Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione
17 settembre 2010
Questo protocollo descrive un metodo non-virale di consegna di costrutti genetici per una certa area del cervello dei roditori viventi. Il metodo consiste di preparazione plasmide, fabbricazione micropipetta, chirurgia neonatale dei cuccioli di ratto, microiniezione del costrutto, e In vivo Elettroporazione.
Ciao, sono RI Ov. E io sono Alexia Ying. Siamo studenti post-laurea della Cent University. In questo video, presenteremo un metodo di elettroporazione in vivo per il trasferimento di un gene bersaglio in una specifica area di un tessuto cerebrale in via di sviluppo.
Quindi vediamo. Il metodo dell'elettroporazione in vivo offre un modo rapido ed efficiente per veicolare geni di interesse o RNA interferenti a doppio filamento in tessuto cerebrale vivente.
Offre un'alternativa a basso costo alla creazione di animali transgenici e all'approccio di trasferimento genico virale. In questo video, illustreremo una procedura dettagliata per il trasferimento genico postnatale alla corteccia rad neonatale. Useremo un plasmide che codifica per la proteina verde fluorescente migliorata e per il promotore dell'actina beta di pollo con un enhancer CMV.
Eseguiamo tutte le manipolazioni chirurgiche all'interno di un armadio a flusso laminare per mantenere la sterilità e ridurre al minimo il rischio di contaminazione batterica o fungina dell'animale. Per la somministrazione del plasmide alla corteccia, utilizziamo un microiniettore WPI con controllore elettronico e una siringa Hamilton da 10 microlitri collegata a un manipolatore stereotassico. Il ratto rosso viene anestetizzato mediante un'unità di anestesia composta da una scatola e una maschera.
Il piccolo viene quindi fissato utilizzando barre auricolari sulla piastra riscaldata collegata al manipolatore stereotassico. Per la manipolazione chirurgica e il monitoraggio della microiniezione, utilizziamo un microscopio binoculare. Per l'elettroporazione, utilizziamo l'elettrooperator CYV 21 in vivo con elettrodi a forma di pinzetta.
Per il recupero dei pulli. Dopo l'anestesia, si utilizza una camera riscaldata; di solito prepariamo 10 microlitri di soluzione di iniezione del plasmide in un tubo da 200 microlitri con pareti sottili. Questa soluzione è sufficiente per diversi esperimenti.
Mescoliamo otto microlitri di soluzione plasmidica con un microlitro di 10 XPBS e un microlitro di soluzione acquosa allo 0,1% di verde brillante. La concentrazione finale del plasmide nella soluzione di iniezione deve essere compresa tra uno e tre microgrammi per microlitro. L'uso di concentrazioni più basse di DNA plasmidico ridurrà l'efficienza di trasfezione, mentre concentrazioni più elevate di DNA risulteranno troppo viscose per essere iniettate attraverso la punta sottile della capillare di vetro.
Per la preparazione della pipetta di vetro, utilizziamo una capillare di vetro borosilicato con filamento e un tiratore verticale per elettrodi in vetro impostato ai massimi parametri di trazione e riscaldamento. Successivamente, rompiamo la punta della pipetta usando un pezzo di carta per ottenere una punta dal diametro compreso tra 10 e 20 micrometri. Verifichiamo la punta, il diametro e la forma mediante l'obiettivo del microscopio.
Utilizzando un capillare in polimero sottile, riempiamo circa un terzo del volume di una siringa Hamilton da 10 microlitri. Con olio minerale, ci assicuriamo di evitare bolle d'aria. Successivamente, riempiamo la pipetta di vetro con olio minerale e inseriamo la pipetta nella siringa Hamilton.
Di nuovo, evitando bolle d'aria. La siringa con pipetta di vetro viene quindi fissata su un microiniettore collegato a un controllore. L'allestimento per microiniezione, fissato su uno strumento stereotassico, ci permette di immergere in sicurezza la punta della pipetta di vetro nel tubo contenente la soluzione di iniezione del plasmide.
Quando la punta tocca la superficie della soluzione, la immergiamo ulteriormente di uno o due millimetri. Successivamente utilizziamo il controllore del microiniettore per riempire la pipetta con circa un microlitro della miscela di iniezione. Tutti gli esperimenti qui presentati sono eseguiti secondo i regolamenti dell'Università di Helsinki per gli esperimenti sugli animali.
Per ogni esperimento, riempiamo una siringa ermetica con isoflurano. Fissiamo la siringa sull'unità di anestesia collegata alla fonte di flusso d'aria, all'animale in movimento e alla maschera fissata sul supporto stereotassico. Sull'unità di anestesia, regoliamo il flusso d'aria a circa 250 millilitri al minuto e il livello di isoflurano al 4%. Introduciamo il gas rosso nella scatola dell'animale per due-cinque minuti.
Quando il P smette di muoversi, lo posizioniamo sul cuscinetto riscaldante collegato al sistema stereotassico. Posizioniamo la parte rostrale della testa del P nella maschera. Di solito occorrono da cinque a dieci minuti perché il cucciolo entri in anestesia profonda.
Una volta raggiunto questo risultato, riduciamo l'isoflurano nel flusso a circa 1,5-2%. Trattiamo la cute sulla testa del soggetto con etanolo al 70% utilizzando piccole forbici e pinze sottili. Incidiamo la cute dalla nuca del cucciolo fino alla fronte, spostiamo lateralmente i lembi di cute e inseriamo leggermente le barre auricolari nelle aperture orali del cranio per fissare testa e cute. Utilizzando un microscopio binoculare, localizziamo il punto bregmatico sul cranio per identificare la regione di interesse mediante coordinate stereotassiche, posizioniamo la pipetta di iniezione sopra questa regione e la marchiamo lasciando cadere da 25 a 50 nanolitri della soluzione di iniezione sulla superficie del cranio.
Praticare delicatamente e con attenzione un foro nel cranio nel punto segnato, utilizzando un trapano chirurgico ad alta velocità sotto il microscopio, fino a quando un liquido appare nella zona forata. Fissare le pinze per elettroporazione, con gli elettrodi ai lati del cranio. Applicare un gel conduttivo per ottenere una migliore conducibilità.
Rimuoviamo la goccia di liquido dall'area trapanata utilizzando un piccolo tampone e immergiamo l'ago di vetro nel foro. In base alle coordinate del sito di iniezione, infondiamo da 25 a cento nanolitri della soluzione di iniezione a una velocità compresa tra cinque e 20 nanolitri al secondo. Successivamente rimuoviamo rapidamente la pipetta e procediamo immediatamente con l'elettroporazione.
L'elettroporazione viene eseguita applicando cinque impulsi della durata di 50 millisecondi ciascuno, con un'ampiezza di 99 volt e una frequenza di un hertz. Rimuoviamo gli elettrodi e le barre auricolari. Suturiamo la cute incisa utilizzando una combinazione di pinze ottuse e appuntite e i fili chirurgici.
Abbiamo posizionato il cucciolo in una camera calda per 15-30 minuti per favorirne il recupero dopo l'anestesia. Successivamente abbiamo rimesso il cucciolo nella gabbia della madre. L'espressione del transgene nelle cellule transfettate con successo apparirà circa 10 ore dopo l'elettroporazione e rimarrà stabile per diverse settimane.
Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Arrivederci.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo non virale per consegnare costrutti genetici ad aree specifiche del cervello di roditori vivi mediante elettroporazione in vivo. Il metodo è efficiente e consente un rapido trasferimento genico al tessuto cerebrale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Consegna genica
- Tecniche di elettroporazione
Sfondo
- Il trasferimento genico nel cervello è fondamentale per lo studio della funzione genica.
- I metodi tradizionali possono essere invasivi e meno efficienti.
- L'elettroporazione in vivo fornisce un'alternativa non virale.
- Questo metodo può bersagliare efficacemente regioni cerebrali specifiche.
Scopo dello studio
- Presentare un metodo non virale per il trasferimento genico nei cervelli di roditori.
- Dimostrare l'efficienza dell'elettroporazione in vivo.
- Facilitare la ricerca sulla funzione genica e sugli studi neurologici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di plasmidi per il trasferimento genico.
- Realizzazione di micropipette per microiniezione.
- Intervento chirurgico su ratto neonati per un rilascio mirato.
- Applicazione dell'elettroporazione in vivo per migliorare l'assunzione genica.
Risultati principali
- Consegna efficace di costrutti genetici a zone cerebrali mirate.
- Elevata efficienza dimostrata del metodo di elettroporazione.
- Potenziali applicazioni nella terapia genica e nella ricerca neuroscientifica.
- Invasività ridotta rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo non virale è efficace per il trasferimento genico in vivo.
- L'elettroporazione in vivo è una tecnica promettente per la ricerca in neuroscienze.
- Questo approccio può migliorare gli studi sulla funzione genica nel cervello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il trasferimento mirato di geni nel tessuto cerebrale postnatale consente un'analisi funzionale dei circuiti neuronali senza compensazione nello sviluppo, sostenendo una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione del bersaglio. Questo approccio non virale offre un'alternativa scalabile ed economica ai modelli transgenici per i flussi di lavoro della scoperta precoce. Permette una valutazione rapida della funzione genica in sistemi rilevanti per la malattia, migliorando la capacità predittiva nell'identificazione dei candidati promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente un controllo spaziale e temporale dell'espressione genica per verificare ipotesi terapeutiche nel cervello postnatale.
- Valore operativo: Fornisce un metodo rapido ed economico per la validazione funzionale di bersagli senza modificazione della linea germinale.
- Valore predittivo: Riduce l'ambiguità meccanicistica limitando la trasfezione a regioni cerebrali definite, favorendo la selezione dei progetti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera un'efficienza di trasfezione quantitativamente valutabile mediante l'espressione di un marcatore fluorescente in fette cerebrali acute.
- Valore operativo: Standardizza i parametri di somministrazione (tensione, durata dell'impulso, volume) per ottenere letture riproducibili in esperimenti di elettrofisiologia o di imaging.
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening successivo di composti in colture neuronali o preparazioni di fette.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta modelli di malattia postnatale in cui la letalità dello sviluppo ostacola gli studi con knockout costitutivo.
- De-risking meccanicistico: Permette una modulazione genica dipendente dalla dose per valutare l'engagement del target e la modulazione del percorso.
- Allineamento preclinico: Consente l'immagine a due fotoni e l'elettrofisiologia per correlare la modulazione del target con fenotipi funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta (verifica dell'ipotesi sul bersaglio) e la validazione preclinica, permettendo una modulazione genica specifica per regione in sistemi cerebrali postnatali rilevanti per la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta l'indagine basata su ipotesi della funzione genica in circuiti neurali definiti, senza fattori confondenti legati allo sviluppo.
- Screening: Permette una valutazione standardizzata e quantitativa dell'espressione del transgene per la conferma dell'effetto di composti in sezioni cerebrali.
- Analisi: Fornisce letture fluorescenti ed elettrofisiologiche per quantificare la modulazione del bersaglio e l'attività del percorso metabolico.
- Ricerca traslazionale: Collega l'intervento molecolare a esiti funzionali in preparati di tessuto acuto, supportando una valutazione fenotipica allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la validazione iterativa di bersagli in diverse indicazioni neurologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nel bersaglio consentendo un trasferimento genico spaziotemporale preciso nel cervello postnatale.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso parametri standardizzati di elettroporazione e un flusso chirurgico sterile.
- Valore strategico: Riduce la dipendenza da modelli transgenici ad alto consumo di tempo, accelerando le decisioni di validazione del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio chiarificando il meccanismo del bersaglio in contesti neuronali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia neonatale su roditori, coordinamento stereotassico e tecniche microchirurgiche.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi microiniettori, elettroporatori con elettrodi sagomati e microscopi binoculari.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione del plasmide, del volume di iniezione e dei parametri degli impulsi tra diversi operatori e sedi sperimentali.
- L'adattamento ad altre regioni cerebrali o età postnatale richiede un'ottimizzazione empirica delle coordinate e dei parametri di somministrazione.
- I limiti pratici includono un'efficienza di trasfezione variabile in base alla qualità della punta della pipetta e all'integrità del tessuto durante l'intervento chirurgico.
