Name: Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Impara la tecnica di patch clamp con sistema di perfusione per registrare l'attivazione dei canali BK in ovociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare i meccanismi di attivazione dei canali ionici dipendenti da voltaggio e calcio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute R01-R01-HL70393 e NS060706 a JCJC è Professore di Ingegneria Biomedica sul Spencer T. Olin Endowment.

1. L'iniezione di mRNA in oociti <ol><li> Iniettare ,05-50 ng di RNA messaggero che è stato trascritto in vitro in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI) con Nanoject II Auto-nanoliter Injector (Drummond società Scientific, modello 3-000-204). Ripetere l'iniezione su una decina di ovociti per ogni mRNA. </li><li> Risciacquare gli ovociti iniettati due volte usando ND-96 soluzione (96 mM di cloruro di sodio (NaCl, il signor 58,44 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, il signor 74,56 g / mol), 1,8 mM di cloruro di calcio (CaCl 2 • 2H 2 O , il signor 147,02), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, il signor 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, il signor 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato di sodio (il signor 110,04 g / mol) e 1x penicillina-streptomicina. pH 7,6), poi mettetele in una piastra di coltura e incubare a 18 ° C per 2 giorni +. </li></ol> 2. Preparazione del sistema di perfusione <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Illustrazione del ValveLink Automatizzare 16 Sistema di perfusione. Il sistema di perfusione utilizza l'azoto pressurizzato per spingere soluzioni di perfusione fuori dei serbatoi soluzione, attraverso i tubi di perfusione, e la matita perfusione e mancia escluse. Il flusso di ogni flusso della soluzione di perfusione è controllato da una valvola serbatoio e una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funziona come un raccoglitore così come un meccanismo di rilascio della pressione. (Foto adattato da http://www.autom8.com sito venditore) <ol><li> Collegare i tubi alla matita perfusione. Accendere il controller valvola elettronica e aprire le valvole elettroniche. </li><li> Per garantire che i tubi e la matita perfusione sono liberi di bolle d'aria e di intasare, spingere deionizzata (DI) attraverso ogni tubo usando una siringa riempita con acqua deionizzata. </li><li> Collegare i tubi ai serbatoi soluzione e aprire la valvola della bombola di gas da applicare azoto pressurizzato. </li><li> Aprire il rubinetto serbatoio per riempire il tubo con la soluzione di riserva. Flick la valvola serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione, se necessario. Chiudere la valvola dopo che il tubo è riempito di soluzione. </li><li> Riempire la punta perfusione con acqua e avvitarlo sulla matita perfusione. Fare attenzione a non intrappolare le bolle quando si collega la punta. </li><li> Fissare la matita perfusione allo stadio bagno con plastilina. Assicurarsi che la punta perfusione è in bagno. Il sistema di perfusione è ora impostato. </li><li> Aggiungere acqua deionizzata nella vasca da bagno. Assicurarsi che la punta perfusione è sommerso in acqua. </li><li> Prova che ogni soluzione perfusione esce dalla punta perfusione correttamente. Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo di raccolta dei rifiuti e aprire la valvola per una soluzione di perfusione alla volta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil) -1 - piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + e Mg2 + viene aggiunto alla concentrazione desiderata quando necessario). Sotto il microscopio, osservare il getto di liquido di perfusione che esce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione di perfusione e aprire la valvola per la raccolta dei rifiuti. Il getto perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere la stessa prova per tutte le soluzioni di perfusione. </li><li> Quando hai verificato che tutte le soluzioni di flusso di perfusione correttamente, sostituire acqua distillata nella vasca da bagno con la soluzione (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch di serraggio <ol><li> Ricopertura l'elettrodo di registrazione Ag con AgCl prima di ogni patch di serraggio sessione. In primo luogo, rimuovere il filo elettrodo dal titolare pipetta e immergere la metà punta del filo elettrodo in un flacone di candeggina fresca per almeno 15 minuti. Questo depositi uno strato di AgCl sul filo. </li><li> Sciacquare il filo elettrodo con acqua deionizzata e asciugare. Quindi installare l'Ag / AgCl indietro nel supporto pipetta. </li><li> Collegare il (di riferimento) elettrodo bagno al headstage e posizionarlo nella vasca da bagno. Questo prepara gli elettrodi per la registrazione. </li><li> Ora preparate per l'acquisizione dei dati. Accendere il computer e inserire la chiave hardware alla porta stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegato per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEKA impulsi. </li><li> Accendere l'amplificatore (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e iniziare a HEKA Pulse. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la Scala di stimolo. L'obiettivo per regolare le impostazioni di configurazione è di assicurare che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Questo prepara le apparecchiature di acquisizione dati. </li><li> Preparare ovociti. Immergere l'ovocita in soluzione stripping (200 mm N-Metil-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (senza K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH viene regolato a 7,4 con idrossido di sodio (NaOH, M r 40,0 g / mol) per 5 - 10 min. La soluzione stripping stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile mettere a nudo la membrana vitellina. </li><li> Delicatamente la striscia di membrana vitellina da ovocita usando due paia di pinzette. Un ovocita devitellinized è estremamente fragile e quindi deve essere spostato il meno necessario. </li><li> Avendo cura di evitare di esporre l'ovocita devitellinized a bolle d'aria o, usare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l'ovocita al bagno. Questo prepara l'ovocita per la registrazione. </li><li> Preparare pipette patch. Tirare le pipette di vetro dopo aver inserito un tubo capillare di vetro (VWR International, Cat # 53432-921) in una Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipetta Puller. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e diametro di apertura. Il diametro di apertura dovrebbe essere di 2-4 micrometri. </li><li> Per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e per garantire una punta liscia, cappotto la punta con la cera e poi il fuoco-polacco. </li><li> Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all'interno della soluzione di pipetta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) e il disegno lo stantuffo. Questo bagna la punta. </li><li> Riempire la pipetta 1 / 3 pieno con una soluzione pipetta usando una siringa e inserire la pipetta nel supporto pipetta con l'Ag / AgCl all'interno elettrodo e contatto con la soluzione di pipetta. Questo prepara la pipetta di patch. </li><li> Per accise uno inside-out patch dal ovocita preparato, trovare il chiaro vantaggio di ovociti al microscopio. Spostare la pipetta di patch vicino al ovociti mediante manipolatore. Registrare la resistenza di serie pipetta. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. </li><li> Spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza raddoppia. </li><li> Applicare aspirazione delicato per la membrana per via orale attraverso un tubo di aspirazione che è collegato al titolare pipetta fino a quando un giga ohm sigillo è ottenuto. Stabilizzare la patch tenendolo in tensione -30 mV per un paio di minuti. </li><li> Per ottenere un inside-out patch, la patch da accise rapidamente spingendo la pipetta ulteriormente nel citoplasma dell'ovocita e poi delicatamente tirando fuori. </li><li> L'inside-out patch è ora pronto per il bloccaggio. Spostare la pipetta tenendo la inside-out patch per circa 100 micron di distanza dall'apertura della punta perfusione. </li><li> Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola serbatoio per la soluzione di perfusione desiderato </li><li> Iniziare a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e perfusione come desiderato. </li><li> Quando si è finito di registrare, pulire la perfusione tubi, matita e punta spingendo attraverso l'acqua deionizzata per evitare intasamenti. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Durante la preparazione di ovociti per la patch clamp, il trattamento 5-10 min di soluzione stripping sarebbe staccare la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile togliere la membrana vitellina. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. Che segue è una registrazione rappresentante della wild-type canali BK su una patch di membrana dell'ovocita. In alto a sinistra, le onde quadre indicano la tensione applicata la patch - il secondo passo di aumenti di tensione da 50 mV a 200 mV con incrementi di 50 mV. Di seguito le tracce corrispondente corrente quando la soluzione di perfusione è nominale 0 Ca 2 + (libero [Ca 2 +] è di circa 0,5 nM). L'apiega di ampiezza della corrente indica che la probabilità di apertura dei canali BK aumenta con la tensione. Sul lato destro, la stessa patch è perfuso con 1.0 mM Ca 2 + quando è applicato con il protocollo stessa tensione. L'ampiezza della corrente aumenta di più sotto la stessa tensione, indicando che la probabilità aumenta con l'aperta [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
<li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li>
<li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mg2%2B+enhances+the+function+of+BK-type+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li>
<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
<li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2%2B-dependent+activation+of+BK-type+mslo1%5BTitle%5D)+AND+%22K%2B+channels.+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li>
<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazioni...

<table><tbody><tr><td>Iniettore automatico di nanolitri Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette P-97 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione e controllore elettronico</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Diametro interno della punta di perfusione: 100 micrometri</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di vetro</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia per computer</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Testa amplificatrice (headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp e tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni espresso in xenopus ovociti

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l&#39;attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca 2 +-attivati ​​K + (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori 1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori 2-6. BK canali sono attivati ​​da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca 2 + e Mg 2 + 6-9. Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l&#39;RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C 10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l&#39;inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp 10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l&#39;attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l&#39;mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine ​​canale sulla membrana dell&#39;ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Il protocollo qui presentato è progettato per studiare l'attivazione dei canali K+ a grande conduttanza, attivati dal voltaggio e dal Ca2+ (BK). Il protocollo può...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attivazione del canale BK in condizioni di tensione controllata, controllando al contempo la soluzione intracellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto esprimendo i canali BK in Xenopus Cytes mediante iniezione di mRNA del canale BK. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare il sistema di perfusione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel formare un sigillo giga tra la membrana dell'oocita e la pipetta per il patch. L'ultimo passaggio della procedura è l'escissione della porzione di membrana. Alla fine, i risultati ottenuti utilizzando la tecnica del patch clamp abbinata a un sistema di perfusione mostrano che i canali BK vengono attivati da variazioni di tensione e di concentrazione di calcio.Ciao, sono Jin Cho Young del laboratorio del Dott. Jamie Zu presso l'Università di Washington. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, inclusi interrogativi riguardanti il meccanismo molecolare dell'attivazione dei canali ionici. Cominciamo dunque.Il primo passaggio della procedura inizia alcuni giorni prima della tecnica del patch clamping e utilizza u

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Dimostreremo come studiare l'effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

Descriviamo un metodo per quantificare l'attività delle ATPasi di tipo P che controtrasportano K+ mediante l'espressione eterologa degli enzimi negli ovociti di Xenopus e misurando l'assorbimento di Rb+ o Li+ nelle singole cellule mediante spettrofotometria di assorbimento atomico. Il metodo è un'alternativa sensibile e sicura agli esperimenti di flusso di radioisotopi, facilitando studi cinetici complessi.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

L'approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Impara la tecnica di patch clamp con sistema di perfusione per registrare l'attivazione dei canali BK in ovociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare i meccanismi di attivazione dei canali ionici dipendenti da voltaggio e calcio.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Esplora altri video