Agar-Block Microcosmi per decomposizione controllata tessuti vegetali da Funghi aerobica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di inoculare un fungo aerobico che degrada il legno in un microcosmo a piastra di Petri in cui l'umidità del legno e i substrati esogeni sono strettamente controllati. Ciò si ottiene preparando prima i microcosmi con volumi esatti di edia noti. Quindi il legno da degradare e tutti i substrati solidi esogeni vengono assemblati sopra una griglia di plastica sulla superficie agricola senza consentire il contatto tra i substrati.

Il microcosmo viene quindi inoculato e incubato con il fungo in esame. Dopo l'incubazione, i blocchi di legno vengono raccolti per determinare la perdita di massa e preparare i tessuti per le analisi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il grado di biodegradazione del legno e il ruolo delle fonti di elementi esogeni attraverso misurazioni della perdita di massa, osservazioni della morfologia miceliale e analisi elementari mirate come la spettroscopia al plasma accoppiato induttivamente.

Ciao, mi chiamo Brooke Jacobson del laboratorio del Dr.Jonathan Schilling presso il Dipartimento di Bioprodotti e Ingegneria dei Biosistemi dell'Università del Minnesota. Oggi vi mostreremo una procedura per l'utilizzo di piastre di Petri come microambienti per la decomposizione dei tessuti vegetali da parte di funghi aerobici. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi di decomposizione della lignocellulosa fungina.

La lignocellulosa è il tessuto vegetale composto da lignina, cellulosa ed emicellulosa. Il tessuto che studiamo più spesso è il legno: gli errori con gli aspetti meno tecnici del design del blocco della coclea sono le cause più comuni di guasto e le principali fonti di variabilità tra gli studi, rendendo utile la pubblicazione video della nostra configurazione del blocco della coclea. Sappiamo per esperienza che questa procedura produce risultati di alta qualità e bassa variabilità.

Quindi iniziamo. Per questi esperimenti, usa piastre di Petri più profonde di un centimetro rispetto alle tipiche piastre di Petri per aumentare lo spazio di testa sopra il blocco di legno. Nel microcosmo.

Inizia la preparazione del microcosmo preparando abbastanza edia per 20 millilitri per piastra di Petri per ottenere calcio e ferro liberi. Tipo a agar a 15 grammi di agar in un matraccio tarato da 500 millilitri contenente circa 400 millilitri di acqua deionizzata modificata con integratori. Utilizzare soluzioni madre precedentemente preparate per aggiungere micronutrienti alla miscela.

Una volta aggiunti i nutrienti, riempire il matraccio tarato fino alla linea da 500 millilitri. Quindi, trasferire il supporto in un pallone da 1000 millilitri. L'autoclave a 121 gradi Celsius e 16 PSI per 20 minuti.

Fare attenzione a non superare un volume di 500 millilitri per pallone per evitare che l'agri solidifichi prima della somministrazione delle piastre di prova. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare il supporto al tatto per ridurre al minimo la condensa. Ridurre al minimo l'umidità è fondamentale in questi esperimenti poiché il contenuto di umidità o mc.

Oltre l'80% causerà anossia nei tessuti. Limita il decadimento da parte dei funghi aerobici e aumenta la variabilità una volta. Bello. Utilizzare un pipettatore portatile e pipette sterili in polistirene da 10 millilitri per asetticamente.

Trasferire l'agar in una pila alta di piastre in una cappa di biosicurezza. Successivamente, tagliare generosamente le griglie di rete di plastica per adattarle all'interno del fondo della piastra. Dopo aver tagliato e lavato accuratamente le griglie con acqua e sapone, preparare le griglie a rete per l'asciugatura e la sterilizzazione in autoclave per questa dimostrazione.

Viene utilizzato il pino giallo meridionale o SYP in quanto rappresenta un'importante fonte di legname. Nelle abitazioni residenziali negli Stati Uniti, utilizzare legname non trattato e tagliare blocchi liberi da nodi di 19 per 19 millimetri da un unico taglio longitudinale lungo la venatura. Tagliare questa lunghezza in blocchi cubici di 19 millimetri.

Dividere i blocchi cubizzati da 19 millimetri a metà lungo la venatura usando uno scalpello e un martello invece di una sega. In questo modo si ottiene un bordo ruvido del blocco da riguardare verso il basso sulla rete di plastica nel microcosmo del blocco agricolo e un bordo superiore liscio da etichettare. Etichettare il bordo liscio dei blocchi con una matita, tagliare abbastanza blocchi per soddisfare i trattamenti, così come i controlli non inoculati che serviranno sia come monitor di contaminazione che come campioni di dati di base condizionati in parallelo per il materiale essiccato in forno, posizionare i campioni in vaschette di siero di latte di alluminio e in un forno a convezione a 100 gradi Celsius per 48 ore.

Trasferire i campioni dal forno ad un essiccante per raffreddarli una volta. Bello. Pre-pesare i campioni per determinare il peso secco iniziale del forno. Infine, preparare i campioni, comprese le griglie di plastica e il legno per l'autoclave, avvolgendoli strettamente con un foglio per ridurre al minimo la bagnatura.

Ciò non richiede che ogni campione sia avvolto singolarmente, ma che l'esposizione al vapore sia bassa e costante. Autoclavare i campioni etichettati a 121 gradi Celsius e 16 PSI per un'ora. In una cappa di biosicurezza sterile, assemblare AE vuoti, una piastra di origine per materiali esogeni del substrato vegetale a rete per inoculo, strisce di paraforma per pennarello, pinze e strumenti di trasferimento.

Il passo successivo dell'inoculazione consiste nell'aggiungere gli articoli all'agri, contenere le piastre di Petri per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Strumenti di trasferimento della fiamma e pinze con etanolo al 95% man mano che vengono utilizzati. Per prima cosa, aggiungi la rete di plastica alla capsula di Petri.

Quindi aggiungi qui il substrato di legno. Lungo la lunghezza della maglia vengono aggiunti due blocchi di legno in modo che i dati possano essere abbinati dai raccolti precoci e tardivi. Questi blocchi vengono aggiunti fianco a fianco con il grano e rivolti verso la punta della fonte dell'inoculo fungino.

Quindi, aggiungi i materiali esogeni. Qui. Il ruolo del gesso è in fase di sperimentazione sul decadimento da parte di un fungo filamentoso. Pertanto, il fungo dovrebbe incontrare questi dischi di gesso prima di raggiungere il legno.

Un disco di gesso viene aggiunto tra ogni blocco e il punto di inoculo sulla parte superiore della rete. Fare attenzione ad evitare il contatto tra i dischi nel legno mantenendoli vicini tra loro. Per l'inoculo fungino, usa un sughero boero numero quattro con un diametro di sette millimetri per fare tappi da colture di due settimane coltivate in 20 millilitri di agar.

Questo aiuta a controllare il volume dell'inoculo. Per i controlli non inoculati, è meglio aggiungere un tappo da una piastra sterile. Non permettere il contatto tra l'inoculo e i substrati esogeni o il legno, ma posizionarli vicini.

Utilizzare un tappo di inoculo per blocco. Sigillare i piatti con il param che è stato tagliato con un rasoio, tenere le piastre orizzontali e avvolgere il param con un movimento continuo e regolare. Infine, etichettare i coperchi dei piatti utilizzando un pennarello resistente all'alcol che etichetta i numeri di blocco direttamente sui rispettivi substrati.

Disegna anche dei cerchi sui dischi di gesso. Trasferire con cura le piastre in un incubatore biologico per evitare di spingere il contenuto e per ridurre al minimo la condensa dovuta alle fluttuazioni di temperatura. Le condizioni utilizzate qui sono a 20 gradi Celsius e al buio eseguono raccolte di serie temporali in modo asettico ad eccezione dell'ultimo raccolto.

Al punto di raccolta della quinta settimana, rimuovere l'intero lotto di trattamento. Spruzzare ogni fondo e parte superiore con etanolo al 70% e utilizzare una pinza fiammata per rimuovere il materiale all'interno della cabina di biosicurezza. Scatta foto prima di distruggere le piastre agricole, concentrandoti su qualsiasi morph F o melone.

Quindi rimuovere i blocchi da trattare. Arrotolare via il phas in eccesso, ma fare attenzione a non perdere il materiale in decomposizione del forno. Asciugare i blocchi in pentole di alluminio e determinare la perdita di massa utilizzando i pesi freschi e asciutti dei controlli per monitorare l'eccessiva traspirazione.

I dati sulla perdita di massa aiutano a valutare l'andamento del decadimento e sono dati importanti. Se le concentrazioni elementari devono essere calcolate in base al peso in grammi, i dati percentuali devono essere normalizzati. Per le statistiche, etichettare e tenere traccia di eventuali blocchi marrone scuro, che sono chiaramente impregnati d'acqua.

Infine, distruggere le colture in sacchetti autoclavabili, risparmiando la rete di supporto in plastica e qualsiasi altro componente che possa essere riciclato per l'uso in esperimenti futuri. Utilizzando la configurazione del microcosmo a blocchi agri, i blocchi di legno di pino poggiano su una rete di plastica per elevare i blocchi al di sopra del contatto con l'agri. Le gru circolari crescevano a diretto contatto con le superfici di gesso e nei blocchi di legno.

Questo micelio rappresenta un'importante connessione tra il legno e le fonti di elementi nutritivi esogeni. Nel controllo di queste fonti di materiale esogeno nell'agar o in un materiale solido è un vantaggio chiave di un design a blocchi agricoli rispetto alla perdita di peso percentuale media del design a blocchi di terreno come misura dell'entità del decadimento del legno da parte di ser crain's dopo cinque e 15 settimane. L'incubazione con il pino in microcosmi a blocchi agricoli è mostrata qui.

I trattamenti non erano nessuno. Cinque millimolari di cloruro di calcio aggiunti all'agar più del 99% di gesso puro o dell'1% di gesso modificato con ferro per ogni raccolto le barre sotto la stessa lettera non sono significativamente diversi. Con le barre di errore che rappresentano la deviazione standard, è stata osservata una perdita di peso superiore al 60% nei blocchi di pino marcio marrone di controllo, che soddisfa l'obiettivo standard dell'American Society for Testing and Materials di un decadimento superiore al 50%.

Il coefficiente medio di variazione del decadimento era 0,055 alla settimana 16. Oltre alla bassa variabilità, è stato osservato un effetto del trattamento. Il decadimento fungino è stato inibito con l'aggiunta di calcio, sia all'agar come cloruro di calcio che come gesso puro.

È interessante notare che i tassi di decadimento rimbalzano con l'aggiunta di ferro al gesso. Suggerire che il ferro non il calcio è fondamentale nell'osservare le cinque repliche alla settimana 15 di decadimento. Dallo stesso marciume bruno, fungo di prova, lamine circolari, il colore dei miceli rivela mein.

Differenze nelle ife esterne tra i trattamenti, i blocchi sono stati rimossi e asciugati. Rivelando la mancanza di mein nel trattamento senza calcio. L'ingiallimento nei trattamenti di calcio puro e l'aspetto della ruggine nel trattamento di modifica del ferro.

Il controllo rappresenta blocchi non inoculati per il confronto. È interessante notare che gli effetti mein si perdono utilizzando un mezzo ad alto contenuto di ferro. Collettivamente, suggerisce che questo fungo utilizza il ferro, non il calcio.

In questi materiali, ti abbiamo appena mostrato come utilizzare una configurazione a blocco di coclea per testare con successo la biodegradazione dei tessuti vegetali da parte di funghi filamentosi aerobici. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare che i substrati entrino in contatto tra loro, in particolare il tessuto vegetale e la coclea, ridurre al minimo il contenuto di umidità dalla coclea e dalle piastrine, e ricontrollare per assicurarsi che il contenuto di ciascuna piastra non si sia spostato prima dell'incubazione. Tenendo a mente queste variabili, è possibile controllare l'ambiente di decadimento molto meglio di quanto si possa fare quando si utilizza una configurazione a blocchi di terreno.

È possibile generare dati con una potenza statistica necessaria per rispondere alle domande della ricerca. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.