Il mantenimento di Wolbachia in Cell-free medio

Il mio nome è Courtney Ston. Lavoro alla Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, nel laboratorio del dottor Jason Rascon. Oggi eseguiremo la purificazione batterica da cellule di insetto coltivate.

In realtà si tratta di una procedura molto semplice. Iniziamo raccogliendo le nostre cellule e quindi frammentando fisicamente le membrane delle cellule ospiti eucariotiche mediante lisi con perline di vetro. Successivamente utilizziamo la centrifugazione differenziale per separare i batteri dai detriti cellulari dell'ospite.

E poi utilizziamo una serie di passaggi di filtrazione per rimuovere ulteriormente le particelle delle cellule ospiti, in modo da ottenere alla fine soltanto il pellet batterico purificato. Questo è effettivamente uno dei requisiti principali. È una cappa a flusso laminare utilizzata per mantenere sterile l'ambiente, poiché le colture cellulari si contaminano molto facilmente.

Abbiamo anche bisogno di terreno di coltura cellulare, delle cellule stesse e le coltiviamo in flaconi di plastica. Abbiamo anche bisogno di microsfere di vetro da tre millimetri, di provette coniche da 50 ml e di una centrifuga in grado di eseguire una centrifugazione ad alta velocità, circa 18.000 G, per formare il pellet dei batteri, ma anche capace di raggiungere circa 3.000 G o 2.500 G per pellettare le cellule ospiti. La prima cosa che faremo è partire dalle nostre cellule in coltura.

Sono cresciute correttamente, vero? Questi sono flaconi T75. Contengono 15 ml di terreno di coltura, così come noi.

Quindi, la prima cosa che faremo è iniziare interrompendo lo strato cellulare e raccogliendolo in un tubo da centrifuga da 50 ml. È necessario semplicemente esercitare una pressione su e giù sullo strato cellulare con una spatola, in modo da staccare tutte le cellule e disperderle nel mezzo. Una volta che le cellule sono nel mezzo, le si trasferisce semplicemente con una pipetta nel tubo conico da ML.

Ora alle due sospensioni cellulari aggiungeremo delle perle di vetro di tre millimetri. Queste sono state autoclavate e possono essere riutilizzate. Possono essere lavate e immerse nella candeggina, quindi autoclavate prima di essere riutilizzate.

Si versa facendo attenzione a non toccare l'orlo del barattolo di vetro B con l'orlo del tubo da centrifuga. Aggiungiamo circa fino al segno dei cinque millilitri di volume di perline di vetro in ciascun tubo da centrifuga. Quindi, la prossima cosa che dobbiamo fare è rompere fisicamente le cellule del terriccio per rilasciare i nostri batteri nella sospensione.

Pertanto, utilizziamo un vortice, impostandolo al massimo livello di agitazione, e vorticiamo per cinque minuti. A questo punto, vorticiamo le cellule con le sfere di vetro da tre millimetri per cinque minuti e preleviamo il soprannatante con una pipetta pulita, trasferendolo in un nuovo tubo da centrifuga sterile da 50 mL. Versiamo la nostra sospensione appena creata, che consiste nei batteri rilasciati insieme alla soluzione e ai detriti cellulari completi.

Il prossimo passaggio che eseguiremo è una centrifugazione a bassa velocità, in modo da poter sedimentare il materiale di scarto e lasciare i batteri in sospensione. Utilizzeremo la centrifuga a 2.500 ×g per 10 minuti. Eseguiremo inoltre la centrifugazione a quattro gradi Celsius per favorire la formazione del pellet sul fondo.

E quindi lo posizioniamo qui, verifichiamo che sia bilanciato, chiudiamo e centrifughiamo per 10 minuti. Ora ho centrifugato il nostro sopernatante contenente detriti cellulari dell'ospite nonché i batteri purificati. Ho effettuato la centrifugazione a 2.500 ×g per 10 minuti.

E come potete vedere, ho un pellet sul fondo del mio tubo che consiste in detriti cellulari. I miei batteri appena liberati si trovano ancora nel soprannatante, poiché la centrifugazione non è stata sufficientemente intensa da farli sedimentare. Quindi, la prossima operazione consisterà nel prelevare il soprannatante e filtrarlo attraverso un filtro da cinque micron.

Questo è un filtro da cinque micron e può essere montato su qualsiasi tipo di siringa. Sto per utilizzare una siringa da 30 ml, ma si estrae semplicemente lo stantuffo e, senza toccare il filtro vero e proprio, in particolare la parte inferiore, che deve rimanere sterile, si attacca la siringa al filtro avvitandola, quindi si preme delicatamente lo stantuffo per far passare il sopranatante attraverso il filtro e raccoglierlo nel nostro tubo.

Non si vuole premere troppo forte perché si potrebbe effettivamente rompere il filtro, che non funzionerebbe più. Se si arriva al punto in cui è necessario applicare molta pressione, bisogna rimuovere il filtro e sostituirlo, poiché ciò indica che è intasato da molti detriti cellulari. A questo punto, ciò che normalmente facciamo, a seconda del volume e come ulteriore metodo per ottenere una coltura batterica molto pura, è aggiungere 250 millimoli di soluzione di saccarosio, sterilizzata mediante filtrazione, nel nostro tubo per centrifuga ad alta velocità.

Per riempire la bottiglia fino a raggiungere almeno l'80% della sua capacità. Di solito la riempiamo fino al collo. Queste provette devono essere riempite così tanto per evitare che implodano all'interno della nostra centrifuga ad alta velocità.

Ok, ora provvederemo a centrifugare il nostro sopranatante ed a concentrare i batteri purificati a 18.000 ×g in questo centrifugo ad alta velocità. Assicuriamoci quindi di posizionare i tubi in modo bilanciato, naturalmente, e poi chiudiamolo. Imposteremo il tempo di 10 minuti.

E preferiamo effettuare questa operazione a 10 gradi Celsius o inferiori, come impostato qui. La velocità angolare per questo rotore specifico nella centrifuga è di 12,5 giri al minuto. Disponiamo di una tabella di conversione, quindi ruoterà a circa 18.670 volte G. A questo punto abbiamo eseguito la centrifugazione ad alta velocità per formare il pellet dei batteri purificati.

Ora, come potete vedere, abbiamo un bel pellet batterico sul fondo del nostro tubo ad alta velocità. Quindi, quello che faremo ora è rimuovere tutto il sopranatante in un contenitore per rifiuti liquidi. A questo punto, dobbiamo risospendere i nostri batteri.

Procederò a risospendere il pellet in due millilitri del nostro mezzo di coltura, ovvero il mezzo per insetti di Schneider, integrato con siero fetale bovino inattivato termicamente al 10%. Risospendo il pellet aspirando e dispensando più volte con la pipetta, finché tutti i batteri non sono nuovamente in sospensione. Ora che i nostri batteri sono di nuovo in sospensione, eseguiremo un ulteriore passaggio di purificazione al fine di eliminare qualsiasi eventuale residuo di cellule ospiti.

Per questo, utilizzeremo un filtro da 2,7 micron. Quello che mi piace fare è usare la custodia in plastica del nostro filtro da cinque micron come supporto. Possiamo quindi aspirare la nostra soluzione, avvitare la siringa al filtro da 2,7 micron e procedere con la filtrazione in un tubo per conservazione a lungo termine.

Come per l'altro filtro, premere delicatamente lo stantuffo. Ora abbiamo la nostra soluzione di batteri purificati. La prossima cosa che vi mostrerò è come valutiamo la vitalità.

Utilizziamo il kit per la vitalità batterica in tempo reale con illuminazione retrostante di Molecular Probes. Questo kit contiene due coloranti: ioduro di propidio e citotina propidio. L'ioduro di propidio è rosso, fluoresce in rosso ed evidenzia esclusivamente i batteri la cui membrana batterica non è completamente integra, mentre la citotina colora tutti i batteri.

Quindi, quando si osservano questi batteri al microscopio dotato di ottiche a fluorescenza, tutti i batteri emetteranno una fluorescenza verde, mentre un sottoinsieme, costituito da quelli morti, emetterà una fluorescenza rossa. Preleviamo un'aliquote piccola dal nostro campione purificato e, in questo caso, preleverò soltanto 10 microlitri, la quantità sufficiente per preparare un vetrino. E la distribuirò in altri due.

E poi aggiungerò i nostri altri due coloranti, appena un microlitro della miscela di ioduro di propidio e citochina, alla nostra sospensione batterica. Successivamente, si può lasciare incubare al buio per 15 minuti. Tuttavia, abbiamo riscontrato che in realtà è possibile procedere direttamente con il montaggio e osservare quasi immediatamente i risultati.

Ok, ora eseguirò l'osservazione in campo oscuro del mio vetrino contenente il ceppo batterico con la colorazione per la vita/morte mediante retroilluminazione. Applicherò la colorazione sul mio vetrino, metterò un coprioggetto e poi osserverò. Userò il nostro filtro misto rosso-verde in modo da poter valutare la vitalità dei miei batteri.

Quindi, quando apro l'otturatore, vedo i miei batteri, che sono più o meno piccoli puntini. Ma vedo che qui circa dal 90 al 95% dei batteri è verde, mentre solo circa il 5% è rosso. Abbiamo quindi un tasso di vitalità molto elevato, giusto?

Finora vi ho illustrato la purificazione di Akia vitali da cellule di insetto coltivate. Questo protocollo comprende la rottura fisica delle cellule ospiti eucariotiche, seguita da una centrifugazione differenziale per isolare i batteri purificati e da una serie di passaggi di filtrazione per garantire la qualità dei batteri purificati, rimuovendo completamente tutti i componenti delle cellule ospiti. Successivamente, abbiamo descritto il saggio live/dead con retroilluminazione, che utilizza due coloranti per valutare la vitalità dei batteri.

E ora è possibile utilizzare i batteri purificati in una varietà di applicazioni, inclusa l'infezione di altri sistemi cellulari in coltura per aumentare l'infezione di un sistema specifico. È inoltre possibile effettuare studi metabolici o numerosi altri tipi di analisi utilizzando i batteri vivi purificati.