migliorata. Al contrario, in questo test di co-coltura di 10 giorni, le cellule non si sono segregate bene in territori diversi.

Ciò era dovuto alla scarsa tecnica e alla miscelazione dei due tipi di cellule. Durante la preparazione del saggio di confine, i saggi di migrazione valutano il movimento di un tipo di cellula sulla superficie di un altro tipo di cellula e quindi valutano un fenomeno diverso da quello della formazione del limite. Questa immagine mostra le cellule di cigno che migrano lontano dal bordo del vetrino coprioggetti, la freccia indica la direzione della migrazione cellulare.

Durante l'esecuzione di questi saggi in vitro, è importante ricordare che l'effetto dei reagenti può essere sia sugli astrociti che sulle cellule di schwan, e quindi sono necessari esperimenti successivi per mostrare esattamente quale tipo di cellula è responsabile dell'aumento o della diminuzione della migrazione osservata. Inoltre, possono essere eseguite altre tecniche come l'immunochimica, e soprattutto nel saggio al contorno, al fine di mostrare quali molecole sono sovraregolate o sottoregolate al confine tra cellule di Sean e astrociti.