Name: Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Impara la tecnica di patch clamp con sistema di perfusione per registrare l'attivazione dei canali BK in ovociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare i meccanismi di attivazione dei canali ionici dipendenti da voltaggio e calcio.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute R01-R01-HL70393 e NS060706 a JCJC è Professore di Ingegneria Biomedica sul Spencer T. Olin Endowment.

1. L'iniezione di mRNA in oociti <ol><li> Iniettare ,05-50 ng di RNA messaggero che è stato trascritto in vitro in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI) con Nanoject II Auto-nanoliter Injector (Drummond società Scientific, modello 3-000-204). Ripetere l'iniezione su una decina di ovociti per ogni mRNA. </li><li> Risciacquare gli ovociti iniettati due volte usando ND-96 soluzione (96 mM di cloruro di sodio (NaCl, il signor 58,44 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, il signor 74,56 g / mol), 1,8 mM di cloruro di calcio (CaCl 2 • 2H 2 O , il signor 147,02), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, il signor 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, il signor 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato di sodio (il signor 110,04 g / mol) e 1x penicillina-streptomicina. pH 7,6), poi mettetele in una piastra di coltura e incubare a 18 ° C per 2 giorni +. </li></ol> 2. Preparazione del sistema di perfusione <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Illustrazione del ValveLink Automatizzare 16 Sistema di perfusione. Il sistema di perfusione utilizza l'azoto pressurizzato per spingere soluzioni di perfusione fuori dei serbatoi soluzione, attraverso i tubi di perfusione, e la matita perfusione e mancia escluse. Il flusso di ogni flusso della soluzione di perfusione è controllato da una valvola serbatoio e una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funziona come un raccoglitore così come un meccanismo di rilascio della pressione. (Foto adattato da http://www.autom8.com sito venditore) <ol><li> Collegare i tubi alla matita perfusione. Accendere il controller valvola elettronica e aprire le valvole elettroniche. </li><li> Per garantire che i tubi e la matita perfusione sono liberi di bolle d'aria e di intasare, spingere deionizzata (DI) attraverso ogni tubo usando una siringa riempita con acqua deionizzata. </li><li> Collegare i tubi ai serbatoi soluzione e aprire la valvola della bombola di gas da applicare azoto pressurizzato. </li><li> Aprire il rubinetto serbatoio per riempire il tubo con la soluzione di riserva. Flick la valvola serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione, se necessario. Chiudere la valvola dopo che il tubo è riempito di soluzione. </li><li> Riempire la punta perfusione con acqua e avvitarlo sulla matita perfusione. Fare attenzione a non intrappolare le bolle quando si collega la punta. </li><li> Fissare la matita perfusione allo stadio bagno con plastilina. Assicurarsi che la punta perfusione è in bagno. Il sistema di perfusione è ora impostato. </li><li> Aggiungere acqua deionizzata nella vasca da bagno. Assicurarsi che la punta perfusione è sommerso in acqua. </li><li> Prova che ogni soluzione perfusione esce dalla punta perfusione correttamente. Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo di raccolta dei rifiuti e aprire la valvola per una soluzione di perfusione alla volta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil) -1 - piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + e Mg2 + viene aggiunto alla concentrazione desiderata quando necessario). Sotto il microscopio, osservare il getto di liquido di perfusione che esce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione di perfusione e aprire la valvola per la raccolta dei rifiuti. Il getto perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere la stessa prova per tutte le soluzioni di perfusione. </li><li> Quando hai verificato che tutte le soluzioni di flusso di perfusione correttamente, sostituire acqua distillata nella vasca da bagno con la soluzione (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch di serraggio <ol><li> Ricopertura l'elettrodo di registrazione Ag con AgCl prima di ogni patch di serraggio sessione. In primo luogo, rimuovere il filo elettrodo dal titolare pipetta e immergere la metà punta del filo elettrodo in un flacone di candeggina fresca per almeno 15 minuti. Questo depositi uno strato di AgCl sul filo. </li><li> Sciacquare il filo elettrodo con acqua deionizzata e asciugare. Quindi installare l'Ag / AgCl indietro nel supporto pipetta. </li><li> Collegare il (di riferimento) elettrodo bagno al headstage e posizionarlo nella vasca da bagno. Questo prepara gli elettrodi per la registrazione. </li><li> Ora preparate per l'acquisizione dei dati. Accendere il computer e inserire la chiave hardware alla porta stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegato per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEKA impulsi. </li><li> Accendere l'amplificatore (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e iniziare a HEKA Pulse. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la Scala di stimolo. L'obiettivo per regolare le impostazioni di configurazione è di assicurare che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Questo prepara le apparecchiature di acquisizione dati. </li><li> Preparare ovociti. Immergere l'ovocita in soluzione stripping (200 mm N-Metil-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (senza K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH viene regolato a 7,4 con idrossido di sodio (NaOH, M r 40,0 g / mol) per 5 - 10 min. La soluzione stripping stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile mettere a nudo la membrana vitellina. </li><li> Delicatamente la striscia di membrana vitellina da ovocita usando due paia di pinzette. Un ovocita devitellinized è estremamente fragile e quindi deve essere spostato il meno necessario. </li><li> Avendo cura di evitare di esporre l'ovocita devitellinized a bolle d'aria o, usare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l'ovocita al bagno. Questo prepara l'ovocita per la registrazione. </li><li> Preparare pipette patch. Tirare le pipette di vetro dopo aver inserito un tubo capillare di vetro (VWR International, Cat # 53432-921) in una Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipetta Puller. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e diametro di apertura. Il diametro di apertura dovrebbe essere di 2-4 micrometri. </li><li> Per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e per garantire una punta liscia, cappotto la punta con la cera e poi il fuoco-polacco. </li><li> Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all'interno della soluzione di pipetta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) e il disegno lo stantuffo. Questo bagna la punta. </li><li> Riempire la pipetta 1 / 3 pieno con una soluzione pipetta usando una siringa e inserire la pipetta nel supporto pipetta con l'Ag / AgCl all'interno elettrodo e contatto con la soluzione di pipetta. Questo prepara la pipetta di patch. </li><li> Per accise uno inside-out patch dal ovocita preparato, trovare il chiaro vantaggio di ovociti al microscopio. Spostare la pipetta di patch vicino al ovociti mediante manipolatore. Registrare la resistenza di serie pipetta. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. </li><li> Spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza raddoppia. </li><li> Applicare aspirazione delicato per la membrana per via orale attraverso un tubo di aspirazione che è collegato al titolare pipetta fino a quando un giga ohm sigillo è ottenuto. Stabilizzare la patch tenendolo in tensione -30 mV per un paio di minuti. </li><li> Per ottenere un inside-out patch, la patch da accise rapidamente spingendo la pipetta ulteriormente nel citoplasma dell'ovocita e poi delicatamente tirando fuori. </li><li> L'inside-out patch è ora pronto per il bloccaggio. Spostare la pipetta tenendo la inside-out patch per circa 100 micron di distanza dall'apertura della punta perfusione. </li><li> Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola serbatoio per la soluzione di perfusione desiderato </li><li> Iniziare a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e perfusione come desiderato. </li><li> Quando si è finito di registrare, pulire la perfusione tubi, matita e punta spingendo attraverso l'acqua deionizzata per evitare intasamenti. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Durante la preparazione di ovociti per la patch clamp, il trattamento 5-10 min di soluzione stripping sarebbe staccare la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile togliere la membrana vitellina. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. Che segue è una registrazione rappresentante della wild-type canali BK su una patch di membrana dell'ovocita. In alto a sinistra, le onde quadre indicano la tensione applicata la patch - il secondo passo di aumenti di tensione da 50 mV a 200 mV con incrementi di 50 mV. Di seguito le tracce corrispondente corrente quando la soluzione di perfusione è nominale 0 Ca 2 + (libero [Ca 2 +] è di circa 0,5 nM). L'apiega di ampiezza della corrente indica che la probabilità di apertura dei canali BK aumenta con la tensione. Sul lato destro, la stessa patch è perfuso con 1.0 mM Ca 2 + quando è applicato con il protocollo stessa tensione. L'ampiezza della corrente aumenta di più sotto la stessa tensione, indicando che la probabilità aumenta con l'aperta [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
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<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazioni...

<table><tbody><tr><td>Iniettore automatico di nanolitri Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette P-97 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione e controllore elettronico</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Diametro interno della punta di perfusione: 100 micrometri</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di vetro</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia per computer</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Testa amplificatrice (headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp e tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni espresso in xenopus ovociti

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l&#39;attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca 2 +-attivati ​​K + (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori 1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori 2-6. BK canali sono attivati ​​da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca 2 + e Mg 2 + 6-9. Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l&#39;RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C 10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l&#39;inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp 10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l&#39;attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l&#39;mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine ​​canale sulla membrana dell&#39;ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Il protocollo qui presentato è progettato per studiare l'attivazione dei canali K+ a grande conduttanza, attivati dal voltaggio e dal Ca2+ (BK). Il protocollo può...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attivazione del canale BK in condizioni di tensione controllata, controllando al contempo la soluzione intracellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto esprimendo i canali BK in Xenopus Cytes mediante iniezione di mRNA del canale BK. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare il sistema di perfusione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel formare un sigillo giga tra la membrana dell'oocita e la pipetta per il patch. L'ultimo passaggio della procedura è l'escissione della porzione di membrana. Alla fine, i risultati ottenuti utilizzando la tecnica del patch clamp abbinata a un sistema di perfusione mostrano che i canali BK vengono attivati da variazioni di tensione e di concentrazione di calcio.Ciao, sono Jin Cho Young del laboratorio del Dott. Jamie Zu presso l'Università di Washington. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, inclusi interrogativi riguardanti il meccanismo molecolare dell'attivazione dei canali ionici. Cominciamo dunque.Il primo passaggio della procedura inizia alcuni giorni prima della tecnica del patch clamping e utilizza un mRNA del canale BK trascritto in vitro. Dopo aver raccolto gli oociti di Xenopus Lavu allo stadio cinque-sei, iniettare da 0,05 a 50 nanogrammi di mRNA del canale BK in un oocita. Utilizzare un iniettore automatico nanolitrico a due canali.Ripetere l'iniezione su una dozzina di oociti per ogni mRNA dopo l'iniezione. Lavare gli oociti due volte utilizzando soluzione ND 96. Successivamente, posizionare gli oociti in una piastra di coltura e incubarli a 18 gradi Celsius per due o più giorni, per consentire agli oociti di esprimere il canale BK.Dopo un'incubazione di due-cinque giorni, gli oociti dovrebbero esprimere canali BK ed essere quindi già pronti per la tecnica del patch clamping. Prima di manipolare gli oociti, preparare tutto il necessario per il patch clamping, iniziando dal sistema di perfusione. Il sistema mostrato qui è il collegamento automatico delle valvole.Il sistema di profusione 16 utilizza azoto pressurizzato per spingere le soluzioni di profusione dai serbatoi attraverso i tubi di profusione e all'interno della penna e della punta di profusione. Il flusso di ciascun flusso di soluzione di profusione è controllato da una valvola del serbatoio e da una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funge da collettore dei rifiuti, nonché da meccanismo di sfiato della pressione.Prima degli esperimenti, possono essere preparate soluzioni di perfusione con diverse concentrazioni di calcio o magnesio. Aggiungere le soluzioni di perfusione ai serbatoi ed etichettare ciascuno per indicare la concentrazione di calcio o magnesio. Per configurare il sistema di perfusione, innanzitutto collegare i tubi alla penna di perfusione.Quindi accendere il regolatore elettronico delle valvole e aprire le valvole elettroniche per assicurarsi che i tubicini e la penna di perfusione siano privi di ostruzioni e bolle d'aria. Spingere acqua deionizzata attraverso ciascun tubicino utilizzando una siringa riempita con acqua deionizzata. A questo punto, collegare i tubicini ai serbatoi delle soluzioni e aprire la valvola della bombola del gas per applicare azoto sotto pressione.Aprire una valvola del serbatoio per riempire il tubo con una delle soluzioni del serbatoio. Se necessario, fare clic sulla valvola del serbatoio per rimuovere le bolle dalla soluzione. Chiudere la valvola del serbatoio dopo che il tubo è stato riempito con la soluzione, riempire la punta di perfusione con acqua e avvitarla sulla matita di perfusione.Attenzione a non intrappolare bolle d'aria. Quando si collega la punta, fissare la pipetta di perfusione al supporto del bagno utilizzando argilla modellabile, assicurandosi che la punta di perfusione si trovi all'interno dello spazio del bagno. Il sistema di perfusione è ora pronto. A questo punto, aggiungere acqua deionizzata nel bagno. Assicurarsi che la punta della perfusione sia immersa nell'acqua. Verificare che ciascuna soluzione di perfusione fuoriesca correttamente dalla punta di perfusione.Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo del collettore dei rifiuti e aprire la valvola per una delle soluzioni di perfusione. Osservare al microscopio il getto di liquido di perfusione che fuoriesce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per quella soluzione di perfusione e aprire la valvola per il collettore dei rifiuti.Il getto di perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere lo stesso test per ciascuna delle soluzioni di perfusione. Dopo aver verificato che tutte le soluzioni di perfusione scorrono correttamente, sostituire l'acqua deionizzata nel bagno con la soluzione di bagno desiderata.Ora è il momento di preparare l'apparato di registrazione. È necessario rivestire nuovamente l'elettrodo di registrazione in argento con cloruro d'argento prima di ogni sessione di patch clamping. Per prima cosa, rimuovere il filo dell'elettrodo dal supporto della pipetta e immergere la metà della punta del filo dell'elettrodo in una provetta contenente candeggina fresca per almeno 15 minuti.Questo deposita uno strato di cloruro d'argento sul filo. Risciacquare il filo dell'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare tamponando. Quindi reinstallare l'elettrodo in argento/cloruro d'argento nel portapipetta.Ora accendi il computer. Collega la chiave hardware alla porta della stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegata affinché tu possa utilizzare il software di acquisizione dati, ovvero HEA pulse.Accendere l'amplificatore e avviare il software di acquisizione dati. Impulso HEA. Caricare il file del protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la scala dello stimolo.L'obiettivo della regolazione delle impostazioni di configurazione è garantire che il potenziale di prova sia esattamente uguale al potenziale comandato. Ora siamo pronti per preparare le oociti. Prelevare le oociti dall'incubatore.Immergere l'ovocita nella soluzione di rimozione per cinque-dieci minuti. La soluzione di rimozione stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, rendendo possibile la rimozione della membrana vitellina. Dopo cinque-dieci minuti, rimuovere delicatamente la membrana vitellina dall'ovocita.Utilizzando due pinzette. Un sito divi OC è estremamente fragile e pertanto va spostato il meno possibile. Avendo cura di evitare che l'ovocita Devi sia esposta all'aria o a bolle, utilizzare una pipetta di vetro riempita con una quantità sufficiente di soluzione per trasferire l'ovocita nel bagno.I canali sulla membrana dell'oocita sono ora esposti e pronti per la pipetta per il patch. Preparare una pipetta per il patch inserendo un capillare di vetro nel tiratore di micropipette. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e il diametro dell'apertura.Il diametro dell'apertura deve essere compreso tra due e quattro micrometri per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e, per garantire una punta liscia, rivestire la punta con cera e quindi sottoporla a riscaldamento. Levigare al microscopio. Riempire la punta della pipetta immergendola nella soluzione per pipetta ed aspirando con lo stantuffo.Questo bagna la punta della pipetta. Successivamente, riempire la pipetta per un terzo con la soluzione per pipetta utilizzando una siringa. Quindi posizionare la pipetta nel supporto per pipetta con l'elettrodo di argento e cloruro di argento all'interno.Assicurarsi che l'elettrodo metallico sia a contatto con la soluzione della pipetta. Il passaggio successivo consiste nell'escindere una membrana "inside-out" dall'oocita preparato. Innanzitutto, individuare al microscopio il margine chiaro dell'oocita.Utilizzando il manipolatore, avvicinare la pipetta per il patch all'oocita, assicurandosi che sia immersa. Nella soluzione di bagnamento, registrare la resistenza in serie della pipetta. La resistenza in serie ideale della pipetta per il patch è compresa tra uno e 1,5 milliohm quando riempita con la soluzione per la pipetta e immersa nella soluzione di bagnamento.Ora spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza non raddoppia approssimativamente. Ottenere un sigillo gigaohm applicando una leggera aspirazione con la bocca attraverso un tubo di aspirazione collegato al supporto della pipetta. Dopo aver verificato la formazione di un sigillo gigaohm, stabilizzare la membrana mantenendola a meno 30 millivolt per alcuni minuti.Per ottenere una membrana interna esterna, escidi la membrana spingendo rapidamente la pipetta più all'interno del sito OO e quindi estraendola delicatamente. La membrana interna esterna è ora pronta per il patch clamping. Sposta la pipetta che contiene la membrana interna esterna a circa 100 micrometri di distanza dall'apertura della punta di perfusione.Chiudere la valvola elettronica per la raccolta degli scarti e aprire la valvola del serbatoio per la soluzione di perfusione desiderata. Iniziare la registrazione delle correnti attraverso la patch. Modificare la tensione e le soluzioni di perfusione secondo necessità.Una volta terminata la registrazione, pulire la penna e la punta dei tubicini di perfusione spingendo acqua deionizzata al loro interno per evitare ostruzioni. Le registrazioni ottenute con la tecnica del patch clamp mostrano che i canali BK di tipo selvaggio in una membrana di oocita rispondono sia al voltaggio sia al calcio. Questa figura mostra una registrazione in condizione di zero calcio nominale nella soluzione di perfusione.Le onde quadre sopra i tracciati della corrente indicano la tensione applicata alla membrana. Sono state applicate quattro tensioni comprese tra 50 millivolt e 200 millivolt, con incrementi di 50 millivolt. La corrente massima, pari a circa due nanoampere, è stata ottenuta con la tensione massima di 200 millivolt.Questo aumento dell'ampiezza della corrente con l'aumento della tensione ha indicato che la probabilità di apertura dei canali BK aumentava con la tensione. Questa figura mostra la risposta della membrana inside-out a diverse tensioni. Quando era presente un micromolare di calcio nella soluzione di perfusione, sono stati applicati passi di tensione.Come nella figura precedente, la risposta al gradino di tensione di 200 millivolt, la risposta superiore è aumentata a circa tre nanoampere quando era presente calcio nel Perfu otto, rispetto a due nanoampere in assenza di calcio. Ciò indica che la probabilità di apertura dei canali BK è aumentata in presenza di calcio. In sintesi, questa procedura di patch clamping ha dimostrato che i canali BK dipendono sia dalla tensione che dal calcio.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare l'attivazione del canale del ferro utilizzando la tecnica del patch clamp abbinata a un sistema di alimentazione con pro-combustibile. Ora. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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