Name: Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Impara a mantenere cellule iPS umane in coltura senza alimentatore usando il mezzo KSR-FF. Questo metodo garantisce crescita costante e mantiene la pluripotenza per la ricerca sulle cellule staminali.

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Nota: Per mantenere condizioni di coltura sterili, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuate utilizzando pratiche di laboratorio sterile e condotto sotto una cappa a flusso laminare. Prima di iniziare, assicurarsi che i media sono equilibrati a 37 ° C e opportunamente gasati. Preparazione Geltrex rivestita Piatti Cultura Nota: vedi appendice per l'utilizzo di piatti della cultura CELLstart rivestiti <ol><li> Scongelare un tubo di Geltrex (1 ml) lentamente a 2-8 ° C e diluire 1:100 in 99 ml di Knockout D-MEM/F-12. Mescolare delicatamente la soluzione. Nota: alcune linee di cellule iPS possono richiedere una diversa diluizione Geltrex per una crescita ottimale. Vedi appendice per le diluizioni alternative. </li><li> Coprono l'intera superficie di ogni piatto cultura con la soluzione Geltrex (1 mL per un piatto da 35 mm, 1,5 ml per un piatto di 60 mm). </li><li> Sigillare ogni piatto con Parafilm contro l'essiccamento e incubare i piatti per 1 ora a 37 ° C. Nota: A questo punto si può memorizzare il Geltrex rivestite piatti di cultura a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Sigillare ogni piatto con Parafilm per evitare che il Geltrex si secchi. </li><li> Prima di utilizzare, trasferire il Geltrex rivestite piatti di una cappa a flusso laminare e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 1 ora). </li></ol> Preparazione completa alimentatore-Free SR KnockOut Media <ol><li> Per preparare 1 mL di 10 mg / ml soluzione di base FGF, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino a 6 mesi. <table border="0"><tbody><tr><td> Di base FGF </td><td> 10 mcg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 microlitri </td></tr><tr><td> 10% di BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA può essere sostituito con HSA o SR Knockout alla stessa concentrazione. </li><li> Per preparare 50 ml di 2 mg / ml soluzione dispasi, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Filtrare la soluzione sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispasi </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Per preparare 100 mL di SR KnockOut completo alimentatore-Free (KSR-FF) medium asettico combinare i componenti elencati nella tabella sottostante. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione magazzino </td><td> Concentrazione finale </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (n ° cat. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR (n ° cat. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (n ° cat. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> bFGF (cat. no. PHG0024) </td><td> 10 mcg / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table> Si può memorizzare il KSR-FF medio a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Poco prima di pre-raggiunga l'equilibrio completo a temperatura e gas, in modo asettico aggiungere il volume richiesto di 2 mercaptoetanolo (55 concentrazione magazzino mm) per una concentrazione di 0,1 mM finale. Ad esempio, per preparare 100 ml di KSR-FF medio aggiungere 182 microlitri di 55 mM di 2-mercaptoetanolo (diluizione 1:550) In alternativa, il 2-mercaptoetanolo possono essere aggiunti al mezzo di 1X completato e conservato a 2-8 ° C per fino ad una settimana. </li></ol> Adattamento iPSCs a KSR-FF Media <ol><li> Prima di iniziare, pre-equilibrare i vostri piatti Geltrex rivestito a temperatura ambiente nel cappuccio. </li><li> Cultura iPSCs sulle cellule alimentatore MEF fino a quando sono 70-80% confluenti. Fare riferimento al manuale GIBCO fibroblasti embrionali di topo per MEF protocolli basati su cultura. </li> Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. <li> Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Aspirare il terreno dai piatti della cultura, e aggiungere una quantità appropriata di soluzione dispasi. Incubare i piatti a 37 ° C per 3-5 minuti. </li><li> Aspirare la soluzione dispasi da ciascun recipiente di coltura e lavare le cellule MEF alimentatore delicatamente con D-PBS (2 a 3 volte). </li><li> Aggiungere una quantità appropriata di terreno completo SR KnockOut a ciascun recipiente di coltura. Utilizzare un raschietto cella o un pipetta da 5 ml per raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del recipiente di coltura. Nota: vedi appendice per i protocolli di adattamento alternativa è difficile adattare le linee di cellule iPS, </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare da ogni piatto cultura in separata provette da 15 ml conica. Sciacquare ciascun recipiente di coltura con una quantità appropriata di terreno completo SR ad eliminazione diretta, e aggiungere il D-PBS risciacquare medio in provette da 15 ml contenente la sospensione cellulare. Essere cauti a non rompere i grumi di cellule in cellule singole </li><li> Centrifugare le provette da 15 ml a 200 xg per 5 minuti per far sedimentare il iPSCs. </li><li> Aspirare il surnatante dal pellet IPSC. Risospendere il precipitato in una quantità appropriata di KSR-FF medio in base al rapporto di divisione (Tabella 1). Non rompere i grumi di cellule a una dimensione inferiore, perché le macchie più piccole non attaccano bene alla superficie. Nota: Si consiglia un rapporto di divisione di 1:2 per i primi 3 passaggi dopo il iPSCs sono stati diversi passaggi direttamente dal Media IPSC Cultura MEF per KSR-FF media. Normalmente, un rapporto di divisione 1:03-1:05 è appropriato, ma passaging a 1:2 garantisce la maggiore densità di cellule necessarie per l'adattamento in un alimentatore senza cultura. </li><li> Prima di placcatura del iPSCs su piatti Geltrex patinata, aspirare residui soluzione Geltrex da preverniciato piatto, e aggiungere lentamente una quantità appropriata di sospensione cellulare per ogni piatto cultura. Nota: non lavare i piatti prima di placcatura. </li><li> Spostare il piatto della cultura avanti e indietro e di lato a lato diverse volte per disperdere le cellule sulla superficie del piatto. Delicatamente la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C con atmosfera umidificata da 4 a 6% di CO 2 in aria. Sostituire il medio trascorso con KSR-FF ogni giorno. </li></ol> Passaging cellule umane iPS usando KSR-FF <ol start="13"><li> Osservare le iPSCs umano cresce in completo KSR-FF sotto il microscopio per confermare che le cellule sono 70-80% confluenti e pronto per essere sottocoltura. Fare riferimento alla Figura 1. Nota: Se le colonie diventano troppo dense o troppo grande, si verifica una maggiore differenziazione. </li><li> Tagliare e rimuovere eventuali colonie differenziati IPSC prima passaging la cultura. </li><li> Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Aspirare il terreno trascorso dalla nave cultura con una pipetta, e lavare le cellule due volte con D-PBS. </li><li> Aggiungere delicatamente preriscaldato soluzione dispasi alla nave cultura (ad esempio, 1 mL di soluzione dispasi per 60 mm piatto di cultura). Agitare il recipiente di coltura per ricoprire l'intera superficie delle cellule. </li><li> Incubare il recipiente di coltura a 37 ° C per 3 minuti. </li><li> Rimuovere il recipiente dal termostato, aspirare la soluzione dispasi, e lavare delicatamente le cellule con D-PBS. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto cultura utilizzando un raschietto cellula, e trasferire le cellule in una provetta sterile centrifuga 15ml. </li><li> Lavare il piatto cultura due volte con KSR-FF, dolcemente "spruzzo off" tutte le cellule che non si sono staccati. Piscina di risciacquo medio con le cellule nel tubo 15ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule e smaltirlo. </li><li> Picchiettare lievemente la provetta per rimuovere completamente il pellet dal fondo del tubo. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in fase di pre-equilibrato KSR-FF con una pipetta 5 ml sierologico. Non triturare. Nota: è fondamentale nella fase di risospendere delicatamente le cellule senza usare la forza per evitare danni. </li><li> Trasferire le cellule in una nuova di 60 mm Geltrex rivestite piatto al rapporto di divisione desiderato e spostare il piatto della cultura avanti e indietro e di lato a lato diverse volte per disperdere le cellule in tutta la sua superficie. </li><li> Porre la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C con atmosfera umidificata al4 al 6% di CO 2 in aria. </li><li> Il giorno seguente, gentilmente sostituire il medio trascorso con KSR-FF per rimuovere i detriti cellulari. Sostituire il medio speso tutti i giorni dopo. Osservare le cellule iPS quotidiana e il passaggio in base alle esigenze (circa ogni 4-5 giorni). Passaging è consigliato quando le cellule raggiungono il 70-80% confluenza. Per la crioconservazione delle cellule iPS e disgelo, fare riferimento al nostro protocollo dal titolo "Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media". </li></ol> Risultati attesi <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Coltura cellulare al microscopio; studio della crescita cellulare; imaging al microscopio; ricerca biologica." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. L'immagine a contrasto di fase che segue mostra iPSCs coltivate su Geltrex rivestite con piatti della cultura completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut media. La mostra iPSCs morfologia simile alle hESC, caratterizzato da nuclei di grandi dimensioni e scarso citoplasma. (Ingrandimento 40x) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 35 millimetri Piatto </td><td> Piatto 60 millimetri </td><td> Dish 100 millimetri </td></tr><tr valign="top"><td> Completa KnockOut SR media </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Soluzione </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Dispasi </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS per il risciacquo </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Tabella 1. I volumi consigliati <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Clicca qui per vedere l'appendice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Life Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Knockout</td><td></td><td>Cat. n. 12660-012</td><td>Nota: vedere l'appendice per l'uso di prodotti DMEM alternativi</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. n. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto Sierico KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. n. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di Fattori di Crescita per Sostituto Sierico KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. n. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, proteina ricombinante umana, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. n. PHG0024</td><td>Nota: vedere l'appendice per dimensioni alternative di confezioni di bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;etanolo</td><td></td><td>Cat. n. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td></td><td>Cat. n. 17105-041</td><td>Nota: vedere l'appendice per metodi alternativi di passaggio.</td></tr><tr><td>Matrice Basale Geltrex a Fattori di Crescita Ridotti Qualificata per hESC, 1 mL</td><td></td><td>Cat. n. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Salina Fosfato di Dulbecco&amp;rsquo;s (D-PBS) senza calcio e magnesio</td><td></td><td>Cat. n. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Cappa Sterile per Coltura di Tessuti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice impostata a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatti da 60 mm per coltura di tessuti trattati</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alimentatore-free adattamento, la cultura e passaging di cellule ips utilizzando completa alimentatore-free siero sostituzione knockout media

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

La scoperta nel 2006 che fibroblasti umani e mouse potrebbe essere riprogrammato per generare cellule iPS 1-3 con caratteristiche molto simili alle cellule staminali embrionali ha creato una nuova fonte preziosa di cellule pluripotenti per la scoperta di farmaci, terapia cellulare, e la ricerca di base. Mezzi di comunicazione GIBCO e reagenti sono stati in prima linea nella ricerca sulle cellule staminali pluripotenti da anni. Knockout DMEM integrato con sostituzione Knockout siero è il media di scelta per la crescita delle cellule staminali embrionali e ora di cellule iPS cultura 3-9. Il gold standard del sistema dei media può ora essere utilizzato per alimentazione priva di cultura con l&#39;aggiunta di Cocktail SR Factor Knockout crescita. Tradizionale ES umane e metodi di coltura delle cellule iPS richiedono l&#39;uso di mouse o strati alimentatore fibroblasti umani, o l&#39;alimentatore condizionata media. Questi metodi sono cultura alta intensità di lavoro, difficili da scalare ed è difficile mantenere anche le cellule indifferenziate a causa delle condizioni indefinito. Invitrogen ha sviluppato SR Knockout Cocktail fattore di crescita per consentire facilmente la tua transizione colture cellulari anche alla rinfusa, senza pur mantenendo l&#39;uso di SR Knockout.

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l&#39;adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

La scoperta che, nel 2006, i fibroblasti umani e murini potevano essere riprogrammati per generare cellule iPS 1-3 con qualità sorprendentemente simili a quelle delle cellule staminali embrionali ...

L'obiettivo generale di questa procedura è adattare e mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane in coltura libera da feeder, utilizzando un mezzo privo di siero completo con sostituto knockout. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando piastre rivestite con gelt, TRX o Cell Start. Il secondo passaggio della procedura consiste nel passaggiare le cellule IPS da MEFs a un mezzo libero da feeder utilizzando il disco spaziatore.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel mantenere continuamente le cellule IPS senza l'uso di cellule di supporto. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una crescita cellulare e una stemness simili a quelle osservate nelle colture con metodi tradizionali, mediante colorazione immunoistochimica con marcatori di pluripotenza. Ciao, sono Kate Wagner del sito GIB co di Life Technologies.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti è che è possibile risparmiare tempo e aumentare la coerenza nella coltura cellulare utilizzando il sostituto del siero knockout in tutto il processo operativo. Oggi la famiglia dei prodotti knockout comprende un'intera gamma di mezzi e reagenti per condizioni con feeder, senza feeder e libere da componenti xenogeni, destinati alle cellule staminali embrionali umane, alle cellule staminali embrionali del topo e alle cellule staminali pluripotenti indotte. Il KSR può essere utilizzato per la derivazione, la crescita, l'espansione, la criopreservazione e i primi passaggi della differenziazione.Il seguente video illustra come adattare e confezionare le cellule utilizzando KSR in condizioni libere da cellule sentinella. Per l'adattamento e il confezionamento di cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni libere da cellule sentinella, sono necessarie piastre di coltura rivestite con Gel TRX. Un giorno prima della preparazione di queste piastre rivestite, scongelare lentamente un tubo di gelt TRX lasciandolo in frigorifero per tutta la notte. Il giorno successivo, diluire il tubo di gelt TRX scongelato 1 a 100 in mezzo basale trasferendo un millilitro di gel Rex in una bottiglia contenente 99 millilitri di mezzo basale. Mescolare delicatamente la soluzione.Si consiglia di utilizzare il terreno basale D-M-E-M-F 12 senza siero come mezzo di base, ma consultare il testo del protocollo per altre opzioni. Coprire l'intera superficie di ogni piastra per colture con soluzione gel Rex. Per ogni piastra da 60 millimetri, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione gel trek.Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius. Piastre aggiuntive possono essere avvolte nella pellicola trasparente e conservate in frigorifero per un massimo di quattro settimane. Ulteriore gelt TRX diluito può essere distribuito e conservato da meno 20 a meno 80 gradi Celsius, ma è consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento prima dell'uso.Trasferire le piastre rivestite con gelt TRX in una cappa a flusso laminare o in una cappa biologica e lasciarle equilibrare alla temperatura ambiente. Inoltre, preparare tutti gli altri reagenti necessari e assicurarsi che tutti i mezzi siano stati equilibrati a 37 gradi Celsius e correttamente gassati. Per adattare le IPC umane a un mezzo senza feeder First culture.Le IPSC sono mantenute su cellule nutritizie di metilcellulosa fino al raggiungimento di una confluenza del 70-80%. Aspirare il mezzo da ogni piastra di coltura da 60 millimetri e aggiungere una quantità appropriata di soluzione dispa, pari a un millilitro. In questo caso, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.Aspirare la soluzione dispa da ogni piastra e rimuovere delicatamente le cellule nutritizie con DPBS due o tre volte. Successivamente, aggiungere una quantità adeguata di mezzo completo con sostituto del siero in ogni piastra. Utilizzando un raschietto per cellule, staccare delicatamente le cellule dalla superficie della piastra.Raccogliere la sospensione cellulare da ogni piastra in provette coniche separate da 15 millilitri. Sciacquare ogni piastra di coltura con una quantità appropriata di mezzo completo con sostituto del siero e aggiungere il mezzo di risciacquo alle provette coniche da 15 millilitri contenenti la sospensione cellulare. Centrifugare le provette coniche da 15 millilitri a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente per ottenere il pellet cellulare.Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo. Aggiungere una quantità appropriata di mezzo completo con sostituto del siero, privo di cellule sentinella, in base al rapporto di suddivisione desiderato.Risospendere delicatamente il pellet. Non frammentare gli aggregati cellulari in frammenti più piccoli, poiché quelli di dimensioni ridotte si attaccano male alla superficie. Aspirare eventuali residui di soluzione di gel TRE dalle piastre di coltura rivestite con gel Rex precedentemente preparate e aggiungere lentamente una quantità adeguata di sospensione cellulare in ciascuna piastra di coltura.Spostare la piastra colturale avanti e indietro e da un lato all'altro diverse volte per distribuire le cellule uniformemente sulla superficie della piastra. Posizionare delicatamente le piastre colturali in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata costituita da 4-6% CO2 in aria. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente, fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza di circa il 70-80%.Quando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, coltivate in un mezzo privo di cellule sentinella e contenente un sostituto completo del siero, raggiungono una confluenza del 70-80%, sono pronte per essere sottocultivate. Se sono presenti cellule differenziate, rimuoverle prima della sottocoltura. Aspirare il mezzo usato dalla piastra da 60 millimetri utilizzando una pipetta e risciacquare le cellule due volte.Aggiungere delicatamente con DPBS un millilitro di soluzione preriscaldata a base di disco alla piastra di coltura. Ruotare la piastra di coltura per ricoprire l'intera superficie cellulare. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per tre a cinque minuti.Successivamente, aspirare la soluzione del dis spazio e lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS, aggiungere il sostituto completo del siero, il mezzo senza feeder, e staccare delicatamente le cellule dalla superficie della piastra di coltura. Utilizzando un raschietto per cellule, trasferire le cellule in un tubo centrifugo sterile da 15 millilitri. Risciacquare la piastra di coltura due volte con il sostituto completo del siero.Applicare delicatamente il mezzo senza feeder per rimuovere le cellule che non si sono staccate. Raccogliere il mezzo da entrambi i lavaggi con le cellule nel tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per formare il pellet cellulare senza disturbare il pellet. Aspirare con attenzione ed eliminare il soprannatante. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo. Risospendere delicatamente le cellule nel sostituto completo del siero.Mezzo senza feeder utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Non effettuare il tritaggio. Trasferire le cellule in una nuova piastra da 60 millimetri rivestita con gelt TRX al rapporto di suddivisione desiderato.Spostare la piastra di coltura avanti e indietro e da un lato all'altro diverse volte per distribuire le cellule sulla sua superficie. Collocare la piastra di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata contenente dal 4 al 6% di anidride carbonica in aria al giorno successivo. Sostituire delicatamente il mezzo usato con un completo sostituto del siero.Alimentare con mezzo privo di cellule morte per rimuovere i detriti cellulari. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente. Questa immagine a contrasto di fase mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piatti da coltura rivestiti con gelt TRX, utilizzando un mezzo completo con sostituto del siero e privo di cellule nutrici.La morfologia delle IPC è simile a quella delle cellule staminali embrionali umane, caratterizzata da nuclei grandi e citoplasma scarso; la colorazione immunocitochimica mostra che le IPC coltivate in un mezzo con sostituto del siero knockout e un cocktail di fattori di crescita esprimono i marcatori di pluripotenza OCT4 e SSEA4. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come adattare e mantenere le proprie IPC in condizioni senza siero knockout e senza cellule di supporto. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

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Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

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Cresta neurale (NC), le cellule derivate da cellule umane staminali pluripotenti (HPSC) hanno un grande potenziale per modellare lo sviluppo umano e la malattia e per le terapie di sostituzione cellulare. Qui, un libero adattamento-feeder della tuttora ampiamente...

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) - e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.

Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell

La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

La produzione di cellule specializzate della retina da cellule staminali pluripotenti è un punto di svolta nello sviluppo della terapia a base di cellule staminali per malattie retiniche. Il presente documento descrive un metodo semplice per una generazione efficiente dei organoids della retina e dell'epitelio pigmentato retinico per la ricerca di base, traslazionale e clinica.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Per evitare le limitazioni associate al passaggio enzimatico o meccanico di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC o hiPSC mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA.

Passaggio rapido, economico e privo di enzimi di cellule staminali pluripotenti umane su cellule nutritrici mediante disadesione mediata dall'acido etilendiamminotetraacetico

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Impara a mantenere cellule iPS umane in coltura senza alimentatore usando il mezzo KSR-FF. Questo metodo garantisce crescita costante e mantiene la pluripotenza per la ricerca sulle cellule staminali.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media (Video) | JoVE Journal

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

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