Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attivazione del canale BK in condizioni di tensione controllata, controllando al contempo la soluzione intracellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto esprimendo i canali BK in Xenopus Cytes mediante iniezione di mRNA del canale BK. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare il sistema di perfusione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel formare un sigillo giga tra la membrana dell'oocita e la pipetta per il patch. L'ultimo passaggio della procedura è l'escissione della porzione di membrana. Alla fine, i risultati ottenuti utilizzando la tecnica del patch clamp abbinata a un sistema di perfusione mostrano che i canali BK vengono attivati da variazioni di tensione e di concentrazione di calcio.

Ciao, sono Jin Cho Young del laboratorio del Dott. Jamie Zu presso l'Università di Washington. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, inclusi interrogativi riguardanti il meccanismo molecolare dell'attivazione dei canali ionici. Cominciamo dunque.

Il primo passaggio della procedura inizia alcuni giorni prima della tecnica del patch clamping e utilizza un mRNA del canale BK trascritto in vitro. Dopo aver raccolto gli oociti di Xenopus Lavu allo stadio cinque-sei, iniettare da 0,05 a 50 nanogrammi di mRNA del canale BK in un oocita. Utilizzare un iniettore automatico nanolitrico a due canali.

Ripetere l'iniezione su una dozzina di oociti per ogni mRNA dopo l'iniezione. Lavare gli oociti due volte utilizzando soluzione ND 96. Successivamente, posizionare gli oociti in una piastra di coltura e incubarli a 18 gradi Celsius per due o più giorni, per consentire agli oociti di esprimere il canale BK.

Dopo un'incubazione di due-cinque giorni, gli oociti dovrebbero esprimere canali BK ed essere quindi già pronti per la tecnica del patch clamping. Prima di manipolare gli oociti, preparare tutto il necessario per il patch clamping, iniziando dal sistema di perfusione. Il sistema mostrato qui è il collegamento automatico delle valvole.

Il sistema di profusione 16 utilizza azoto pressurizzato per spingere le soluzioni di profusione dai serbatoi attraverso i tubi di profusione e all'interno della penna e della punta di profusione. Il flusso di ciascun flusso di soluzione di profusione è controllato da una valvola del serbatoio e da una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funge da collettore dei rifiuti, nonché da meccanismo di sfiato della pressione.

Prima degli esperimenti, possono essere preparate soluzioni di perfusione con diverse concentrazioni di calcio o magnesio. Aggiungere le soluzioni di perfusione ai serbatoi ed etichettare ciascuno per indicare la concentrazione di calcio o magnesio. Per configurare il sistema di perfusione, innanzitutto collegare i tubi alla penna di perfusione.

Quindi accendere il regolatore elettronico delle valvole e aprire le valvole elettroniche per assicurarsi che i tubicini e la penna di perfusione siano privi di ostruzioni e bolle d'aria. Spingere acqua deionizzata attraverso ciascun tubicino utilizzando una siringa riempita con acqua deionizzata. A questo punto, collegare i tubicini ai serbatoi delle soluzioni e aprire la valvola della bombola del gas per applicare azoto sotto pressione.

Aprire una valvola del serbatoio per riempire il tubo con una delle soluzioni del serbatoio. Se necessario, fare clic sulla valvola del serbatoio per rimuovere le bolle dalla soluzione. Chiudere la valvola del serbatoio dopo che il tubo è stato riempito con la soluzione, riempire la punta di perfusione con acqua e avvitarla sulla matita di perfusione.

Attenzione a non intrappolare bolle d'aria. Quando si collega la punta, fissare la pipetta di perfusione al supporto del bagno utilizzando argilla modellabile, assicurandosi che la punta di perfusione si trovi all'interno dello spazio del bagno. Il sistema di perfusione è ora pronto.

A questo punto, aggiungere acqua deionizzata nel bagno. Assicurarsi che la punta della perfusione sia immersa nell'acqua. Verificare che ciascuna soluzione di perfusione fuoriesca correttamente dalla punta di perfusione.

Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo del collettore dei rifiuti e aprire la valvola per una delle soluzioni di perfusione. Osservare al microscopio il getto di liquido di perfusione che fuoriesce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per quella soluzione di perfusione e aprire la valvola per il collettore dei rifiuti.

Il getto di perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere lo stesso test per ciascuna delle soluzioni di perfusione. Dopo aver verificato che tutte le soluzioni di perfusione scorrono correttamente, sostituire l'acqua deionizzata nel bagno con la soluzione di bagno desiderata.

Ora è il momento di preparare l'apparato di registrazione. È necessario rivestire nuovamente l'elettrodo di registrazione in argento con cloruro d'argento prima di ogni sessione di patch clamping. Per prima cosa, rimuovere il filo dell'elettrodo dal supporto della pipetta e immergere la metà della punta del filo dell'elettrodo in una provetta contenente candeggina fresca per almeno 15 minuti.

Questo deposita uno strato di cloruro d'argento sul filo. Risciacquare il filo dell'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare tamponando. Quindi reinstallare l'elettrodo in argento/cloruro d'argento nel portapipetta.

Ora accendi il computer. Collega la chiave hardware alla porta della stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegata affinché tu possa utilizzare il software di acquisizione dati, ovvero HEA pulse.

Accendere l'amplificatore e avviare il software di acquisizione dati. Impulso HEA. Caricare il file del protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la scala dello stimolo.

L'obiettivo della regolazione delle impostazioni di configurazione è garantire che il potenziale di prova sia esattamente uguale al potenziale comandato. Ora siamo pronti per preparare le oociti. Prelevare le oociti dall'incubatore.

Immergere l'ovocita nella soluzione di rimozione per cinque-dieci minuti. La soluzione di rimozione stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, rendendo possibile la rimozione della membrana vitellina. Dopo cinque-dieci minuti, rimuovere delicatamente la membrana vitellina dall'ovocita.

Utilizzando due pinzette. Un sito divi OC è estremamente fragile e pertanto va spostato il meno possibile. Avendo cura di evitare che l'ovocita Devi sia esposta all'aria o a bolle, utilizzare una pipetta di vetro riempita con una quantità sufficiente di soluzione per trasferire l'ovocita nel bagno.

I canali sulla membrana dell'oocita sono ora esposti e pronti per la pipetta per il patch. Preparare una pipetta per il patch inserendo un capillare di vetro nel tiratore di micropipette. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e il diametro dell'apertura.

Il diametro dell'apertura deve essere compreso tra due e quattro micrometri per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e, per garantire una punta liscia, rivestire la punta con cera e quindi sottoporla a riscaldamento. Levigare al microscopio. Riempire la punta della pipetta immergendola nella soluzione per pipetta ed aspirando con lo stantuffo.

Questo bagna la punta della pipetta. Successivamente, riempire la pipetta per un terzo con la soluzione per pipetta utilizzando una siringa. Quindi posizionare la pipetta nel supporto per pipetta con l'elettrodo di argento e cloruro di argento all'interno.

Assicurarsi che l'elettrodo metallico sia a contatto con la soluzione della pipetta. Il passaggio successivo consiste nell'escindere una membrana "inside-out" dall'oocita preparato. Innanzitutto, individuare al microscopio il margine chiaro dell'oocita.

Utilizzando il manipolatore, avvicinare la pipetta per il patch all'oocita, assicurandosi che sia immersa. Nella soluzione di bagnamento, registrare la resistenza in serie della pipetta. La resistenza in serie ideale della pipetta per il patch è compresa tra uno e 1,5 milliohm quando riempita con la soluzione per la pipetta e immersa nella soluzione di bagnamento.

Ora spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza non raddoppia approssimativamente. Ottenere un sigillo gigaohm applicando una leggera aspirazione con la bocca attraverso un tubo di aspirazione collegato al supporto della pipetta. Dopo aver verificato la formazione di un sigillo gigaohm, stabilizzare la membrana mantenendola a meno 30 millivolt per alcuni minuti.

Per ottenere una membrana interna esterna, escidi la membrana spingendo rapidamente la pipetta più all'interno del sito OO e quindi estraendola delicatamente. La membrana interna esterna è ora pronta per il patch clamping. Sposta la pipetta che contiene la membrana interna esterna a circa 100 micrometri di distanza dall'apertura della punta di perfusione.

Chiudere la valvola elettronica per la raccolta degli scarti e aprire la valvola del serbatoio per la soluzione di perfusione desiderata. Iniziare la registrazione delle correnti attraverso la patch. Modificare la tensione e le soluzioni di perfusione secondo necessità.

Una volta terminata la registrazione, pulire la penna e la punta dei tubicini di perfusione spingendo acqua deionizzata al loro interno per evitare ostruzioni. Le registrazioni ottenute con la tecnica del patch clamp mostrano che i canali BK di tipo selvaggio in una membrana di oocita rispondono sia al voltaggio sia al calcio. Questa figura mostra una registrazione in condizione di zero calcio nominale nella soluzione di perfusione.

Le onde quadre sopra i tracciati della corrente indicano la tensione applicata alla membrana. Sono state applicate quattro tensioni comprese tra 50 millivolt e 200 millivolt, con incrementi di 50 millivolt. La corrente massima, pari a circa due nanoampere, è stata ottenuta con la tensione massima di 200 millivolt.

Questo aumento dell'ampiezza della corrente con l'aumento della tensione ha indicato che la probabilità di apertura dei canali BK aumentava con la tensione. Questa figura mostra la risposta della membrana inside-out a diverse tensioni. Quando era presente un micromolare di calcio nella soluzione di perfusione, sono stati applicati passi di tensione.

Come nella figura precedente, la risposta al gradino di tensione di 200 millivolt, la risposta superiore è aumentata a circa tre nanoampere quando era presente calcio nel Perfu otto, rispetto a due nanoampere in assenza di calcio. Ciò indica che la probabilità di apertura dei canali BK è aumentata in presenza di calcio. In sintesi, questa procedura di patch clamping ha dimostrato che i canali BK dipendono sia dalla tensione che dal calcio.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare l'attivazione del canale del ferro utilizzando la tecnica del patch clamp abbinata a un sistema di alimentazione con pro-combustibile. Ora. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.