Induzione e punteggio clinico dell'epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Sono Christine Beaton. Sono un assistente ricercatore nel laboratorio di George Chen presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. E quello che vi mostrerò nei prossimi giorni è come indurre e monitorare l'EAE cronica recidivante, che sta per Encefalomielite Autoimmune Sperimentale nei ratti DA.

Questo è un modello animale per la sclerosi multipla, o dovrei dire, uno dei modelli animali per la sclerosi multipla. Ed è caratterizzato da una paralisi flacida ascendente in quegli animali e da caratteristiche istologiche che assomigliano alla malattia umana. Quindi ci vorranno diversi giorni.

Quindi il primo giorno ti mostrerò come preparare l'emulsione genica con omogeneizzato di midollo spinale rosso naive in adiuvante trans completo. Il secondo giorno, vi mostrerò come immunizzare i ratti all'UCAE, e poi aspetteremo tra i sette e i 15 giorni per vedere i primi segni clinici in quegli animali, a quel punto vi mostrerò i diversi stadi di progressione dell'EAE in diversi animali. Quindi per prima cosa vi mostrerò tutti i reagenti e il materiale necessario per preparare l'emulsione.

Quindi quello che sto usando è un adiuvante frontale completo H 37 ra, ma questo, sebbene abbia già la tubercolosi microbica, lo integrerò a quattro milligrammi per M con un micobatterio più essiccato IH 37 ra. E per preparare questi batteri essiccati, ho bisogno di metterli in altro catrame e farne una polvere sottile con il Pele. Una volta fatto, aggiungerò quei batteri all'adiuvante.

Quindi l'adiuvante è pronto. Il passo successivo è preparare il mio antigene. Quindi tolgo il midollo spinale del ratto D che è congelato a meno 80, e per mantenerlo davvero congelato, lo metto sul piatto per pesare nel ghiaccio secco, e lo tolgo uno per uno e, usando semplici lamette da barba, sminuisce il midollo spinale nei piatti per pesare.

Metterò quindi il mio adiuvante integrato sul vortice. E mentre sono in vortice, aggiungerò il mio midollo spinale a poco a poco al mio adiuvante dopo aver mescolato tutto il midollo spinale all'adiuvante sul vortice. Vorticeremo per altri cinque minuti, dopodiché trasferiremo l'immersione preparata in cinque siringhe di vetro M.

Collegheremo due siringhe di vetro da cinque M utilizzando un ponte da 16 G e spingeremo l'emulsione da una siringa all'altra il più velocemente possibile per quel ponte. E dopo qualche minuto, quando l'emulsione inizia a diventare più dura, passiamo a un ponte più piccolo. Questo è 18 G, e questo renderà l'emulsione ancora più dura, e lo terremo in quelle siringhe con questo ponte avvolto in un foglio di alluminio durante la notte in frigorifero.

Quindi ho pesato 30 milligrammi di tubercolosi microbica sulla carta per pesare. Li ho trasferiti in una morale. E usando un Pele, ho ridotto gli aggregati di batteri in una polvere sottile.

Ma non vuoi premere troppo forte con il pestello per non rompere i batteri. Quando i batteri si aggregano all'inizio di una procedura, sono di colore giallo beige. Se hai fatto una polvere sottile, sottile, alla fine avrai una polvere bianca, ed è quello che vuoi, ma non vuoi premere troppo forte per rompere i batteri.

Una volta fatto ciò, ho preso un ampere da 10 mil di adiuvante trans completo e mi sono assicurato che tutti i batteri fossero in sospensione. Ho aperto questo campione e ho versato tutti i 10 mil di adiuvante trans completo nella morta sopra il micobatterio tubercolosi disaggregato. E ora trasferirò l'adiuvante trans completo integrato in un tubo da 50 mil.

Quindi ora sto prendendo il mio adiuvante trans completo integrato e lo sto mettendo in un tubo. Quindi, naturalmente, i batteri sono sul fondo del liquido e cercherò di far uscire la maggior parte di loro nel tubo. Ma se ne lascio un po' nella malta, non sarà un grosso problema perché riutilizzerò questa malta senza pulirla per preparare la mia emulsione del midollo spinale.

Ecco quindi il midollo spinale. Sono stati mantenuti congelati a meno 80. Ne ho pesati 10 grammi da aggiungere a 10 ml del mio adiuvante integrato.

Quindi, quello che farò con quei midollo spinale mantenendoli congelati il più a lungo possibile, li triterò molto finemente in quei piatti di pesatura usando le lamette da barba. Quindi, per tritare molto finemente il midollo spinale, sono necessarie due lamette da barba e un piatto per pesare. Quindi quello che faccio è prendere un midollo spinale, metterlo nel mio piatto per pesare, e inizio a tagliarlo, e metto la mano sopra in modo che, dato che è congelato, il suo cuore, inizi a saltare in giro e io prendo i primi grossi pezzi e inizi a scongelarsi molto velocemente e ad attaccarsi al lato della mia lama di rasoio.

Quindi uso l'altra lametta per toglierlo, e cerco di tritarlo il più finemente possibile e il più velocemente possibile in modo che non abbia il tempo di sciogliersi perché è molto più difficile da tagliare una volta sciolto. Quindi è estremamente importante che il midollo spinale sia completamente tritato, molto finemente, perché più finemente, più fine è, più l'immersione sarà omogenea, e più ratti si ammaleranno e con una malattia più omogenea. Quindi è estremamente importante tritare tutto il midollo spinale molto, molto bene.

Quindi ora continuerò a tritare ognuno di quei midolli spinali esattamente allo stesso modo fino a quando non avrò finito con tutti i 10 grammi di midollo spinale. Quindi ora quello che farò è mescolare un po' il midollo spinale nella morta solo per assicurarmi di raccogliere tutto il micobatterio tubercolosi che era rimasto nella morta dopo aver finito di integrare l'adiuvante. E quello che farò dopo è mettere l'adiuvante sul vortice.

E mentre vortice continuamente il più velocemente possibile, aggiungerò il mio midollo spinale medio a poco a poco a questo adiuvante. Quindi ora ho il mio adiuvante integrato sul vortice e inizierò ad aggiungere, aggiungendo il mio cavo del pannello dei mezzi a poco a poco. Il motivo per cui sto aggiungendo l'A, l'antigene, molto lentamente all'adiuvante è perché stiamo facendo un'emulsione di acqua in olio.

Quindi l'adiuvante è per lo più olio minerale e l'antigene è una soluzione uguale. Quindi quello che vogliamo fare è mescolare l'antigene molto lentamente all'olio in modo che l'olio ricopra completamente l'antigene ogni volta che lo aggiungiamo. Quindi, se lo aggiungessimo in una volta sola, non ricoprirebbe completamente l'antigene.

Quindi ora ho aggiunto tutto il midollo spinale medio all'adiuvante sul vortice, e ho attaccato il tubo sul vortice per lasciarlo girare per altri cinque minuti per assicurarmi che tutto si mescoli completamente. E regolo la velocità in modo da avere il vertice più alto possibile senza perdere troppo nella parte finale del tubo. Quindi ora gli altri cinque minuti di vortice sono finiti, e fermerò il vortice e trasferirò il mio mercante in siringhe di vetro.

Quindi ho assemblato la siringa piena. L'ho attaccato al ponte di diametro maggiore, e all'altra mano del ponte, ho attaccato solo il cilindro di una siringa, e ora aggiungerò l'emulsione in quella siringa. Quindi ora, no.

Ora prenderò tutto il liquido nella siringa inferiore, scollegherò quella superiore, finirò di assemblare quella superiore, mi assicurerò che non ci siano bolle d'aria nella mia siringa inferiore o nel ponte. E ora mi riattaccherò. Quindi ora ho entrambe le siringhe attaccate insieme attraverso questo ponte.

Uno è pieno di immersione, l'altro è vuoto. E quello che farò ora è spingere il più velocemente possibile, il contatore di una siringa all'altra avanti e indietro. Quindi ora cambierò il ponte di grande diametro con uno più piccolo al ponte da 18 G.

Il ponte più piccolo renderà l'emulsione ancora più densa. Quindi, per cambiare i ponti, ho messo tutta l'emulsione in una siringa. Tolgo la siringa vuota, mi assicuro di non perdere nulla nel ponte, tolgo il ponte, metto quella nuova, rincorro tutte le bolle d'aria e riattacco l'altra siringa.

E ripeto la procedura che ora l'emulsione è molto più difficile da attraversare, e sto attento a non rompere questo ponte, che è molto fragile. E ripeto questa procedura con un altro set di siringhe finché ho l'emulsione nel mio tubo. Quindi uso tutte le siringhe necessarie per consumare tutta l'emulsione.

Quindi ora ho mescolato l'emulsione diverse volte, forse 10, 15 volte, ma varia con questi lotti. E ora sta diventando estremamente difficile da superare. E lo farò un altro paio di volte, beh, o forse no.

Ora è davvero bloccato, quindi lo lascerò lì. In caso contrario, c'è il rischio di rompere una siringa o il ponte. Quindi, quando smette di passare, se succede molto presto, significa che forse il ponte è intasato.

Ma a questo punto, visto che l'ho mescolato almeno 10 o 15 volte, vuol dire che l'emulsione è pronta. È molto denso, quindi dovrei lasciarlo stare. Ora lo avvolgo in un foglio di alluminio e lo metto in frigo per la notte.

Così ieri abbiamo preparato l'emulsione con il midollo spinale rosso e abbiamo lasciato l'emulsione tutta la notte in frigo. Oggi lo togliamo e gli iniettiamo 200 microlitri per ratto alla base della coda. Ma prima di iniettarlo, dobbiamo assicurarci che l'emulsione sia buona.

Quindi dovrebbe essere ancora solido, ed è ancora un bel solido. La crepa che vedete qui ci dice anche che è un bel solido, non è separato in fase, in due fasi, il che sarebbe un male. Quindi questa emulsione è buona per essere usata.

Quindi ogni gabbia riceverà 200 microlitri della nostra emulsione. E per iniettarlo, usiamo tre siringhe mil, ma ci assicuriamo di usare siringhe con punta lu lock perché se usiamo siringhe scivolate, le sue siringhe. L'emulsione è così densa che l'ago potrebbe fuoriuscire mentre stiamo cercando di iniettare.

Quindi scegli sempre la siringa di tipo lu lock. E come ago, cerchiamo di andare con l'ago più piccolo possibile, ma con un'emulsione così densa, dobbiamo andare con un ago calibro 20. Dal momento che abbiamo bisogno di iniettare in modo molto preciso alla base della coda, anizziamo i ratti per alcuni minuti e cogliamo l'occasione che quei ratti sono profondamente addormentati per marcarli e per marcarli.

Usiamo punzoni per le orecchie e ogni ratto è identificato da uno schema specifico della tua punzonatura. Quindi ora siamo pronti per iniettare i ratti, e daremo a ciascun ratto 200 microlitri di emulsione alla base della coda, e segneremo le orecchie allo stesso tempo. Preparo l'emulsione nella siringa per iniezione solo per un ratto alla volta perché spesso è davvero difficile da iniettare e sto premendo molto forte, e non voglio iniettare più del necessario a un ratto.

Quindi riempio la siringa solo per un hu alla volta. Per riempire la siringa, collego la mia siringa di plastica per iniezione al ponte che a sua volta è collegato alla siringa di vetro che contiene l'emulsione. Ho messo circa 300 microlitri di emulsione nella mia siringa di plastica.

Poi collego l'ago e spingo l'aria fuori dall'ago in modo da non perdere questi 50 microlitri di spazio perso nell'ago. E mi assicuro di averne solo 200 microlitri, e poi li inietto alla base della coda del topo. Quindi, ora che abbiamo iniettato tutti i nostri cuori, li monitoreremo quotidianamente.

Quindi li peseremo ogni mattina e li controlleremo due volte al giorno per i segni clinici di EAE. I primi segni, come vi mostrerò quando appariranno, saranno una coda flaccida, e ci aspettiamo di vedere quei segni apparire per i primi ratti intorno al settimo giorno, all'ottavo giorno dopo l'iniezione. La maggior parte dei ratti si ammalerà tra il 10° e il 12° giorno e gli ultimi ratti si ammaleranno tra il 15° e il 17° giorno.

Ora siamo al 13° giorno dopo aver immunizzato i nostri cuori con l'emulsione del midollo spinale, e ora ho intenzione di monitorare quegli animali per controllare il loro punteggio clinico. Ma prima di farlo, lascia che ti presenti come ospitiamo i nostri animali. Quindi le malattie autoimmuni sono questa caratteristica che qualsiasi agente patogeno presente nell'animale ridurrà la risposta autoimmune.

Quindi, per evitare che ciò accada al massimo, ospitiamo i nostri ratti in condizioni specifiche. Quindi il capannone in questo cubicolo, che contiene aria filtrata ed è sotto pressione positiva, gli animali sono alloggiati in gabbie autoclavate. Quindi assolutamente tutto nella gabbia viene sterilizzato in autoclave prima di mettere la rete per topi.

E hanno filtri sopra le gabbie. Il cibo è il cibo standard per roditori. Sono io che ho originato.

E diamo anche ai nostri ratti acqua acidificata. Prendiamo normale acqua potabile e aggiungiamo acido cloridrico seguendo i protocolli standard, e usiamo acque acidificate per mantenere la flora intestinale al minimo, il che ridurrà il rischio di compromettere la nostra risposta autoimmune. Quindi ora sono pronto per fare il punteggio clinico dei miei ratti.

Il punteggio varia da un punteggio di zero, che non è alcun segno clinico, a sei, che è uno stato morboso, in cui si verificano sacrifici gli animali. E ora vi guiderò passo dopo passo mostrandovi esempi di ogni punteggio clinico che possiamo trovare in questo modello. Quindi ora siamo al giorno 13 dopo l'immunizzazione dei ratti all'UCAE.

E in quella gabbia ho due topi che non si sono ancora ammalati. Quindi non hanno assolutamente alcun segno clinico di yay. Quindi entrambi i ratti sono ancora sani.

Corrono in giro, corrono e, come puoi vedere, quando si muovono, sollevano la coda dalla lettiera. Quindi a volte lasciano asciugare la coda, ma la maggior parte delle volte cercheranno di sollevarla dalla lettiera. E se ne hanno la possibilità, usciranno anche dalla gabbia, il che significa che hanno il pieno controllo di tutti e quattro gli arti e possono alzarsi in piedi se necessario.

Quindi il primo segno clinico di EA è una coda floscia. Quindi, se prendo in braccio un topo e premo il dito contro la coda, il topo avrà la tendenza ad afferrare con la punta della coda. Quindi, come hai appena visto, questo topo non ha una coda di li, e posso farlo con l'altro.

La coda afferra il dito, il che significa che quei ratti hanno una coda completamente reattiva. Hanno un punteggio clinico pari a zero, il che significa che in realtà non c'è affatto ae. Quindi ecco un ratto che ha un punteggio clinico di O 0,5.

Quindi, se lo guardi nella gabbia, si comporta in modo assoluto, normalmente corre in giro, si arrampica sul lato della gabbia, ma la punta della coda non si stacca mai dalla lettiera. Quindi questo ratto potrebbe avere una coda parziale degli arti. Quindi quello che faccio è afferrare il topo e fare lo stesso test, e anche se la coda ha un certo tono, l'estremità non si arriccia completamente sul mio dito.

Quindi assegnerò a questo ratto un punteggio di 1,5, che è una coda parziale di li. Quindi il punteggio clinico di uno è caratterizzato da una coda completa di flad, quindi nessuna parte della coda ha alcun tono, ma il rosso può ancora usare le loro linee posteriori. Quindi, come puoi vedere, questo topo è in piedi contro il lato della gabbia, il che mostra che le sue zampe posteriori funzionano normalmente.

Ma se controllo la coda di quei ratti raccogliendoli, non c'è assolutamente alcun tono nella loro coda. Un altro test che puoi fare è mentre l'IF è in fondo alla gabbia, se sollevi la coda con un normale RU, la coda scenderà lentamente o forse non raggiungerà nemmeno il suolo con l'RU con un punteggio di uno. Se sollevi la coda, cadrà immediatamente a terra.

Questa RU qui può muovere tutti e quattro gli arti, ma gli arti posteriori sono troppo deboli per permettere a questa RU di stare in piedi. Quindi classificherò questa RU con un punteggio clinico di due. Quindi la differenza principale tra un punteggio di uno e due è che il punteggio di uno è solo una coda floscia.

Le zampe posteriori sono perfettamente funzionanti e con un punteggio di tre, il topo cadrebbe su un fianco. Due è intermedio, quindi il ratto può usarlo indietro, le zampe posteriori, ma sono molto più deboli di quello di un ratto normale. Quindi questo ratto ha una caratteristica insolita di EAE.

Normalmente l'EAE è caratterizzata da una paralisi flacida ascendente, ma in alcuni casi, che sono piuttosto rari, come questo, i ratti sviluppano la prima paralisi dell'arto anteriore prima che l'arto posteriore venga paralizzato. E questo è il caso di questo topo. Quindi, se lo guardi, la sua testa è più bassa del resto del suo corpo perché il destro ha difficoltà con gli arti anteriori e non può arrampicarsi sul lato della gabbia.

E sebbene i suoi arti posteriori funzionino normalmente, non può spingere con gli arti anteriori. Quindi darei comunque un punteggio a questo ratto con un punteggio di due, che corrisponderebbe a un lieve paras, anche se normalmente vediamo che con gli arti posteriori in questo ru, lo vediamo con i quattro arti. Quindi questa RU ha un fenotipo molto più grave rispetto alle precedenti.

Ha un punteggio clinico di tre. Quindi, come sto per mostrarvi, gli arti anteriori funzionano in modo assolutamente normale, ma i due arti posteriori hanno un parais moderato presente. Quindi entrambi gli arti sono utilizzabili dall'IF per muoversi, ma l'RU cade su un fianco e non può controllare completamente quelle gambe.

Quelle spore, stanno diventando molto più deboli di quanto sarebbero normalmente senza EE. E a quel punto, non ci preoccupiamo più della zoppia della coda perché molti di quei ratti, dopo un po', iniziano ad avere una coda molto ispida. Quindi questo ha ancora una coda molto floscia, ma a volte si può vedere un po' di distonia. Quindi la coda inizia a muoversi in modo scoordinato.

Quindi non guardiamo più la coda a questo livello, guardiamo solo a come funzionano gli arti. Diamo un punteggio corretto di 3,5 perché se guardiamo i suoi arti posteriori, uno si muove, ma l'altro è completamente paralizzato e non aiuta affatto nel movimento in avanti del ru. Quindi questa è considerata una paralisi completa di una linea posteriore e quindi un punteggio di 3,5.

Questa RU ha un punteggio clinico di quattro, il che significa paralisi completa della linea posteriore, e questo è caratterizzato da una totale incapacità di muovere le zampe posteriori. Il ratto che abbiamo in questa gabbia ha un punteggio clinico di cinque, quindi corrisponde a una paralisi completa della linea posteriore con un'ulteriore incontinenza. Questo animale è incontinente, come possiamo vedere, il suo peso completo in questa zona, che non vediamo negli altri animali che non sono nel continente.

Quando i nostri HUS hanno punteggi di tre o più, diamo loro bottiglie d'acqua con lunghi tubi per sorseggiare per assicurarci che possano accedere all'acqua. E mettiamo anche il cibo sul fondo della gabbia e diamo loro anche impacchi di gel. Ma anche se con tutto ciò, ogni volta che portiamo fuori i ratti per monitorarli, che è due volte al giorno, offriamo loro sempre acqua nel caso in cui non abbiano avuto accesso a abbastanza acqua durante il giorno.

Qui ho un ratto con un punteggio clinico di quattro. E a quel punto, quegli animali devono essere un po' incoraggiati a mangiare. Quindi quello che faccio è bagnare il loro cibo, il che rende molto più facile per loro masticarlo.

Quindi, nelle ultime due settimane, vi ho mostrato come indurre e monitorare l'EAE cronica recidivante nei ratti DA. Quindi, nella prima fase, vi ho mostrato come preparare l'immersione del midollo spinale, quindi come iniettarla alla base della coda di quei ratti. E oggi vi ho mostrato come valutare quei ratti con diversi livelli di malattia.

Naturalmente, questo è un modello di recidiva cronica, quindi ci aspettiamo che i ratti abbiano punteggi fluttuanti. La malattia andrà in remissione in pochi giorni e ricadrà nel tempo. Alcuni ratti entreranno in una fase più cronica della malattia.

Varierà da animale ad animale. Ora, prima di concludere questo video, voglio sottolineare una cosa riguardo alla sperimentazione di farmaci in quei modelli. Il punto molto importante è quello di randomizzare gli animali nel miglior modo possibile.

Una cosa molto importante da sapere è che prima l'animale si ammala, più grave è la sua malattia. Quindi non vuoi raggruppare tutti i tuoi animali di controllo il primo giorno e gli animali trattati nei giorni successivi. Quello che facciamo è non appena un animale si ammala e il giorno in cui vogliamo iniziare il trattamento, inseriamo gli animali in modo casuale in due gruppi diversi.

Se abbiamo, ad esempio, un gruppo di controllo e uno trattato, il primo cuore andrà nel gruppo di controllo, il secondo in un gruppo trattato, e così via fino a quando tutti gli animali saranno inseriti nel proprio gruppo. Ma ci assicuriamo che questa randomizzazione avvenga il prima possibile nel protocollo. Quindi spero che questo video ti sia stato utile e che sarai in grado di indurre e monitorare l'EAE recidivante cronica nei ratti D.

E buona fortuna con i tuoi esperimenti.