Name: Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Impara a preparare colture neuronali primarie da embrioni di Drosophila allo stadio di midgastrula. Questo metodo consente di studiare l'eccitabilità elettrica e la trasmissione sinaptica in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS27501 a DKOD. Supporto aggiuntivo per questo lavoro da un HHMI professor Grant a DKOD.

I. Drosophila di raccolta degli embrioni <ol><li> Preparare piatti raccolta delle uova <ol><li> Fate bollire 200 ml di dH 2 O con 8 g di agar </li><li> Raffreddare a 50 ° C </li><li> Aggiungere 2 ml di EtOH e 2 ml di acido acetico </li><li> Versare in 35 piatti di plastica millimetri Petri, top </li><li> Raffreddare e conservare in un contenitore a tenuta d&#39;aria a 4 ° C </li><li> Fa circa 80 tavole </li></ol></li><li> Preparare pasta lievito <ol><li> Sciogliere il lievito attivo Fleishmans cottura in acqua per pasta </li><li> Microonde per 20-30 secondi per uccidere i lieviti (attenzione ai bollente) </li><li> Conservare in siringa da 10 cc (senza ago) a 4 ° C per 2 settimane </li></ol></li><li> Mosche: Gli adulti utilizzati per la raccolta delle uova sono generalmente più produttivi tra i 3 ei 14 giorni dopo emergenti, a condizione che essi hanno avuto accesso a cibi freschi. Molti stock mutante hanno ridotto la fertilità che può manifestarsi in un tasso ridotto di deposizione delle uova e un cambiamento l&#39;età in cui sono più produttivi. In generale, diverse centinaia di adulti fanno per una buona deposizione delle uova della popolazione. </li><li> Procedimento: Stendere uno strato sottile di lievito pasta su una piastra di raccolta delle uova. Ciò fornisce un substrato favorevole per la posa delle uova. Adulti trasferimento vola una bottiglia pulita raccolta delle uova e nastro il piatto delle offerte alla bocca della bottiglia. Non lasciare le mosche in queste bottiglie più di 3-4 ore, come l&#39;umidità aumenta e le mosche si blocca in pasta e sui lati della bottiglia. </li></ol> II. Dechorionation embrione con candeggina <ol><li> Impostare un imbuto Buchner collegato ad un pallone filtrante collegato ad un aspiratore. Mettete un pezzo di carta Whatman n. 1 nell&#39;imbuto. Con aspirazione in funzione, bagnare la carta con acqua distillata sterile. </li><li> Sciacquare embrioni dalle piastre di raccolta sulla carta da filtro con un flusso di acqua da una bottiglia di lavaggio. </li><li> Sciacquare in diversi volumi di acqua sterile, spegnere aspiratore, e quindi aggiungere un volume imbuto del 50% di candeggina. Lasciate stare le uova 5-10 minuti. Il chorions sarà sciolto in 1-2 minuti, ma il più a lungo si lasciano gli embrioni in candeggina più del lievito contaminante verranno distrutti. Scegliere qualsiasi adulti o delle larve che hanno sciacquato piatto. </li><li> Sciacquare gli embrioni in una piastra di Petri sterile (NON coltura tissutale) con acqua distillata sterile. Molti degli embrioni che si attacchi al fondo del piatto se non è stato pre-bagnata. Sciacquare più volte con acqua sterile in questo piatto. </li><li> Esaminare gli embrioni a luce trasmessa di cogliere metà gastrula embrioni palco. </li></ol> III. Preparazione delle colture singolo embrione <ol><li> Fai DDM1 (vedi le ricette nella sezione IV) </li><li> Versare l&#39;acqua al largo piatto di embrioni appena prima di coltura. Coprire gli embrioni con i media sterile. </li><li> Di cui 3, 35 mm piastre Petri. Mettere in 4 coprioggetto autoclave tondo in ogni piatto. Su ogni vetrino, mettere 5 ml di mezzo. Usa Bellco coprioggetto-bassa coverlips vetro al piombo. Bellco biologica Vetro 800-257-7043 Cat # 1943-00012 </li><li> Tirare qualche pipette abbastanza bene. Le pipette da noi utilizzati sono tirato su un PP-83 estrattore Narishige. Le dimensioni esatte della pipetta non sono cruciali e noi di solito li tira più fine che vogliamo e li rompere la punta nello stesso campo di vista come l&#39;embrione per misurare le dimensioni. Se non si desidera per aspirare tutti gli embrioni in una volta sola, e il vostro non vogliono la punta così piccolo che ci vogliono 5 minuti per aspirare le cellule. Puntare ad una via di mezzo. Esaminare gli embrioni a luce trasmessa e utilizzare un tubo di aspirazione collegato alla bocca la pipetta per rimuovere il contenuto dell &#39;embrione. Disperdere le cellule sul vetrino preparato con delicatezza espellere le cellule più vicino possibile al coprioggetto possibile. Si consiglia di esaminare i vetrini a più alto potere e disperdere ulteriormente le cellule nello stesso modo. </li><li> Lasciate che le cellule sedersi per non più di 10 minuti. Inondare il piatto con i media e messo in incubatrice, 4-5% CO 2 ambiente, se si utilizza un terreno specifico. Temperatura tra 22-24 ° C. Noi abitualmente uso 23 ° C e 95% di umidità. L&#39;umidità è importante, come si vuole evitare l&#39;evaporazione. È possibile utilizzare uno standard di incubatore di mammifero posto in un frigorifere con controllo della temperatura impostata a 23 ° C. </li></ol> IV. DDM1 un terreno specifico per la coltivazione delle culture <ol><li> Fai DMEM: A 100 ml di Ham F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Aggiungere 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di L-Glutammina 200 mm (Irvine Scientific # 9317). Mix. </li><li> Filtro in cappa con filtro 0,2 micron siringa acetato (bisogno di 2 filtri). </li><li> Il pH è 6.64 e Osm 288. </li><li> Fai aliquote di 10 ml in provette da 15 ml. </li><li> Conservare a 4 ° C per non più di 2 settimane. Nota: utilizzare sempre in autoclave acqua filtrata e fare in contenitori che sono riservati per i Media e supplementi solo. Non mettere mai un elettrodo pH o mescolate a barre utilizzati per altri scopi in Media.To fare DDM1: integratori Aggiungi elencati di seguitodi DMEM appena prima coltura. </li></ol></li><li> A 10 ml di DMEM aggiungere: <ul><li> 100 ul transferrina </li><li> Putrescine 100 microlitri </li><li> Selenio 100 microlitri </li><li> Progesterone 100 microlitri </li><li> 50 microlitri insulina </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

Nelle culture Drosophila preparati da embrioni fase midgastrula i neuroni derivano da precursori neuroblasti, molte delle quali dividono prima differenziazione in vitro. Questo sistema offre così un&#39;occasione unica per esplorare i fattori genetici e ambientali importanti in fasi molto precoci dello sviluppo neuronale (Rohrbaugh et al., 2003). Abbiamo dimostrato che i neuroni coltivati ​​in un mezzo semplice definito differenziarsi in neuroni elettricamente eccitabili, che formano anche funzionale connessioni sinaptiche (O Dowd, 1995; Le...

Le culture fatte in questo mezzo deve essere mantenuta in un 5% di CO2 incubatore a circa 22-24 ° C. Noi usiamo una cultura standard di tessuti di mammiferi incubatore posto in una stanza fredda e riscaldata a 23 ° C. Sempre usato in autoclave acqua filtrata e fare in contenitori che sono riservati per i media e gli integratori solo. Non mettere mai un pHmetro o mescolate a barre utilizzati per altri scopi nei media.

preparazione delle culture neuronale da midgastrula fase embrioni di drosophila

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Questo video illustra la procedura per le colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. I metodi per la raccolta di embrioni e la loro dechorionation con candeggina sono dimostrati. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad un tubo di aspirazione bocca, ci illustrano la rimozione di tutte le cellule da embrioni singolo. Il metodo per disperdere le cellule di ogni embyro in una piccola (5 l) goccia di media su un vetrino di vetro non rivestito è dimostrata. Una vista attraverso il microscopio a 1 ora dopo placcatura illustra la densità delle cellule preferito. La maggior parte delle cellule che sopravvivono quando coltivate in un terreno specifico sono neuroblasti che dividono una o più volte nella cultura prima di estendere i processi neuritiche da 12-24 ore. Una vista attraverso il microscopio illustra il livello di crescita dei neuriti e la ramificazione prevista una sana cultura a 2 giorni in vitro. Le culture sono cresciute in una semplice base di bicarbonato un terreno specifico, in un 5% di CO 2 incubatore a 22-24 ° C. Processi neuritiche continuare a elaborare oltre la prima settimana di cultura e quando entrare in contatto con neuriti da cellule vicine spesso forma funzionale connessioni sinaptiche. I neuroni in queste culture, si manifestano voltaggio-dipendenti di sodio, calcio e canali del potassio e sono elettricamente eccitabili. Questo sistema di coltura è utile per lo studio molecolare dei fattori genetici e ambientali che regolano il differenziamento neuronale, eccitabilità, e formazione di sinapsi / funzione.

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Questo video illustra la procedura per la preparazione di colture neuronali primarie a partire da embrioni di Drosophila allo stadio di metà gastrula. I metodi per la raccolta degli embrioni ...

Il mio nome è Diana Dowd e sono professoressa presso il dipartimento di Biologia dello sviluppo e Cellulare e di Anatomia e Neurobiologia all'uc Irvine. Oggi dimostrerò la preparazione di colture neuronali primarie da embrioni di drosophila. Questo procedimento consiste nel rimuovere tutte le cellule da un embrione di drosophila in fase di gastrulazione media e nel coltivarle in vitro.E ciò per cui utilizziamo queste colture è comprendere veramente quali sono i geni e i fattori ambientali importanti per la regolazione dell'eccitabilità elettrica e della trasmissione sinaptica tra i neuroni di drosophila. Per iniziare questa procedura, dobbiamo raccogliere gli embrioni di drosophila. Per farlo, prendiamo delle piastre per la raccolta delle uova e vi spalmiamo un po' di pasta di lievito.È un substrato favorevole per le mosche adulte per deporre le uova. Posizioniamo queste piastre su bottiglie contenenti una popolazione di mosche adulte, solitamente da cento a 200 mosche. Successivamente lasciamo che le mosche adulte depongano le uova per circa due o tre ore.Quindi rimuoviamo le piastre di raccolta delle uova, e questi sono gli embrioni che utilizziamo per la procedura di coltura. Il passo successivo della procedura consiste nel decorticare gli embrioni, il che significa rimuovere effettivamente il corione. Questo viene fatto lavando gli embrioni in un imbuto di Büchner su cui è posizionato un pezzo di carta filtrante, in modo da trattenere gli embrioni.Li lasciamo riposare nel beccuccio di Buchner in una soluzione di candeggina al 50%. Questa soluzione al 50% di candeggina dissolve non solo il corione, ma serve anche come parte del nostro procedimento di sterilizzazione. Eseguiamo effettivamente questo procedimento al di fuori della cappa, quindi, una volta dechlorinati, i campioni vengono lavati in una piastra di Petri.In realtà, quando il Corian è rimosso, la membrana vitellina è piuttosto appiccicosa e aderirà bene a una piastra di Petri. È quindi possibile versare acqua distillata al di sopra e rimuovere l'acqua distillata due o tre volte, gettando semplicemente via l'acqua; in questo modo gli embrioni aderiranno alla piastra di Petri. Non utilizzare una piastra di plastica per colture cellulari.Non si attengono a ciò. Iniziamo la parte sterile della procedura prelevando le piastre di Petri contenenti gli embrioni e portandole all'interno di una cappa a flusso laminare. Queste sono lamelle coprioggetto Bellco.Sono non rivestiti, ma sono stati sottoposti ad autoclave e non sono stati lavati. Riscontriamo che non funzionano molto bene. Quando vengono lavati, di solito preleviamo quattro copriletti e li poniamo in una singola piastra di Petri.Quindi prepareremo quattro colture embrionali in ogni piastra di Petri. Ok, questa piastra è fondamentalmente pronta per iniziare la coltura, e di solito ne preparo 12, da 12 a 16 per volta. Ok? Il mezzo di coltura che utilizziamo è un mezzo definito relativamente semplice.È un mezzo liquido A-D-M-E-M, che prepariamo ogni due settimane, in modo che rimanga utilizzabile per due settimane se conservato in frigorifero. Il mezzo è stato sterilizzato mediante filtrazione attraverso un filtro sterile da 0,2 micron, a cui successivamente aggiungiamo cinque integratori.Vengono preparati una volta ogni due mesi e poi congelati in aliquote che vengono aggiunte a 10 ml del mezzo liquido. Quindi rimuoviamo semplicemente il contenuto. Ultimo passaggio, poi si tratta semplicemente di capovolgere delicatamente questo mezzo per mescolarlo e siamo pronti a procedere. Okay.Tutto è predisposto. Ho la mia piastra di coltura pronta, oppure la mia piastra di Petri contenente quattro lamelle già posizionate e pronte all'uso. Ora prenderò la mia piastra con gli embrioni, che al momento sono immersi in acqua distillata.Eliminerò l'acqua distillata semplicemente scuotendola via. Lo faccio direttamente sopra il cestino della spazzatura. Ora verserò circa due millilitri del mezzo su questi embrioni, che a questo punto sono pronti perché io possa inserire l'ago di vetro in ciascun embrione ed estrarne il contenuto.È necessario avere il mezzo all'esterno. Ovviamente, se ci fosse acqua all'esterno, si verificherebbe uno shock osmotico. Ora, per prepararsi effettivamente a preparare le colture subito prima di rimuovere il contenuto dell'embrione, pongo effettivamente una goccia di cinque microlitri sui coverslip.Se si lascia troppo a lungo, il pH del mezzo cambia. Ora metterò una goccia di cinque microlitri al centro di ognuno dei quattro vetrini. È effettivamente importante che queste gocce rimangano il più integre possibile.Se il mezzo si diffonde su tutta la lamellina, allora le cellule vengono seminate in uno strato molto sottile di liquido, il che è difficoltoso. È preferibile seminare le cellule in una bella goccia rotonda di liquido. Come si può vedere qui, abbiamo quattro belle gocce rotonde di liquido pronte all'uso.Ora prenderò una delle pipette che ho preparato e la monterò semplicemente su questo tubo per pipetta orale. È possibile utilizzare qualsiasi tubo, ma il vantaggio di questo è che è fornito insieme a pipette graduate VWR da 100 microlitri. All'interno di questi tubi c'è una piccola guarnizione di gomma.Posso inserire il pipettatore a bocca, cioè la pipetta di vetro, in questa estremità del pipettatore. E quando aspirerò il contenuto dell'embrione, non andrò oltre questa zona, dove inizia il restringimento. Quindi esiste una vasta area che separa la mia aspirazione mediante pipetta qui sopra dalla zona in cui si trovano le cellule.Quindi non c'è, non ci sono problemi di contaminazione. Se accidentalmente aspirate il contenuto in questa zona, avrete grossissimi problemi di contaminazione. Nei nostri armadi a flusso laminare, abbiamo microscopi stereoscopici montati su basi articolate.Questo permette alla luce di entrare da sotto l'embrione, consentendoci di visualizzare effettivamente la solco cefalico, l'intestino medio e le immaginini che osserveremo esaminando gli embrioni reali. È in questo modo che identifichiamo lo stadio dell'embrione importante per la coltura, al fine di rimuoverne il contenuto. Utilizziamo pipette di vetro, tirate con un normale estrattore di microelettrodi, lo stesso che usiamo per produrre le pipette per le registrazioni in patch.Non ci importa realmente quali siano le impostazioni. Otteniamo pipette abbastanza sottili perché andremo a spezzare la pipetta nella piastra accanto all'embrione alla dimensione desiderata. Prendiamo quindi queste pipette di vetro, le inseriamo attraverso la membrana vellosa dell'embrione e utilizziamo un tubo per aspirazione orale collegato alla parte posteriore della pipetta.Estraiamo quindi il contenuto dell'intero embrione. Successivamente spostiamo la pipetta, la rimuoviamo e la trasferiamo in un altro piatto che contiene un'ampolla con una goccia di mezzo di cinque microlitri. E quindi espelliamo il contenuto dell'embrione all'interno di questa goccia di cinque microlitri.Abbiamo pipettato su e gi&ugrave; diverse volte per disperdere le cellule, quindi abbiamo lasciato riposare il coverslip nella piastra per circa 10 minuti prima di aggiungere due millilitri di mezzo. Le piastre con le cellule, dopo essere state seminate, vengono collocate in un incubatore con 5%CO2. Questo &egrave; molto importante perch&eacute; il mezzo che utilizziamo &egrave; un mezzo tamponato al bicarbonato.Abbiamo alcuni HEP all'interno, ma non sono sufficienti per tamponare in un ambiente aerobico. Pertanto, è necessario utilizzare un incubatore con 5% di CO2. Tuttavia, la temperatura deve essere relativamente bassa, intorno a 22-23 gradi, che risulta ideale.Prendiamo quindi un normale incubatore a CO2 che verrebbe utilizzato per colture di mammiferi e lo riscaldiamo a 37 gradi. Quello che facciamo è spegnere il riscaldamento, lasciandolo in laboratorio, e inseriamo del ghiaccio nella parte inferiore dell'incubatore, mantenendo così la temperatura tra 21 e 25 gradi. L'altra tecnica che utilizziamo consiste nel prendere nuovamente uno di questi comuni incubatori riscaldati a CO2 e posizionarlo all'interno di una stanza fredda.Successivamente, è possibile riscaldare in modo piuttosto efficace l'incubatore a 23 gradi, qualora la temperatura ambiente corrisponda a quella di una stanza fredda. Questi sono dunque i due metodi che utilizziamo per ottenere un sigillo standard, un sigillo mammifero-incubatore, che permette alle cellule di sopravvivere. Bene, questa è una coltura che è stata seminata un'ora fa, alla stessa ingrandimento con cui l'abbiamo osservata subito dopo la semina, un'ora dopo il trapianto.Qui osserviamo neuroni che si sono differenziati da circa due giorni. In coltura, il neuroblasto si è diviso una o più volte e successivamente ha generato neuroni, i quali estendono prolungamenti che formano vaste reti neurali sovrapposte. Qui abbiamo due corpi cellulari disposti testa a testa.La cellula superiore sta estendendo un processo alle 11, mentre quella inferiore sta estendendo un processo alle 5. Queste sono le loro estensioni principali. Si possono poi osservare la formazione di rami più fini.Queste aderiscono molto strettamente al substrato di vetro, e si possono osservare processi provenienti da altre cellule che si sovrappongono a queste. Questi rappresentano siti di potenziali connessioni sinaptiche. Si eseguirebbe il patching di una di queste cellule, e in generale, con questo grado di elaborazione dei processi, esse presenterebbero correnti sinaptiche funzionali.Ora le nostre cellule crescono in coltura per 12 ore dopo il seeding. Avranno sviluppato processi abbastanza ben definiti. Per la nostra fisiologia standard, iniziamo le registrazioni circa una o due ore dopo la coltivazione.E si può osservare che effettivamente continuano a sviluppare prolungamenti nei successivi quattro o cinque giorni. Abbiamo effettuato registrazioni da cellule fino a due settimane in coltura, ma la maggior parte delle nostre registrazioni avviene tra due e sei giorni di coltura. Con queste colture appena preparate da embrioni di *Drosophila* allo stadio medio della gastrulazione, otteniamo reti di neuroni che comunicano in coltura. Siamo quindi in grado di analizzare le proprietà di scarica di queste cellule.Presentano proprietà di sparo diverse. Alcune cellule si attivano in modo ripetitivo, altre cellule si attivano alla nascita; queste cellule sono principalmente colinergiche o GABAergiche. Possiamo analizzare le correnti sinaptiche mediate da questi recettori, ovvero i recettori nicotinici per l'ACh e i recettori per il GABA.

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