Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.

Mi chiamo Diana Dowd e sono professoressa presso il dipartimento di Biologia dello Sviluppo e Cellulare e di Anatomia e Neurobiologia presso l'Università di Irvine. E oggi dimostrerò la preparazione di colture neuronali primarie da embrioni di drosophila. E ciò che questo comporta è in realtà la rimozione di tutte le cellule da uno stadio gastroenterologico intermedio, l'embrione di drosophila, e il loro inserimento in coltura cellulare.

E ciò per cui usiamo queste colture è capire davvero quali sono i geni e i fattori ambientali che sono importanti per la regolazione dell'eccitabilità elettrica e della trasmissione sinaptica tra i neuroni della drosofila. Per iniziare questa procedura, dobbiamo raccogliere gli embrioni di drosophila. Per fare ciò, prendiamo le piastre per la raccolta delle uova, ci spargiamo sopra un po' di pasta di lievito.

È un substrato favorevole per le mosche adulte per deporre le uova. Abbiamo messo queste piastre su bottiglie contenenti una popolazione di mosche adulte, di solito da cento a 200 mosche. E poi lasciamo che le mosche, le mosche adulte, depongano le uova per circa due o tre ore.

Quindi rimuoviamo le piastre di raccolta degli ovuli e questi sono gli embrioni che utilizziamo per la procedura di coltura. Il passo successivo della procedura è quello di ricoprire gli embrioni, e questo significa che in realtà rimuoviamo il corion. Lo facciamo lavando gli embrioni in un imbuto Buechner su cui abbiamo un pezzo di carta da filtro in modo che catturi gli embrioni.

Li lasciamo riposare nell'imbuto di Buchner in una soluzione di candeggina al 50%. Questa soluzione di candeggina al 50% non solo dissolve il corion, ma serve anche come parte della nostra procedura di sterilizzazione. Stiamo facendo questa procedura in realtà non nel cappuccio, è fuori dal cofano, quindi gli embrioni, una volta declorati, li laviamo in una capsula di Petri.

In realtà, quando il Corian è sparito, la membrana del viel è piuttosto appiccicosa e si attaccherà bene a una capsula di Petri. Si può quindi versare acqua distillata sopra di essi e rimuovere l'acqua distillata due o tre volte e in realtà semplicemente gettare via l'acqua e gli embrioni si attaccheranno alla capsula di Petri. Non utilizzare un piatto di plastica per colture tissutali.

Non si attengono a questo. Iniziamo la parte sterile della procedura prendendo le piastre di Petri degli embrioni e portandole in una cappa a flusso laminare. Questi sono vetrini di copertina bellco.

Non sono rivestiti, ma sono stati sterilizzati in autoclave e non sono stati lavati. Scopriamo che non funzionano molto bene. Quando vengono lavati, di solito tiriamo fuori quattro vetrini coprioggetto e li mettiamo in un'unica capsula di Petri.

Quindi faremo quattro colture embrionali in ogni capsula di Petri. Ok, quindi quella capsula di Petri è praticamente pronta per noi per iniziare la coltivazione, e di solito faccio 12 colture, da 12 a 16 colture alla volta. Ok? Il terreno di coltura che utilizziamo è un mezzo definito relativamente semplice.

È la base A-D-M-E-M e prepariamo questo mezzo liquido una volta ogni due settimane in modo che rimanga buono per due settimane in frigorifero. Questo è stato sterilizzato. È stato sottoposto a un filtro sterile da 0,2 micron e quindi abbiamo aggiunto cinque integratori al terreno.

Vengono preparati una volta ogni due mesi e poi congelati in aliquote che vengono aggiunte a 10 mil di mezzo liquido. Quindi rimuoviamo semplicemente il contenuto. Infine, questo è solo, invertiamo delicatamente questo media per mescolarlo e siamo pronti per partire. Ok.

Tutto è pronto. Ho la mia piastra di coltura che è pronta, quella o la mia piastra di Petri che contiene quattro vetrini di copertura pronti per l'uso. E ora prenderò il mio piatto con gli embrioni e ora li prenderò nell'acqua distillata.

Rimuoverò l'acqua distillata semplicemente scrollandomela di dosso. È così che lo faccio direttamente nel cestino. E ora sto per versare circa due millimetri di terreno su questi embrioni, e ora sono pronti per me per inserire l'ago di vetro nei singoli embrioni e rimuovere il contenuto.

Devi avere i media all'esterno. Ovviamente se ci fosse acqua là fuori, allora avresti uno shock osmotico. Ora, per prepararmi a preparare le colture prima di rimuovere il contenuto dell'embrione, metto la goccia da cinque microlitri sui vetrini.

Se lo lasci troppo a lungo, il pH del terreno cambia. Ok, ora metto una goccia da cinque microlitri al centro di ciascuno dei quattro vetrini. In realtà è importante che queste gocce, dicono di rimanere il più intatte possibile.

Se il terreno si diffonde su tutto il vetrino coprioggetti, quindi le celle vengono placcate in alcune, uno strato molto sottile di fluido è difficile. Vuoi che piastrano le cellule in una bella goccia rotonda di liquido. Come puoi vedere lì, abbiamo quattro belle gocce rotonde di liquido pronte per l'uso.

E ora prenderò una delle pipette che ho estratto e poi la collegherò a questo tubo per pipette per bocca. È possibile utilizzare qualsiasi tubo si desideri, ma la cosa buona di questo tubo è che in realtà viene fornito con pipette VWR calibrate da 100 microlitri. E in questi che abbiamo, c'è una piccola guarnizione di gomma qui.

Posso inserire il pipettatore per bocca, intendo la pipetta di vetro in questa estremità del pipettatore. E poi, quando succhio il contenuto dell'embrione, non salirò più in alto di questa, la regione in cui inizia a restringersi. Quindi c'è questa enorme area che mi separa usando l'aspirazione del mouse qui sopra e il punto in cui si trovano le cellule.

Quindi non c'è, non c'è problema con la contaminazione. Se risucchi accidentalmente il contenuto in quest'area, avrai enormi problemi di contaminazione. Nelle nostre cappe a flusso laminare sono presenti microscopi da dissezione su base scopica.

Questo permette alla luce di entrare da sotto l'embrione, e questo ci permette di vedere effettivamente il solco cefalico e l'intestino medio e l'immaginazione che vedrete quando guarderemo gli embrioni reali. Ed è così che scegliamo lo stadio dell'embrione che è importante per la coltura per rimuovere il contenuto dell'embrione. Usiamo pipette di vetro, tiriamo un normale estrattore di micro elettrodi che usiamo per realizzare le nostre pipette di registrazione dei patch.

Non ci interessa davvero quali siano le impostazioni. Tiriamo fuori pipette abbastanza sottili perché stiamo per rompere la pipetta nel piatto accanto all'embrione alla dimensione che vogliamo davvero. Quindi prendiamo queste pipette di vetro, le inseriamo attraverso la membrana viel dell'embrione e utilizziamo un tubo di aspirazione della bocca attaccato alla parte posteriore della pipetta.

Quindi estraiamo il contenuto dell'intero embrione. Quindi lo spostiamo, prendiamo, estraiamo la pipetta e ci spostiamo in un altro piatto che ha un vetrino coprioggetto con una goccia di cinque microlitri di terreno. E noi espelliamo il contenuto dell'embrione in quella goccia da cinque microlitri.

Abbiamo pipettato su e giù diverse volte per disperdere le cellule, e poi abbiamo lasciato che il coperchio rimanesse nel piatto per circa 10 minuti prima di inondare il piatto con due mulini di terreno. Le piastre delle cellule dopo essere state piastrate vengono messe in un incubatore al 5% di CO2. Questo è molto importante perché il mezzo che utilizziamo è un mezzo tamponato con bicarbonato.

Ci sono alcuni HEP, ma non sono sufficienti per tamponare nell'ambiente aereo. E quindi è necessario utilizzare un incubatore al 5% di CO2. Tuttavia, deve essere a una temperatura relativamente bassa, circa 22-23 gradi, è l'ideale.

Quindi prendiamo un incubatore a CO2 standard che verrebbe utilizzato dalle colture di mammiferi e lo riscaldiamo a 37 gradi. Quello che facciamo è spegnere il riscaldatore, lo teniamo fermo nel nostro laboratorio, e possiamo mettere del ghiaccio sul fondo dell'incubatrice, e questo mantiene la temperatura intorno ai 21-25 gradi. L'altra tecnica che usiamo è prendere, di nuovo, uno di questi incubatori a CO2 con riscaldamento standard e mettere l'incubatrice in una cella frigorifera.

Quindi puoi effettivamente riscaldare l'incubatrice in modo abbastanza efficace a 23 gradi se la temperatura ambiente è fredda a temperatura ambiente. E quindi questi sono i due metodi che usiamo per avere una foca standard, una foca di mammifero per incubarsi per permetterci di sopravvivere. Va bene, questa è una coltura che è stata placcata un'ora fa allo stesso ingrandimento che abbiamo visto subito dopo la placcatura un'ora dopo la placcatura.

Qui vediamo neuroni che si sono differenziati per circa due giorni. In coltura, i neuroblasti si sono divisi una o più volte e poi hanno dato origine ai neuroni, che estendono processi che formano estese reti nevrotiche sovrapposte. Qui abbiamo due corpi cellulari che sono testa a testa.

Quello superiore sta estendendo un processo a ore 11 e quello inferiore sta estendendo un processo a ore cinque. Queste sono le loro principali estensioni. E poi puoi vedere che formano rami più sottili.

Questi aderiscono molto strettamente al substrato di vetro, e ci sono processi che si possono vedere che provengono anche da altre celle che si sovrappongono a questi. E questi sono siti di potenziale connessione sinaptica. Patcheremmo una di queste cellule, e in generale esse, con questo livello di elaborazione del processo, avrebbero correnti sinaptiche funzionali sinaptiche.

Ora le nostre cellule crescono in coltura 12 ore dopo la piastra. Avranno processi estesi piuttosto piacevoli. La nostra fisiologia standard, iniziamo a fare circa uno o due dopo la coltivazione.

E si può vedere che in realtà continuano a far crescere i processi per i prossimi quattro o cinque giorni. E abbiamo registrato da cellule fino a due settimane in coltura, ma la maggior parte delle nostre registrazioni sono tra i due e i sei giorni in coltura con queste colture, quindi abbiamo appena preparato da embrioni di drosofila allo stadio gastro intermedio, abbiamo reti di neuroni che comunicano in coltura. Siamo in grado di osservare effettivamente le proprietà di cottura di queste cellule.

Hanno diverse proprietà di cottura. Hanno un'evocazione ripetitiva, alcune cellule si attivano ripetitivamente, altre cellule si attivano alla nascita, e queste cellule sono principalmente colinergiche o GABAergiche. E noi guardiamo, possiamo guardare le correnti sinaptiche che sono mediate da queste, dai recettori nicotinici, Aach, H e GABA.