Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attivazione del canale BK sotto tensione controllata, controllando anche la soluzione intracellulare. Ciò si ottiene esprimendo prima i canali BK in Xenopus Cytes iniettandoli con l'mRNA del canale BK. Il secondo passo della procedura consiste nel preparare il sistema di perfusione.

Il terzo passo della procedura consiste nel formare un giga sigillo tra la membrana dell'ovocita e la pipetta del cerotto. La fase finale della procedura consiste nell'asportare il cerotto a membrana. In definitiva, i risultati ottenuti utilizzando la tecnologia patch clamp abbinata a un sistema di profusione mostrano che i canali BK vengono attivati da variazioni di tensione e concentrazione di calcio.

Ciao, sono Jin Cho Young del laboratorio del Dr.Jamie Zus dell'Università di Washington. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, comprese le domande riguardanti il meccanismo molecolare per l'attivazione dei canali ionici. Quindi iniziamo.

La prima fase della procedura inizia un paio di giorni prima del patch clamping e utilizza l'mRNA del canale BK che è stato trascritto in vitro. Dopo aver raccolto gli stadi da cinque a sei di Xenopus Lavu Cytes, iniettare da 0,05 a 50 nanogrammi di mRNA del canale BK in un citato. Utilizzando un iniettore nano iniettato da due nanolitri automatici.

Ripetere l'iniezione su una dozzina di ovociti per ogni mRNA dopo l'iniezione. Sciacquare gli ovociti due volte con la soluzione ND 96. Quindi posizionare gli ovociti in una piastra di coltura e incubarli a 18 gradi Celsius per due o più giorni per dare il tempo agli ovociti di esprimere il canale BK.

Dopo due-cinque giorni di incubazione, gli ovociti dovrebbero esprimere i canali BK e quindi sono già pronti per il patch clamping. Prima di maneggiare gli ovociti, impostare tutto il resto necessario per il bloccaggio dei cerotti, a partire dal sistema di perfusione. Il sistema mostrato qui è il collegamento della valvola automatizzato.

16 Sistema di profusione L'azoto pressurizzato spinge le soluzioni di profusione fuori dai serbatoi della soluzione attraverso i tubi di profusione e nella matita e nella punta di profusione. Il flusso di ogni flusso di soluzione a profusione è controllato da una valvola di riserva e da una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funge da raccoglitore di rifiuti, nonché da meccanismo di rilascio della pressione.

Prima degli esperimenti possono essere preparate soluzioni di perfusione di diverse concentrazioni di calcio o magnesio. Aggiungere le soluzioni di perfusione ai serbatoi ed etichettare ciascuno di essi per indicare la concentrazione di calcio o magnesio. Per configurare prima il sistema di profusione, collegare i tubi alla matita di profusione.

Quindi accendere il controller elettronico della valvola e aprire le valvole elettroniche per assicurarsi che i tubi e la matita di profusione siano privi di ostruzioni e bolle d'aria. Spingere l'acqua deionizzata attraverso ciascun tubo utilizzando una siringa riempita con acqua deionizzata. A questo punto, collegare i tubi ai serbatoi della soluzione e aprire la valvola della bombola del gas per applicare il pressurizzato all'azoto.

Aprire una valvola del serbatoio per riempire il tubo con una delle soluzioni del serbatoio. Se necessario, fare clic sulla valvola del serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione. Chiudere la valvola del serbatoio dopo che il tubo è stato riempito di soluzione, riempire la punta di perfusione con acqua e avvitarla sulla matita di perfusione.

Fare attenzione a non intrappolare le bolle. Quando si collega la punta, fissare la matita di perfusione al palco del bagno utilizzando l'argilla da modellare, assicurarsi che la punta di profusione sia nello spazio del bagno. Il sistema a profusione è ora predisposto.

A questo punto, aggiungere acqua deionizzata al bagno. Assicurarsi che la punta a profusione sia immersa nell'acqua. Verificare che ogni soluzione di perfusione fuoriesca correttamente dalla punta di perfusione.

Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo del raccoglitore di rifiuti e aprire la valvola per una delle soluzioni a profusione. Al microscopio, osservare il getto di liquido di profusione che fuoriesce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione a profusione e aprire la valvola per il raccoglitore dei rifiuti.

Il getto a profusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere lo stesso test per ciascuna delle soluzioni di perfusione. Dopo aver verificato che tutte le soluzioni di perfusione scorrano correttamente, sostituire l'acqua deionizzata nella vasca con la soluzione da bagno desiderata.

Ora è il momento di configurare l'apparecchio di registrazione. È necessario rivestire l'elettrodo di registrazione in argento con cloruro d'argento prima di ogni sessione di patch clamping. Per prima cosa, rimuovere il filo dell'elettrodo dal supporto della pipetta e immergere la metà della punta del filo dell'elettrodo in una fiala contenente candeggina fresca per almeno 15 minuti.

Questo deposita uno strato di cloruro d'argento sul filo. Sciacquare il filo dell'elettrodo con acqua deionizzata e asciugarlo. Quindi reinstallare l'elettrodo di cloruro d'argento nel supporto della pipetta.

Ora accendi il computer. Collegare la chiave hardware alla porta della stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegata per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEA pulse.

Accendere l'amplificatore e avviare il software di acquisizione dati. Impulso HEA. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, ad esempio la scala dello stimolo.

L'obiettivo della regolazione delle impostazioni di configurazione è garantire che il potenziale di test sia esattamente uguale al potenziale di comando. Ora siamo pronti per preparare gli ovociti. Recupera gli ovociti dall'incubatrice.

Immergere l'ovocita in una soluzione di stripping per cinque-10 minuti. La soluzione di stripping stacca la membrana del viel dalla membrana plasmatica, il che rende possibile lo stripping della membrana del vitel. Dopo cinque-10 minuti, rimuovere delicatamente la membrana vitel dall'ovocita.

Usando due pinze. Un sito divi OC è estremamente fragile e quindi dovrebbe essere spostato il meno necessario. Facendo attenzione a evitare di esporre l'ovocita Devi all'aria o alle bolle, utilizzare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l'ovocita nella vasca da bagno.

I canali sulla membrana dell'ovocita sono ora esposti e pronti per la pipetta del cerotto. Estrarre una pipetta patch inserendo un tubo capillare di vetro nel micro estrattore per pipette. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma del puntale e il diametro dell'apertura.

Il diametro dell'apertura dovrebbe essere compreso tra due e quattro micrometri per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e, per garantire una punta liscia, rivestire la punta con cera e quindi sparare. Lucidalo al microscopio. Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all'interno della soluzione della pipetta e aspirando lo stantuffo.

Questo bagna la punta della pipetta. Quindi, riempire la pipetta per un terzo con la soluzione di pipetta utilizzando una siringa. Quindi posizionare la pipetta nel portapipette con l'elettrodo d'argento e cloruro d'argento all'interno.

Assicurarsi che l'elettrodo a filo sia a contatto con la soluzione della pipetta. Il passo successivo consiste nell'asportare un cerotto dall'ovocita preparato. Per prima cosa, trova il bordo chiaro dell'ovocita al microscopio.

Utilizzando il manipolatore, avvicinare la pipetta del cerotto all'ovocita, assicurandosi che sia sommersa. Nella soluzione del bagno, registrare la resistenza in serie della pipetta. La resistenza in serie ideale della pipetta patch è compresa tra uno e 1,5 milliohm quando viene riempita con la soluzione della pipetta e immersa nella soluzione del bagno.

Ora spingi lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la sua resistenza non raddoppia circa. Ottenere una tenuta giga ohm applicando un'aspirazione delicata a bocca attraverso un tubo di aspirazione collegato al supporto della pipetta. Dopo aver confermato che si è formato un giga seal, stabilizzare il cerotto tenendolo a meno 30 millivolt per un paio di minuti.

Per ottenere un cerotto dall'interno verso l'esterno, asportare il cerotto spingendo rapidamente la pipetta più in profondità nel sito OO e quindi estraendola delicatamente. Il cerotto al rovescio è ora pronto per il bloccaggio del cerotto. Spostare la pipetta che tiene il cerotto al rovescio a circa 100 micron di distanza dall'apertura del puntale di perfusione.

Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola del serbatoio per la soluzione a profusione desiderata. Inizia a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e profusione come desiderato.

Al termine della registrazione, pulire la matita e la punta dei tubi a profusione spingendo con acqua deionizzata per evitare intasamenti. Le registrazioni del patch clamp ottenute qui mostrano che i canali BK wild type su un patch di membrana degli ovociti rispondono sia al voltaggio che al calcio. Questa figura mostra una registrazione di patch con zero calcio nominale nella soluzione di perfusione.

Le onde quadre sopra le tracce di corrente indicano la tensione applicata al cerotto. Sono state applicate quattro tensioni che vanno da 50 millivolt a 200 millivolt con incrementi di 50 millivolt. La corrente massima, circa due nano ampere, è stata ottenuta con la tensione massima di 200 millivolt.

Questo aumento dell'ampiezza della corrente con l'aumentare della tensione indicava che la probabilità di apertura dei canali BK aumentava con la tensione. Questa figura mostra la risposta del patch inside out a diverse tensioni. Quando c'era un calcio micromolare nella soluzione di perfusione, sono stati applicati dei gradini di tensione.

Come nella figura precedente, la risposta al gradino di tensione di 200 millivolt, la risposta superiore è aumentata a circa tre nano ampere quando c'era calcio nell'otto Perfu rispetto a due nano ampere senza calcio. Ciò indica che la probabilità aperta dei canali BK è aumentata in presenza di calcio. In sintesi, questa procedura di patch clamping ha dimostrato che i canali BK dipendevano dalla tensione e dal calcio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare l'attivazione del canale di ferro utilizzando la tecnica del patch clamp accoppiata con un sistema di alimentazione professionale. Ora. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.