Name: A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Scopri un metodo efficiente per formare biofilm di Candida albicans su piastre a 96 pozzetti e valutarne la suscettibilità agli antifungini. Questa tecnica riproducibile e economica facilita la ricerca in micologia medica.

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Biofilm attività relative al laboratorio è finanziata da sovvenzioni numerati R21DE017294 e R21AI080930 dal National Institute of Dental Research &amp; cranio-facciali e l&#39;Istituto nazionale per le allergie e malattie infettive (a JLL-R.). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIDCR, il NIAID o il NIH.

1. Preparazione di C. albicans C. albicans è un microrganismo Group Risk 1/BSL1. Ricordate sempre di usare buone tecniche asettiche / sterile per lavorare con questo microrganismo e seguire le procedure istituzionali per il corretto smaltimento dei materiali a rischio biologico. <ol><li> Preparare una cultura durante la notte di C. albicans in YPD (Lievito peptone destrosio) mezzo liquido inoculando una singola colonia di C. albicans in 25 ml di YPD. </li><li> Incubare cultura in un agitatore orbitale (circa 180 giri al minuto) a 30 ° C durante la notte. La maggior parte C. albicans ceppi crescerà come cellule di lievito in queste condizioni. </li><li> Centrifugare le culture durante la notte (circa 3.000 rpm, 5-10 minuti), lavare le cellule due volte con PBS sterile e risospendere il pellet in finale di circa 20-25 ml di RPMI 1640 medium tamponato con l'acido mm 165 morpholinepropanesulfonic a pH 7,0 e pre-riscaldata a 37 ° C (da ora in poi questo mezzo è definita semplicemente come "RPMI 1640"). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dopo il conteggio, preparare una sospensione di cellule ad una densità finale di 1,0 x 10 6 cellule / ml in RPMI 1640. Nota: Poiché le cellule hanno la tendenza ad aggregarsi, è importante vortice vigorosamente tra lavaggi e prima di pipettaggio. </li></ol> 2. Impostazione del 96-ben micropiastra per la formazione del biofilm <ol><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di C. sospensione albicans nei pozzetti selezionate del-96 e micropiastra (-s). Non aggiungere alle cellule di pozzi in colonna 12, in quanto questi serviranno come controlli negativi. </li><li> Coprire l'intera piastra microtiter con il suo coperchio originale, sigillare con parafilm, posto all'interno di un incubatore e incubare per 24 ore a 37 ° C. La lunghezza di incubazione può essere adattata alla struttura specifica sperimentale. Per esempio, è possibile esaminare la cinetica della formazione di biofilm in un periodo di 24 - 48 ore dalla semina placche multiple e l'elaborazione di un piatto in momenti diversi (es. 2, 4, 8, 12, 24 e 48 ore) </li><li> Dopo la formazione di biofilm, utilizzando una pipetta multicanale aspirare il terreno con attenzione per non toccare e disturbare il biofilm che si sono formati in ciascuno dei pozzi. </li><li> Usando una pipetta lavare piatti multicanale tre volte in PBS sterile (200 ul per pozzetto). In alternativa, utilizzare un sistema automatico lavaggio micropiastra. Tra un lavaggio, e in particolare dopo l'ultimo lavaggio, le piastre di scarico in posizione invertita tamponando con carta assorbente per eliminare ogni residuo PBS. A questo punto biofilm formato sul fondo dei pozzetti deve essere chiaramente visibile anche ad occhio nudo e possono anche essere visualizzati utilizzando un microscopio invertito (Figura 1). Biofilm sono ora pronti per essere elaborati per le analisi antimicotico test di sensibilità. (Se lo scopo principale dell'esperimento è quello di valutare l'entità della formazione di biofilm, i piatti sono pronti per essere trattati con il metodo colorimetrico. Per questo, il XTT / menadione reagente (vedi punto 3 di seguito) possono essere aggiunti e il colore risultante letti utilizzando un lettore di micropiastra). </li></ol> 3. Test di suscettibilità antifungina di biofilm <ol><li> Dalle soluzioni stock o in polvere, preparare una soluzione di lavoro in RPMI 1640 medium di ogni antimicotico da testare. Tipici livelli di concentrazione elevati 1.024 mg / ml per fluconazolo, e 16 mg / ml per entrambe le amfotericina B e caspofungin. Altre concentrazioni possono essere utilizzati per diversi agenti. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri della alta concentrazione di lavoro antimicotica nei pozzetti corrispondenti nella colonna 1 di ogni micropiastra contenente biofilm fungine. </li><li> Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 in ciascun pozzetto in colonne da 2 a 10. </li><li> Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 ai pozzi nella colonna 11. </li><li> Rimuovere 100 l di agente antimicotico dai pozzetti di colonna 1 e aggiungere ai pozzetti delle colonne 2 (già contenente 100 ml di media). </li><li> Mescolare il contenuto ben pipettando su e giù per eseguire una diluizione seriale raddoppio, e rimuovere le punte. </li><li> Ripetere il movimento a destra fino a quando i pozzi di colonna 10, dopo di che viene eliminato l'ultimo volume di 100 microlitri dai pozzetti della colonna 10 dopo la miscelazione. In questo modo, una serie di doppie diluizioni del vostro agente (-s) di interesse sono stati creati, da più concentrata in pozzetti di colonna 1 al meno concentrato in pozzetti di colonna 10. Biofilm incontrastato nella colonna 11 serviranno come controlli positivi, e pozzi vuoti nella colonna 12 serviranno come controlli negativi. </li><li> Coprire le piastre con i loro coperchi, sigillare con parafilm e incubare per 24 -48 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo il periodo di incubazione lavare i piatti, come nel passo 2,4 prima (3 x PBS). </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di XTT / menadione soluzione in ogni pozzetto contenente una pre-lavati biofilm nonché di pozzetti di controllo negativo per la misura di X sfondoTT-colorimetrico livelli. <ol><li> Il XTT è pronta come una soluzione satura a 0,5 g / L in sterile di Ringer lattato, PBS o soluzione salina, che deve essere sterilizzata per filtrazione con un 0,22 micron, dimensioni dei pori del filtro. La soluzione XTT è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere coperto con un foglio di alluminio durante la preparazione. Una volta preparato e sterilizzata per filtrazione, aliquota in 10 ml di volume di lavoro, e conservare a -70 ° C. Proteggere i tubi di luce utilizzando un foglio di alluminio. Scongelare solo come tubi quante necessarie per un particolare esperimento appena prima dell'uso. </li><li> Menadione è pronta come una soluzione al 10 mM magazzino in 100% acetone, frazionare in piccoli volumi (circa 50 mL) e conservati a -70 ° C. Preparare il XTT / menadione soluzione al momento dell'uso, con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre di menadione in una provetta contenente 10 mL della soluzione XTT scongelati. </li></ol></li><li> Coprire le piastre in alluminio ed incubare al buio per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Scoprire i piatti. Utilizzando una pipetta multicanale eliminare l'80 l di supernatante risultante colorate da ogni pozzetto e trasferire nei pozzetti corrispondenti della micropiastra nuovo. </li><li> Leggere la piastra (-s) in un lettore di micropiastre a 490 nm. </li><li> Calcolare il sessili concentrazioni minime inibenti SMIC50 e SMIC80, che sono le concentrazioni antimicotico in cui vengono rilevati il ​​50% o 80% di diminuzione nella lettura colorimetrica in confronto al controllo biofilm formati in assenza di farmaci antifungini (in questo caso i valori di colonna 11 , ricordate anche per sottrarre i valori da controlli negativi da pozzi nella colonna 12 contenente XTT solo). Risultati SMIC può essere presentato come una tabella (isola cioè multipla nei confronti delle antimicotici multipla) o, in alternativa, i risultati per ogni singolo fungine isolare l'uno contro l'antimicotico può essere presentato come un grafico disegnando inibizione per cento rispetto concentrazione antimicotico. </li></ol> Esempio: Dopo aver sottratto i valori del controllo negativo, il valore medio dei biofilm di controllo formata in colonna 11 è 1,32. Il SMIC50 è la più bassa concentrazione antimicotico che porta ad una riduzione&gt; 50% nelle letture colorimetrici, in questo caso meno di 1,32 x 50/100 = 0.66. Allo stesso modo, il SMIC80 è la più bassa concentrazione antimicotico che porta ad una riduzione&gt; 80% nelle letture colorimetrici, in questo caso meno di 1,32 x 20/100 = 0,264. 4. Rappresentante Risultati La figura 1 mostra una Microfotografia di una C. albicans biofilm formato sul fondo di un pozzo in una piastra da 96 microtitolazione preso bene utilizzando un microscopio invertito. La Figura 2 mostra XTT-colorimetrico letture (OD 490 valori) per ciascuna di 11 biofilm di C. ceppo di tipo selvatico albicans formate in ciascuna delle 8 righe diverse dello stesso 96 micropiastra bene. La figura 3 mostra l'attività di amfotericina B in funzione della concentrazione contro C. albicans biofilm; frecce indicano SMIC50 e SMIC80 valori. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Un pannello mostra un Microfotografia scattate con una videocamera collegata ad un microscopio invertito di C. albicans biofilm formata sul fondo del pozzo dopo l'aspirazione di medie RPMI e successivi lavaggi con PBS. (B) Una microfotografia di un tipico C. albicans biofilm visualizzati usando la microscopia elettronica a scansione. I bar sono 100 micron e 10 micron per i pannelli A e B rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Formazione di molteplici equivalente C. albicans biofilm in piastre da 96 pozzetti microtiter. letture colorimetriche (OD 490 valori) da XTT riduzione analisi dei biofilm formato da una C. albicans tipo selvatico in pozzetti di piastre microtiter. I valori sono per 11 biofilm indipendente formata in ciascuna delle 8 righe diverse dello stesso 96 micropiastra bene. Risultati per le varie file sono stati confrontati con una analisi della varianza e utilizzando il test della Bartlett per l'omogeneità delle varianze e confronto multiplo del Bonferroni post-test. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata notata nel confronto tra tutte le coppie di righe tra loro (p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Risultati tipici di test di suscettibilità antifungina contro C. albicans biofilm. grafico raffigurante risultati tipici della efficacia di differenti concentrazioni di amfotericina B contro i biofilm di C. albicans ceppo selvatico. I valori sono espressi come valori colorimetrici per cento in media d'XTT riduzione test rispetto al controllo pozzi. SMIC50 e SMIC80 valori sono indicati da frecce.

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</ol>

JLL-R possiede partecipazioni in MicrobeHTS Technologies, Inc., che sta sviluppando agenti antifungini. MicrobeHTS Technologies, Inc. ha fornito alcun supporto finanziario per questi studi.

Qui si descrive un semplice, rapido, economico e altamente riproducibili 96 pozzetti modello micropiastre per la formazione di biofilm Candida accoppiato con un metodo colorimetrico che misura l&#39;attività metabolica delle cellule all&#39;interno del biofilm utilizzando XTT. Questo modello ben 96 micropiastre per la formazione di biofilm è stato originariamente sviluppato per C. albicans ma può essere utilizzato per altre Candida spp. e facilmente adattato per altri organismi fungini. Il met...

<table><tbody><tr><td>Agar Sabouraud-dextrosio</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Per preparare piastre per subcolture fresche di isolati fungini</td></tr><tr><td>YPD: peptone di lievito con dextrosio</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Mezzo per la propagazione di colture liquide notturne</td></tr><tr><td>RPMI-1640 senza bicarbonato di sodio, integrato con L-glutammina</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Mezzo liquido per la formazione di biofilm</td></tr><tr><td>Acido morfolinopropanosolfonico (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Per tamponare l'RPMI 1640</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tampone per lavaggi</td></tr><tr><td>Sale sodico di XTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Vedi sopra per le istruzioni di preparazione</td></tr><tr><td>Lattato di Ringer&amp;rsquo;s</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Per la preparazione della soluzione di XTT</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Attenzione: pericoloso per contatto cutaneo, inalazione o ingestione</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml per centrifuga</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml per centrifuga</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Piastre microtitolazione a 96 pozzetti: in polistirene, fondo piatto, trattate per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale e punte</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore per piastre microtitolazione</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a 96 beh microtest piastra a base di metodo per la formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini candida albicans biofilm

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans rimane la causa più frequente di infezioni fungine in una popolazione in espansione di pazienti compromessi e candidosi è ora la terza più comune infezione negli ospedali degli Stati Uniti. Diverse manifestazioni della candidiasi sono associati con la formazione di biofilm, sia su tessuti dell&#39;ospite e / o dispositivi medici (cateteri per esempio). Formazione di biofilm svolge negative implicazioni cliniche, come le cellule all&#39;interno del biofilm sono protetti dalla risposta immunitaria e dall&#39;azione di antimicotici. Abbiamo sviluppato un modello semplice, veloce e robusto in vitro per la formazione di C. biofilm albicans con 96 pozzetti per microtitolazione piastre, che può anche essere utilizzato per test di suscettibilità biofilm antimicotico. La lettura di questo saggio è colorimetrico, basato sulla riduzione delle XTT (un sale di tetrazolio) da cellule metabolicamente attive biofilm fungine. Un tipico esperimento dura circa 24 ore per la formazione di biofilm, con ulteriori 24 ore per i test di suscettibilità antifungina. A causa della sua semplicità e l&#39;utilizzo di materiali di laboratorio e attrezzature comunemente disponibili, questa tecnica democratizza ricerca biofilm e rappresenta un passo importante verso la standardizzazione dei test di suscettibilità antifungina di biofilm fungine.

Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione di<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilm su 96 micropiastre bene e la sua utilità nei test di suscettibilità antifungina di cellule all&#39;interno di biofilm.

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

Candida albicans rimane la causa più frequente di infezioni fungine in una popolazione crescente di pazienti immunocompromessi e la candidiasi rappresenta ormai la terza...

L'obiettivo generale di questa procedura è formare biofilm di Candida albicans ed esaminarne la suscettibilità agli agenti antifungini. Questo viene ottenuto formando inizialmente questi biofilm fungini nei pozzetti di piastre microtitolatrici a 96 pozzetti, quindi aggiungendo antifungini ai biofilm preformati e incubando per 24-48 ore dopo questa incubazione.Viene utilizzato un metodo colorimetrico che misura l'attività metabolica delle cellule all'interno dei biofilm per valutare l'attività di questi antifungini, al fine di stabilire la concentrazione minima inibitoria degli antifungini nei confronti dei biofilm. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la capacità di formazione di biofilm e la suscettibilità agli antifungini mediante un semplice e pratico metodo basato su una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti abbinata a una lettura colorimetrica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice, relativamente economica, altamente riproducibile e consente la formazione di numerosi biofilm equivalenti.Inoltre, è compatibile con la tecnologia a piattaforma a 96 pozzetti comunemente disponibile nella maggior parte dei laboratori di ricerca e clinici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei canidi. Poiché molto spesso queste infezioni sono associate alla formazione di biofilm.Utilizzando tecniche corrette di manipolazione microbiologica, prelevare un'ansa piena di cellule da una sottocoltura fresca di albicans su una piastra di SAU dextrosio rame e inoculare in un matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri contenente 25 millilitri di brodo di pepatone di lievito con dextrosio. Posizionare la coltura in uno shaker orbitale impostato a 180 RRP M e 30 gradi Celsius, e incubare per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna, versare le colture di lievito in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 3000 RBM per cinque-dieci minuti. Scartare il soprannatante e vorticare.Risospendere vigorosamente il pellet per disgregare le cellule. Quindi aggiungere PBS sterile per lavare prima di centrifugare nuovamente le colture. Ripetere questo passaggio di lavaggio un'altra volta prima di risospendere nuovamente le cellule.In circa 20 millilitri di RPMI 1640, mezzo tamponato a pH 7,0. Utilizzando una soluzione di mops 165 millimolare e preriscaldata a 37 gradi Celsius, preparare da questa sospensione una diluizione uno a 100 mediante un emocitometro standard e un microscopio a campo chiaro. Contare le cellule.Quindi preparare una sospensione finale di cellule a un milione per millilitro in RPMI 1640 tamponato e tiepido. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di sospensione di Candida albicans nei pozzetti selezionati di una piastra microtitolatrice sterile da 96 pozzetti con fondo piatto. Lasciare vuoti i pozzetti della colonna 12, poiché fungeranno da controlli negativi.Dopo aver coperto e sigillato la piastra con parafilm, incubarla a 37 gradi Celsius per 24 ore per consentire la formazione dei biofilm. Al termine dell'incubazione, aspirare delicatamente e scartare il mezzo da ogni pozzetto, avendo cura di non disturbare i biofilm formati sul fondo.Aggiungere 200 microlitri di PBS in ogni pozzetto e rimuoverli capovolgendo con attenzione la piastra e tamponandola su un mucchio di fazzoletti di carta. Ripetere questa operazione di lavaggio tre volte. A questo punto, i biofilm sono visibili ad occhio nudo e possono essere osservati mediante microscopio invertito utilizzando la SEM.Si può osservare che i biofilm consistono in una miscela intrecciata di filamenti e cellule di lievito. Una volta verificata la formazione del biofilm, si può iniziare la sperimentazione con agenti antifungini utilizzando il mezzo RPMI 1640 tamponato, preparando soluzioni di lavoro ad alta concentrazione degli agenti antifungini da testare. Le concentrazioni tipiche elevate sono di 1024 microgrammi per millilitro per il fluconazolo e di 16 microgrammi per millilitro per l'amfotericina B e CASPO fungi beri.Successivamente, aggiungere 200 microlitri di soluzioni antimicotiche nei pozzetti della colonna uno e 100 microlitri di RPMI 1640 tamponato. Aggiungere il mezzo nei pozzetti delle colonne da due a undici. Eseguire una serie di diluizioni seriali raddoppiate trasferendo 100 microlitri delle soluzioni antimicotiche ad alta concentrazione dai pozzetti della colonna uno a quelli della colonna due.Dopo aver pipettato delicatamente su e giù per mescolare, trasferire 100 microlitri dalle pozzette della colonna due a quelle della colonna tre e così via fino alla colonna 10. Non aggiungere alcuna soluzione antifungina alla colonna 11, poiché fungerà da controllo positivo, e scartare gli ultimi 100 microlitri dalle pozzette della colonna 10. Tutte le pozzette, tranne quelle della colonna 12.Dovrebbe ora essere presente un volume finale di 100 microlitri. Coprire la piastra, sigillarla con parafilm e incubare a 37 gradi Celsius per 24-48 ore per consentire l'azione degli antifungini dopo l'incubazione. Dopo aver lavato la piastra tre volte in PBS come precedentemente descritto, aggiungere 100 microlitri di soluzione XTT medion per pozzetto in tutti i pozzetti, inclusi quelli del controllo negativo.Nella colonna 12. Coprire la piastra, avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, svolgere la piastra per consentire lo sviluppo del colore.La soluzione inizialmente chiara di XTT sarà diventata arancione dopo essere stata elaborata da cellule metabolicamente attive. Trasferire 80 microlitri dei supernatanti colorati in una nuova piastra microtitolatrice a fondo piatto. Utilizzare un lettore colorimetrico per piastre microtitolatrici impostato alla lunghezza d'onda di 490 nanometri per leggere la piastra come mostrato qui. In assenza di antimicotici, le letture colorimetriche non sono state trattate.I biofilm dei diversi ceppi SEA sono equivalenti. Per valutare innanzitutto l'effetto dei composti antifungini testati, sottrarre da tutti gli altri valori la media del fondo ottenuta dai pozzetti del controllo negativo nella colonna 12. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione utilizzando i controlli positivi della riga 11.Come valori massimi, le concentrazioni antifungine alle quali si osserva una riduzione del 50% o dell'80% nei valori colorimetrici sono note come concentrazioni minime inibitorie di Cecil. Questi valori sono generalmente utilizzati come misura di riferimento per la potenza di un composto. Mediante questo semplice metodo ad alto rendimento, i biofilm fungini possono essere formati in vitro in 24 ore e composti selezionati possono essere sottoposti a screening per valutarne l'attività antifungina dopo lo sviluppo iniziale.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della micologia medica per esplorare la formazione del biofilm e per esaminare l'attività degli agenti antifungini. Ancora una volta, le cellule nei biofilm.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Abbiamo sviluppato una piattaforma ad alta densità microarray costituito da nano-3D di...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino

Questo video mostra un test in vitro per lo screening di composti antifungini utilizzando un test di microdiluizione del brodo. I composti in esame vengono diluiti in serie in una piastra per microtitolazione e incubati con un inoculo fungino. Dopo l'incubazione, la piastra viene esaminata alla ricerca di pozzetti senza crescita fungina visibile per valutare il potenziale antimicotico dei composti in esame e la loro concentrazione minima inibitoria (MIC).

Un saggio di microdiluizione in vitro del brodo per lo screening di composti antifungini

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare l'effetto degli anticorpi sui biofilm fungini. Il fungo patogeno Candida tropicalis secerne un fattore di virulenza secreto dall'aspartilproteinasi 2 (Sap2), facilitando la formazione di biofilm. Dopo l'introduzione di un siero inattivato termicamente contenente anticorpi specifici per Sap2 che inibiscono la maturazione del biofilm, la vitalità delle cellule fungine viene valutata utilizzando un test cromogenico.

Un test in vitro per valutare l'effetto degli anticorpi sul biofilm della Candida tropicalis

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.

Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l'intero spessore del biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati quantitativi sull'attività antifungina di peptidi e altri composti, come agenti antifungini a piccole molecole, contro la Candida albicans. Il suo uso della densità ottica piuttosto che contare le unità formanti colonie per quantificare l'inibizione della crescita consente di risparmiare tempo e risorse.

Quantificare l'attività antifungina dei peptidi contro la Candida albicans

Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Scopri un metodo efficiente per formare biofilm di Candida albicans su piastre a 96 pozzetti e valutarne la suscettibilità agli antifungini. Questa tecnica riproducibile e economica facilita la ricerca in micologia medica.

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm (Video) | JoVE Journal

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

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