L'uso di diacetato Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) per monitorare la proliferazione dei linfociti
October 12th, 2010
CFSE etichette covalentemente molecole intracellulari di lunga durata con il colorante fluorescente, carboxyfluorescein. Come tale, quando una cellula si divide CFSE marcato, la sua progenie sono la metà della quantità di fluorescenza, che può così essere utilizzato per valutare la divisione cellulare. In questo articolo vengono descritte le procedure normalmente utilizzate per l'etichettatura dei linfociti mouse con CFSE.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di marcare i linfociti con il colorante fluorescente intracellulare, CFSE, in modo che i linfociti possano essere monitorati per la divisione cellulare mediante citometria a flusso. Ciò si ottiene mescolando i linfociti con CFDA se, che è la forma diacetile di CFSE. I due gruppi acetilici consentono al colorante di entrare rapidamente nelle cellule all'interno dei linfociti.
Le esterasi rimuovono i gruppi acetilici dal C-F-D-A-S-E, formando la forma CFSE del colorante. Senza i gruppi acetilici, il CFSE diventa fluorescente ed è anche meno permeante alla membrana, concentrando così il colorante all'interno delle cellule. La catena laterale amminoreattiva dell'AL della CFSE accoppia quindi in modo covalente il colorante alle proteine intracellulari, rendendo così le cellule quasi permanentemente fluorescenti.
La CFSE può essere utilizzata per monitorare la divisione dei linfociti in base all'intensità di fluorescenza sequenziale delle cellule figlie. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione della timidina triziata, è che le singole cellule possono essere monitorate per la divisione cellulare. A dimostrare la procedura sarà Ben Qua, un ricercatore del mio laboratorio per marcare le cellule.
Iniziare con linfociti appena isolati dalla milza o dai linfonodi dei topi e aggiungere una concentrazione compresa tra mezzo e 10 milioni di cellule per millilitro di terreno di coltura, integrato con il 5% di calore. Il siero fetale di vitello inattivato risospende accuratamente le cellule e trasferisce con cura un millilitro sul fondo di un tubo conico fresco da 10 millilitri. Posare il tubo orizzontalmente con cura.
Aggiungere 110 microlitri di PBS sulla parte superiore della provetta nella parte non bagnata della plastica, assicurandosi che non entri in contatto con la soluzione cellulare. Aggiungere una soluzione colorante fresca di 1,1 microlitri del c.d.a-s-e a 110 microlitri di PBS. Tappare rapidamente il tubo e capovolgere e vorticare bene per ottenere una miscelazione rapida e uniforme delle soluzioni poiché il colorante diventa fluorescente e quindi soggetto a sbiancamento.
Proteggere il tubo dalla luce coprendo il tubo con un foglio di alluminio. Incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente, diluirle in 10 volumi di 20 gradi Celsius, PBS contenente il 5% di H-I-F-C-S, sedimentare mediante centrifugazione a 300 Gs per cinque minuti a 20 gradi Celsius e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio altre due volte.
Le cellule possono quindi essere applicate a un protocollo di interesse per l'induzione della divisione cellulare. Le cellule marcate possono essere utilizzate sia in vitro che in vivo. Al termine del saggio di proliferazione, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso.
In questo esempio, la marcatura CFSE viene utilizzata in vitro per misurare il modo in cui le cellule T di topi transgenici geneticamente modificati rispondono alle cellule dendritiche pulsate con diverse concentrazioni di antigene. I picchi di diluizione CFSE non ombreggiati raffigurano otto cellule T transgeniche CD positive che si sono divise da una a tre volte. Si può vedere che più cellule T si dividono alle concentrazioni più elevate dell'antigene.
Il metodo di marcatura CFSE è anche suscettibile di saggi in vivo come gli esperimenti di trasferimento adottivo. Qui il fax viene utilizzato per identificare la popolazione di cellule T che sono di interesse nei topi riceventi. Un successivo profilo di proliferazione di CFSE mostra otto cellule T positive di CD che si sono divise da una a sei volte in base ai picchi di diluizione di CFSE dopo il suo sviluppo.
Questa procedura ha aperto la strada ai ricercatori e all'immunologia per esplorare la proliferazione dei linfociti durante una risposta immunitaria.
Panoramica
Questo articolo descrive la procedura per l'etichettatura dei linfociti del topo con il colorante fluorescente CFSE, consentendo il monitoraggio della divisione cellulare mediante citometria a flusso. Il metodo consente ai ricercatori di tracciare la proliferazione dei linfociti durante le risposte immunitarie.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Citometria a flusso
Sfondo
- CFSE è un colorante fluorescente utilizzato per etichettare proteine intracellulari.
- Permette la valutazione della divisione cellulare misurando la diluizione della fluorescenza nelle cellule figlie.
- Questa tecnica offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali come l'incorporazione di timidina triziata.
- L'etichettatura CFSE può essere applicata sia in saggi in vitro che in vivo.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare la tecnica di etichettatura CFSE per il monitoraggio della divisione dei linfociti.
- Fornire un protocollo dettagliato da seguire per i ricercatori.
- Evidenziare l'applicazione di CFSE nello studio delle risposte dei linfociti T agli antigeni.
Metodi utilizzati
- Isolamento dei linfociti dalla milza del topo o dai linfonodi.
- Miscela di linfociti con CFDA SE per facilitare l'ingresso del colorante.
- Incubazione e lavaggio delle cellule per rimuovere il colorante in eccesso.
- Analisi mediante citometria a flusso per valutare la divisione cellulare basata sulla diluizione di CFSE.
Risultati principali
- L'etichettatura CFSE consente il monitoraggio della divisione dei linfociti T in risposta a diverse concentrazioni di antigene.
- La citometria a flusso rivela picchi distinti corrispondenti a diversi livelli di divisione dei linfociti T.
- Il metodo è efficace sia per applicazioni in vitro che in vivo.
- I risultati dimostrano l'utilità di CFSE nella ricerca immunologica.
Conclusioni
- L'etichettatura CFSE è un metodo affidabile per studiare la proliferazione dei linfociti.
- Questa tecnica migliora la comprensione delle risposte immunitarie.
- I ricercatori possono utilizzare questo metodo per vari progetti sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
