Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di adattare e mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane in coltura senza feeder utilizzando la sostituzione completa del siero knockout, il terreno senza feeder. Ciò si ottiene preparando prima le piastre gelt, rivestite con TRX o rivestite con avvio cellulare. Il secondo passo della procedura consiste nel far passare il tuo IPS dai MEF al supporto senza alimentatore utilizzando lo spazio su disco.

Il passaggio finale della procedura consiste nel mantenere continuamente le cellule IPS libere dall'alimentatore. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una crescita cellulare e una staminalità simili a quelle riscontrate con le colture di metanfetamina attraverso l'immunocolorazione con marcatori pluripotenti. Ciao, sono Kate Wagner e lavoro presso il sito GIB di Life Technologies.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti è che è possibile risparmiare tempo e aumentare la coerenza della coltura cellulare quando si utilizza la sostituzione del siero knockout durante l'intero flusso di lavoro. Oggi la famiglia di prodotti knockout comprende un elenco completo di terreni e reagenti per condizioni basate su feeder, senza feeder e senza xeno per cellule staminali embrionali umane, cellule staminali embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. KSR può essere utilizzato per la crescita della derivazione, l'espansione, la crioconservazione e le fasi iniziali della differenziazione.

Il seguente video mostra l'adattamento e l'imballaggio delle celle utilizzando KSR in condizioni di assenza di alimentatore. Le piastre di coltura rivestite con gel TRX sono necessarie per l'adattamento e il confezionamento di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in condizioni prive di alimentazione un giorno prima della preparazione di queste piastre rivestite, scongelare lentamente una provetta di gelt TRX lasciandola in frigorifero per una notte il giorno successivo, diluire la provetta di gelt di scongelamento TRX da una a 100 in terreno basale trasferendo un millilitro di gel Rex in un flacone contenente 99 millilitri di Medio. Mescolare delicatamente la soluzione.

Si consiglia di utilizzare il knockout D-M-E-M-F 12 come mezzo basale, ma si prega di consultare il testo del protocollo per altre opzioni. Coprire l'intera superficie di ogni piatto di coltura con la soluzione di gel Rex. Per ogni piatto da 60 millimetri, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione gel trek.

Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius. I piatti aggiuntivi possono essere avvolti nel profumo e conservati in frigorifero per un massimo di quattro settimane. Il gel diluito aggiuntivo TRX può essere assegnato e conservato a una temperatura compresa tra meno 20 e meno 80 gradi Celsius, ma è necessario evitare cicli di congelamento e scongelamento multipli prima dell'uso.

Trasferire i piatti rivestiti di gelt TRX in una cappa al limone o a flusso e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente. Inoltre, preparare tutti gli altri reagenti necessari e assicurarsi che tutti i terreni siano bilanciati a 37 gradi Celsius e adeguatamente gassati. Adattare le IPC umane al terreno privo di alimentazione Prima coltura.

L'IPSC è sulle cellule alimentatrici di metanfetamina fino a quando non sono confluenti al 70-80%. Aspirare il terreno da ogni piatto di coltura da 60 millimetri e aggiungere una quantità appropriata di soluzione dispa, che è un millilitro. In questo caso, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.

Aspirare la soluzione di dispa da ogni piatto di coltura e lavare delicatamente le cellule di alimentazione della metanfetamina con DPBS due o tre volte. Quindi, aggiungere una quantità appropriata di terreno di sostituzione del siero completo a ciascuna piastra di coltura. Usando un raschietto per cellule, raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto.

Raccogliere la sospensione cellulare da ciascun piatto in provette coniche separate da 15 millilitri. Sciacquare ogni piatto di coltura con una quantità appropriata di terreno di sostituzione del siero completo e aggiungere il mezzo di risciacquo alle provette coniche da 15 millilitri contenenti la centrifuga per sospensioni cellulari. I tubi conici da 15 millilitri a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.

Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare accuratamente il supernat senza disturbare il pellet cellulare. Muovere delicatamente il tubo per rimuovere completamente il pellet della cella dal fondo del tubo. Aggiungere una quantità adeguata di siero sostitutivo completo, terreno privo di alimentatore in base al rapporto di divisione desiderato.

E risospendere delicatamente il pellet. Non rompere i grumi di cellule a una dimensione più piccola perché i grumi più piccoli non si attaccano bene alla superficie. Aspirare l'eventuale soluzione di gel TRE residua dalle piastre di coltura rivestite in gel Rex precedentemente preparate e aggiungere lentamente una quantità appropriata di sospensione cellulare a ciascuna piastra di coltura.

Muovere la piastra di coltura avanti e indietro e da un lato all'altro più volte per disperdere le cellule sulla superficie della piastra. Posizionare delicatamente le piastre di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata dal 4 al 6% di CO2 nell'aria di errore. Successivamente sostituire il terreno esaurito ogni giorno fino a quando le celle diventano confluenti circa il 70-80%.

Quando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo che crescono in un mezzo di sostituzione completa del siero, senza feeder, sono confluenti al 70-80%, sono pronte per essere sottoposte a subcoltura. Se sono presenti celle differenziate, rimuoverle prima dell'imballaggio. Aspirare il terreno esaurito dal piatto di coltura da 60 millimetri utilizzando una pipetta e sciacquare le cellule due volte.

Con DPBS, aggiungere delicatamente un millilitro di soluzione a base di disco di preriscaldamento al piatto di coltura. Agitare la piastra di coltura per rivestire l'intera superficie cellulare. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.

Quindi, aspirare la soluzione dis space e lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS, aggiungere la sostituzione completa del siero, il terreno privo di alimentatore e raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto di coltura. Utilizzando un raschietto cellulare, trasferire le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Sciacquare due volte la piastra di coltura con la sostituzione completa del siero.

Terreno privo di alimentatore che spruzza delicatamente le cellule che non si sono staccate. Estrarre il fluido da entrambi i risciacqui con le celle nel tubo da 15 millilitri. Centrifugare la provetta a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare le celle senza disturbare il pellet delle cellule.

Aspirare con cura ed eliminare il surnatante. Muovere delicatamente il tubo per rimuovere completamente il pellet della cella dal fondo del tubo. Risospendere delicatamente le cellule in sostituzione completa del siero.

Terreno privo di alimentatore utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Non tri rate. Trasferire le celle in un piatto fresco rivestito di gelt TRX da 60 millimetri con il rapporto di divisione desiderato.

Muovere più volte la piastra di coltura avanti e indietro e da un lato all'altro per disperdere le cellule sulla sua superficie. Posizionare il piatto di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata dal 4 al 6% di anidride carbonica nell'aria il giorno successivo. Sostituire delicatamente il terreno esaurito con una sostituzione completa del siero.

Alimentazione di terreno libero per rimuovere i detriti cellulari. Sostituire il mezzo speso ogni giorno successivo. Questa immagine a contrasto di fase mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piastre di coltura rivestite con gelt TRX utilizzando la sostituzione completa del siero, terreno privo di alimentatore.

La morfologia simile alle cellule staminali embrionali umane caratterizzate da nuclei grandi e scarsa colorazione immunoplasmatica del citoplasma mostra che le IPC coltivate con terreno di sostituzione del siero knockout più il cocktail di fattori di crescita, esprimevano i marcatori pluripotenti, OCT quattro e SSEA quattro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come adattare e mantenere i tuoi IPC e la sostituzione del siero knockout, condizioni senza alimentatore. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.