Name: Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Impara a preparare colture neuronali primarie da embrioni di Drosophila allo stadio di midgastrula. Questo metodo consente di studiare l'eccitabilità elettrica e la trasmissione sinaptica in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS27501 a DKOD. Supporto aggiuntivo per questo lavoro da un HHMI professor Grant a DKOD.

I. Drosophila di raccolta degli embrioni <ol><li> Preparare piatti raccolta delle uova <ol><li> Fate bollire 200 ml di dH 2 O con 8 g di agar </li><li> Raffreddare a 50 ° C </li><li> Aggiungere 2 ml di EtOH e 2 ml di acido acetico </li><li> Versare in 35 piatti di plastica millimetri Petri, top </li><li> Raffreddare e conservare in un contenitore a tenuta d&#39;aria a 4 ° C </li><li> Fa circa 80 tavole </li></ol></li><li> Preparare pasta lievito <ol><li> Sciogliere il lievito attivo Fleishmans cottura in acqua per pasta </li><li> Microonde per 20-30 secondi per uccidere i lieviti (attenzione ai bollente) </li><li> Conservare in siringa da 10 cc (senza ago) a 4 ° C per 2 settimane </li></ol></li><li> Mosche: Gli adulti utilizzati per la raccolta delle uova sono generalmente più produttivi tra i 3 ei 14 giorni dopo emergenti, a condizione che essi hanno avuto accesso a cibi freschi. Molti stock mutante hanno ridotto la fertilità che può manifestarsi in un tasso ridotto di deposizione delle uova e un cambiamento l&#39;età in cui sono più produttivi. In generale, diverse centinaia di adulti fanno per una buona deposizione delle uova della popolazione. </li><li> Procedimento: Stendere uno strato sottile di lievito pasta su una piastra di raccolta delle uova. Ciò fornisce un substrato favorevole per la posa delle uova. Adulti trasferimento vola una bottiglia pulita raccolta delle uova e nastro il piatto delle offerte alla bocca della bottiglia. Non lasciare le mosche in queste bottiglie più di 3-4 ore, come l&#39;umidità aumenta e le mosche si blocca in pasta e sui lati della bottiglia. </li></ol> II. Dechorionation embrione con candeggina <ol><li> Impostare un imbuto Buchner collegato ad un pallone filtrante collegato ad un aspiratore. Mettete un pezzo di carta Whatman n. 1 nell&#39;imbuto. Con aspirazione in funzione, bagnare la carta con acqua distillata sterile. </li><li> Sciacquare embrioni dalle piastre di raccolta sulla carta da filtro con un flusso di acqua da una bottiglia di lavaggio. </li><li> Sciacquare in diversi volumi di acqua sterile, spegnere aspiratore, e quindi aggiungere un volume imbuto del 50% di candeggina. Lasciate stare le uova 5-10 minuti. Il chorions sarà sciolto in 1-2 minuti, ma il più a lungo si lasciano gli embrioni in candeggina più del lievito contaminante verranno distrutti. Scegliere qualsiasi adulti o delle larve che hanno sciacquato piatto. </li><li> Sciacquare gli embrioni in una piastra di Petri sterile (NON coltura tissutale) con acqua distillata sterile. Molti degli embrioni che si attacchi al fondo del piatto se non è stato pre-bagnata. Sciacquare più volte con acqua sterile in questo piatto. </li><li> Esaminare gli embrioni a luce trasmessa di cogliere metà gastrula embrioni palco. </li></ol> III. Preparazione delle colture singolo embrione <ol><li> Fai DDM1 (vedi le ricette nella sezione IV) </li><li> Versare l&#39;acqua al largo piatto di embrioni appena prima di coltura. Coprire gli embrioni con i media sterile. </li><li> Di cui 3, 35 mm piastre Petri. Mettere in 4 coprioggetto autoclave tondo in ogni piatto. Su ogni vetrino, mettere 5 ml di mezzo. Usa Bellco coprioggetto-bassa coverlips vetro al piombo. Bellco biologica Vetro 800-257-7043 Cat # 1943-00012 </li><li> Tirare qualche pipette abbastanza bene. Le pipette da noi utilizzati sono tirato su un PP-83 estrattore Narishige. Le dimensioni esatte della pipetta non sono cruciali e noi di solito li tira più fine che vogliamo e li rompere la punta nello stesso campo di vista come l&#39;embrione per misurare le dimensioni. Se non si desidera per aspirare tutti gli embrioni in una volta sola, e il vostro non vogliono la punta così piccolo che ci vogliono 5 minuti per aspirare le cellule. Puntare ad una via di mezzo. Esaminare gli embrioni a luce trasmessa e utilizzare un tubo di aspirazione collegato alla bocca la pipetta per rimuovere il contenuto dell &#39;embrione. Disperdere le cellule sul vetrino preparato con delicatezza espellere le cellule più vicino possibile al coprioggetto possibile. Si consiglia di esaminare i vetrini a più alto potere e disperdere ulteriormente le cellule nello stesso modo. </li><li> Lasciate che le cellule sedersi per non più di 10 minuti. Inondare il piatto con i media e messo in incubatrice, 4-5% CO 2 ambiente, se si utilizza un terreno specifico. Temperatura tra 22-24 ° C. Noi abitualmente uso 23 ° C e 95% di umidità. L&#39;umidità è importante, come si vuole evitare l&#39;evaporazione. È possibile utilizzare uno standard di incubatore di mammifero posto in un frigorifere con controllo della temperatura impostata a 23 ° C. </li></ol> IV. DDM1 un terreno specifico per la coltivazione delle culture <ol><li> Fai DMEM: A 100 ml di Ham F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Aggiungere 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di L-Glutammina 200 mm (Irvine Scientific # 9317). Mix. </li><li> Filtro in cappa con filtro 0,2 micron siringa acetato (bisogno di 2 filtri). </li><li> Il pH è 6.64 e Osm 288. </li><li> Fai aliquote di 10 ml in provette da 15 ml. </li><li> Conservare a 4 ° C per non più di 2 settimane. Nota: utilizzare sempre in autoclave acqua filtrata e fare in contenitori che sono riservati per i Media e supplementi solo. Non mettere mai un elettrodo pH o mescolate a barre utilizzati per altri scopi in Media.To fare DDM1: integratori Aggiungi elencati di seguitodi DMEM appena prima coltura. </li></ol></li><li> A 10 ml di DMEM aggiungere: <ul><li> 100 ul transferrina </li><li> Putrescine 100 microlitri </li><li> Selenio 100 microlitri </li><li> Progesterone 100 microlitri </li><li> 50 microlitri insulina </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

Nelle culture Drosophila preparati da embrioni fase midgastrula i neuroni derivano da precursori neuroblasti, molte delle quali dividono prima differenziazione in vitro. Questo sistema offre così un&#39;occasione unica per esplorare i fattori genetici e ambientali importanti in fasi molto precoci dello sviluppo neuronale (Rohrbaugh et al., 2003). Abbiamo dimostrato che i neuroni coltivati ​​in un mezzo semplice definito differenziarsi in neuroni elettricamente eccitabili, che formano anche funzionale connessioni sinaptiche (O Dowd, 1995; Le...

Le culture fatte in questo mezzo deve essere mantenuta in un 5% di CO2 incubatore a circa 22-24 ° C. Noi usiamo una cultura standard di tessuti di mammiferi incubatore posto in una stanza fredda e riscaldata a 23 ° C. Sempre usato in autoclave acqua filtrata e fare in contenitori che sono riservati per i media e gli integratori solo. Non mettere mai un pHmetro o mescolate a barre utilizzati per altri scopi nei media.

preparazione delle culture neuronale da midgastrula fase embrioni di drosophila

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Questo video illustra la procedura per le colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. I metodi per la raccolta di embrioni e la loro dechorionation con candeggina sono dimostrati. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad un tubo di aspirazione bocca, ci illustrano la rimozione di tutte le cellule da embrioni singolo. Il metodo per disperdere le cellule di ogni embyro in una piccola (5 l) goccia di media su un vetrino di vetro non rivestito è dimostrata. Una vista attraverso il microscopio a 1 ora dopo placcatura illustra la densità delle cellule preferito. La maggior parte delle cellule che sopravvivono quando coltivate in un terreno specifico sono neuroblasti che dividono una o più volte nella cultura prima di estendere i processi neuritiche da 12-24 ore. Una vista attraverso il microscopio illustra il livello di crescita dei neuriti e la ramificazione prevista una sana cultura a 2 giorni in vitro. Le culture sono cresciute in una semplice base di bicarbonato un terreno specifico, in un 5% di CO 2 incubatore a 22-24 ° C. Processi neuritiche continuare a elaborare oltre la prima settimana di cultura e quando entrare in contatto con neuriti da cellule vicine spesso forma funzionale connessioni sinaptiche. I neuroni in queste culture, si manifestano voltaggio-dipendenti di sodio, calcio e canali del potassio e sono elettricamente eccitabili. Questo sistema di coltura è utile per lo studio molecolare dei fattori genetici e ambientali che regolano il differenziamento neuronale, eccitabilità, e formazione di sinapsi / funzione.

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Questo video illustra la procedura per la preparazione di colture neuronali primarie a partire da embrioni di Drosophila allo stadio di metà gastrula. I metodi per la raccolta degli embrioni ...

Il mio nome è Diana Dowd e sono professoressa presso il dipartimento di Biologia dello sviluppo e Cellulare e di Anatomia e Neurobiologia all'uc Irvine. Oggi dimostrerò la preparazione di colture neuronali primarie da embrioni di drosophila. Questo procedimento consiste nel rimuovere tutte le cellule da un embrione di drosophila in fase di gastrulazione media e nel coltivarle in vitro.E ciò per cui utilizziamo queste colture è comprendere veramente quali sono i geni e i fattori ambientali importanti per la regolazione dell'eccitabilità elettrica e della trasmissione sinaptica tra i neuroni di drosophila. Per iniziare questa procedura, dobbiamo raccogliere gli embrioni di drosophila. Per farlo, prendiamo delle piastre per la raccolta delle uova e vi spalmiamo un po' di pasta di lievito.È un substrato favorevole per le mosche adulte per deporre le uova. Posizioniamo queste piastre su bottiglie contenenti una popolazione di mosche adulte, solitamente da cento a 200 mosche. Successivamente lasciamo che le mosche adulte depongano le uova per circa due o tre ore.Quindi rimuoviamo le piastre di raccolta delle uova, e questi sono gli embrioni che utilizziamo per la procedura di coltura. Il

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Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l'imaging di livelli di calcio con Fura-2.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule primarie dissociata...

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Questo video delinea un metodo per coltivare neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo. Il processo include il trattamento del mesencefalo con un enzima proteolitico, il distacco delle cellule e la loro coltura su vetrini coprioggetti rivestiti di polimero in un mezzo ricco di sostanze nutritive con antibiotici per la loro crescita e vitalità a lungo termine.

Coltura e mantenimento di neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo

Questo video dimostra un protocollo per identificare i fattori esogeni che avviano la riattivazione delle cellule staminali neurali cerebrali di Drosophila dal loro stato quiescente. Le larve appena nate vengono sezionate per isolare il loro cervello, che viene poi coltivato in terreni con o senza un ormone di prova per valutare il potenziale dell'ormone di indurre la riattivazione e la proliferazione delle cellule staminali neurali.

Analisi della riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Fonte: Jeong, S. Visualizzazione del modello di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra la visualizzazione delle proiezioni assonali negli embrioni  Drosophila. L'immunomarcatura dei motoneuroni, la dissezione precisa per esporre le strutture neuronali e la microscopia a contrasto interferenale-differenziale rivelano collettivamente un'architettura neuronale dettagliata, enfatizzando i modelli di proiezione assonale.

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Cellule di Drosophila S2 e neuroni in coltura sono grandi sistemi per l'imaging dei trasporti organello motorizzata in vivo. Qui si descrive protocolli dettagliati per la coltura di entrambi i tipi di cellule, la loro rappresentazione e analisi di trasporto.

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Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

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È stato stabilito un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Utilizzando questo metodo, il ruolo dei segnali sistemici può essere disaccoppiato dai segnali intrinseci del tessuto nella regolazione della quiescenza, dell'ingresso e dell'uscita delle cellule staminali neurali.

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