Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media
15 luglio 2010
Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.
L'obiettivo generale di questa procedura è adattare e mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane in coltura libera da feeder, utilizzando un mezzo privo di siero completo con sostituto knockout. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando piastre rivestite con gelt, TRX o Cell Start. Il secondo passaggio della procedura consiste nel passaggiare le cellule IPS da MEFs a un mezzo libero da feeder utilizzando il disco spaziatore.
L'ultimo passaggio della procedura consiste nel mantenere continuamente le cellule IPS senza l'uso di cellule di supporto. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una crescita cellulare e una stemness simili a quelle osservate nelle colture con metodi tradizionali, mediante colorazione immunoistochimica con marcatori di pluripotenza. Ciao, sono Kate Wagner del sito GIB co di Life Technologies.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti è che è possibile risparmiare tempo e aumentare la coerenza nella coltura cellulare utilizzando il sostituto del siero knockout in tutto il processo operativo. Oggi la famiglia dei prodotti knockout comprende un'intera gamma di mezzi e reagenti per condizioni con feeder, senza feeder e libere da componenti xenogeni, destinati alle cellule staminali embrionali umane, alle cellule staminali embrionali del topo e alle cellule staminali pluripotenti indotte. Il KSR può essere utilizzato per la derivazione, la crescita, l'espansione, la criopreservazione e i primi passaggi della differenziazione.
Il seguente video illustra come adattare e confezionare le cellule utilizzando KSR in condizioni libere da cellule sentinella. Per l'adattamento e il confezionamento di cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni libere da cellule sentinella, sono necessarie piastre di coltura rivestite con Gel TRX. Un giorno prima della preparazione di queste piastre rivestite, scongelare lentamente un tubo di gelt TRX lasciandolo in frigorifero per tutta la notte. Il giorno successivo, diluire il tubo di gelt TRX scongelato 1 a 100 in mezzo basale trasferendo un millilitro di gel Rex in una bottiglia contenente 99 millilitri di mezzo basale. Mescolare delicatamente la soluzione.
Si consiglia di utilizzare il terreno basale D-M-E-M-F 12 senza siero come mezzo di base, ma consultare il testo del protocollo per altre opzioni. Coprire l'intera superficie di ogni piastra per colture con soluzione gel Rex. Per ogni piastra da 60 millimetri, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione gel trek.
Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius. Piastre aggiuntive possono essere avvolte nella pellicola trasparente e conservate in frigorifero per un massimo di quattro settimane. Ulteriore gelt TRX diluito può essere distribuito e conservato da meno 20 a meno 80 gradi Celsius, ma è consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento prima dell'uso.
Trasferire le piastre rivestite con gelt TRX in una cappa a flusso laminare o in una cappa biologica e lasciarle equilibrare alla temperatura ambiente. Inoltre, preparare tutti gli altri reagenti necessari e assicurarsi che tutti i mezzi siano stati equilibrati a 37 gradi Celsius e correttamente gassati. Per adattare le IPC umane a un mezzo senza feeder First culture.
Le IPSC sono mantenute su cellule nutritizie di metilcellulosa fino al raggiungimento di una confluenza del 70-80%. Aspirare il mezzo da ogni piastra di coltura da 60 millimetri e aggiungere una quantità appropriata di soluzione dispa, pari a un millilitro. In questo caso, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.
Aspirare la soluzione dispa da ogni piastra e rimuovere delicatamente le cellule nutritizie con DPBS due o tre volte. Successivamente, aggiungere una quantità adeguata di mezzo completo con sostituto del siero in ogni piastra. Utilizzando un raschietto per cellule, staccare delicatamente le cellule dalla superficie della piastra.
Raccogliere la sospensione cellulare da ogni piastra in provette coniche separate da 15 millilitri. Sciacquare ogni piastra di coltura con una quantità appropriata di mezzo completo con sostituto del siero e aggiungere il mezzo di risciacquo alle provette coniche da 15 millilitri contenenti la sospensione cellulare. Centrifugare le provette coniche da 15 millilitri a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente per ottenere il pellet cellulare.
Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo. Aggiungere una quantità appropriata di mezzo completo con sostituto del siero, privo di cellule sentinella, in base al rapporto di suddivisione desiderato.
Risospendere delicatamente il pellet. Non frammentare gli aggregati cellulari in frammenti più piccoli, poiché quelli di dimensioni ridotte si attaccano male alla superficie. Aspirare eventuali residui di soluzione di gel TRE dalle piastre di coltura rivestite con gel Rex precedentemente preparate e aggiungere lentamente una quantità adeguata di sospensione cellulare in ciascuna piastra di coltura.
Spostare la piastra colturale avanti e indietro e da un lato all'altro diverse volte per distribuire le cellule uniformemente sulla superficie della piastra. Posizionare delicatamente le piastre colturali in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata costituita da 4-6% CO2 in aria. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente, fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza di circa il 70-80%.
Quando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, coltivate in un mezzo privo di cellule sentinella e contenente un sostituto completo del siero, raggiungono una confluenza del 70-80%, sono pronte per essere sottocultivate. Se sono presenti cellule differenziate, rimuoverle prima della sottocoltura. Aspirare il mezzo usato dalla piastra da 60 millimetri utilizzando una pipetta e risciacquare le cellule due volte.
Aggiungere delicatamente con DPBS un millilitro di soluzione preriscaldata a base di disco alla piastra di coltura. Ruotare la piastra di coltura per ricoprire l'intera superficie cellulare. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per tre a cinque minuti.
Successivamente, aspirare la soluzione del dis spazio e lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS, aggiungere il sostituto completo del siero, il mezzo senza feeder, e staccare delicatamente le cellule dalla superficie della piastra di coltura. Utilizzando un raschietto per cellule, trasferire le cellule in un tubo centrifugo sterile da 15 millilitri. Risciacquare la piastra di coltura due volte con il sostituto completo del siero.
Applicare delicatamente il mezzo senza feeder per rimuovere le cellule che non si sono staccate. Raccogliere il mezzo da entrambi i lavaggi con le cellule nel tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per formare il pellet cellulare senza disturbare il pellet.
Aspirare con attenzione ed eliminare il soprannatante. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo. Risospendere delicatamente le cellule nel sostituto completo del siero.
Mezzo senza feeder utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Non effettuare il tritaggio. Trasferire le cellule in una nuova piastra da 60 millimetri rivestita con gelt TRX al rapporto di suddivisione desiderato.
Spostare la piastra di coltura avanti e indietro e da un lato all'altro diverse volte per distribuire le cellule sulla sua superficie. Collocare la piastra di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata contenente dal 4 al 6% di anidride carbonica in aria al giorno successivo. Sostituire delicatamente il mezzo usato con un completo sostituto del siero.
Alimentare con mezzo privo di cellule morte per rimuovere i detriti cellulari. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente. Questa immagine a contrasto di fase mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piatti da coltura rivestiti con gelt TRX, utilizzando un mezzo completo con sostituto del siero e privo di cellule nutrici.
La morfologia delle IPC è simile a quella delle cellule staminali embrionali umane, caratterizzata da nuclei grandi e citoplasma scarso; la colorazione immunocitochimica mostra che le IPC coltivate in un mezzo con sostituto del siero knockout e un cocktail di fattori di crescita esprimono i marcatori di pluripotenza OCT4 e SSEA4. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come adattare e mantenere le proprie IPC in condizioni senza siero knockout e senza cellule di supporto. È tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'adattamento di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPS) alla coltura senza feeder, utilizzando il mezzo completo KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Include istruzioni dettagliate sia per il processo di adattamento sia per la manutenzione continua delle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Tecniche di coltura cellulare
- Sistemi senza feeder
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPS) possono essere coltivate in diverse condizioni.
- I sistemi di coltura senza feeder offrono vantaggi in termini di riproducibilità ed efficienza temporale.
- Il sostituto del siero KnockOut (KSR) è un componente chiave per mantenere lo stato staminale.
- Questo protocollo ha l'obiettivo di semplificare il passaggio a condizioni di coltura senza feeder.
Scopo dello studio
- Adattare le cellule iPS a condizioni di coltura senza feeder.
- Fornire un metodo affidabile per mantenere le cellule iPS in coltura.
- Dimostrare l'efficacia del KSR nel potenziare la crescita cellulare e la vitalità.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di piastre di coltura rivestite per l'adattamento delle cellule.
- Passaggio di cellule iPS da cellule feeder a mezzo KSR-FF.
- Sostituzione quotidiana del mezzo e monitoraggio della confluenza cellulare.
- Utilizzo dell'immunomarcatura per valutare i marcatori di pluripotenza.
Risultati principali
- Adattamento riuscito delle cellule iPS a condizioni senza feeder.
- Crescita cellulare costante paragonabile a quella delle colture tradizionali con feeder.
- Mantenimento dei marcatori di pluripotenza per tutta la durata della coltura.
- Maggiore riproducibilità nelle pratiche di coltura cellulare.
Conclusioni
- Il mezzo KSR-FF è efficace per la coltura senza feeder delle cellule iPS.
- Questo metodo migliora l'efficienza e la riproducibilità nella ricerca sulle cellule staminali.
- Applicazioni future potrebbero includere la differenziazione e utilizzi terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I sistemi di coltura senza feeder affrontano le sfide relative alla scalabilità e alla riproducibilità nella scoperta di farmaci e nella ricerca preclinica basate su cellule staminali iPS umane. Permettendo un mantenimento costante della pluripotenza in condizioni definite, questo metodo supporta i flussi di lavoro di validazione degli obiettivi e di sviluppo dei saggi. Riduce la variabilità introdotta dagli strati di cellule feeder, migliorando l'affidabilità predittiva dei modelli derivati da cellule staminali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche utilizzando cellule iPS indifferenziate e geneticamente stabili.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico fornendo una piattaforma riproducibile per la chiarificazione dei percorsi molecolari.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio grazie al mantenimento costante della stemness e alla riduzione della variabilità indotta dalla coltura.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi con condizioni extracellulari definite.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso un'adesione cellulare e una cinetica di crescita costanti.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza della piattaforma per flussi di lavoro scalabili mediante l'uso di piastre rivestite e integrazione priva di siero.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie mantenendo la pluripotenza durante il passaggio.
- Allineamento Preclinico: Permette decisioni di avanzamento a rischio aggiustato tramite l'espressione costante di marcatori di pluripotenza (OCT4, SSEA4).
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo riducendo al minimo le variabili non definite nella coltura a lungo termine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta che va dalla biologia iniziale all'identificazione del composto attivo, sostenendo la verifica delle ipotesi e la preparazione dei saggi.
- Biologia della scoperta: Spiega come l'adattamento senza cellule nutrici favorisca la verifica di ipotesi mantenendo la stabilità genetica ed epigenetica.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la semina cellulare riproducibile e lo sviluppo uniforme della confluenza.
- Analisi: Evidenzia i risultati dell'immunomarcatura per i marcatori di pluripotenza come output quantitativi per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica grazie all'espressione sostenuta dei marcatori e a una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane (hESC).
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per molteplici linee di cellule staminali indotte (iPS) in diversi progetti e aree geografiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della coltura di cellule iPS.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su una qualità costante delle cellule staminali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali e nella tecnica asettica.
- Necessita di infrastrutture per la coltura dei tessuti, inclusi incubatori, cappe a flusso laminare e attrezzature per la centrifugazione.
- Richiede la standardizzazione delle procedure di rivestimento (gelTRX, cellStart) tra diversi gruppi di lavoro e sedi.
- Comporta considerazioni relative all'adattamento a diversi background genetici delle cellule iPS e a diversi numeri di passaggio.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento nelle scorte di gelTRX.
