Name: Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Impara le tecniche di coltura e mutagenesi di Pristionchus pacificus con EMS e TMP/UV per studi genetici. Questi metodi permettono di generare mutanti e identificare geni coinvolti in processi biologici.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF concedere IOB # 0615996.

Parte 1: Preparazione di terreni di crescita nematode (NGM) piastre Petri Nematodi sperimentali come C. elegans e P. pacificus sono tipicamente coltivate in laboratorio su 6 centimetri piastre Petri contenenti crescita media dei nematodi (NGM) 1. I worm sono mantenuti a 20 ° C, ma può essere incubate a una gamma di temperature (tra i 4 ° C - 25 ° C), a seconda della specie di nematodi e il disegno sperimentale. Per preparare piatti con NGM, tecniche standard di sterili devono essere utilizzati per prevenire la contaminazione da funghi e batteri. In seguito è il protocollo di preparare piatti NGM: <ol><li> Pesare 15 g di agar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptone, e 2,72 g di KH 2 PO 4 in 2 beuta conica L, rendono il volume fino a 1 L con acqua, autoclave e lasciarlo raffreddare a 60 ° C a bagnomaria. </li><li> Aggiungere 0,8 ml ciascuna di 1 M CaCl 2, colesterolo (5 mg / ml in etanolo), e 1 M MgSO 4. Per prevenire la contaminazione da funghi e batteri, 1 ml di streptomicina (100 mg / ml) e nistatina 1 ml (10 mg / ml) può essere aggiunto ad ogni litro di terreno. </li><li> Utilizzando una macchina Unispense e il mantenimento di condizioni sterili, versare i media nei piatti desiderato. Le piastre devono essere riempite di circa 2 / 3 ° pieno. Un piatto standard 60 mm di diametro sono necessari circa 10 ml di media. Non spostare le piastre fino a quando l'agar è completamente gelified, altrimenti ci sarà una superficie irregolare di agar, il che rende difficile mettere a fuoco i vermi sul stereomicroscopio. </li><li> Una volta essiccate, le piastre possono essere seminati immediatamente o conservato a 4 ° C fino alla semina con i batteri. </li></ol> Parte 2: Preparazione OP50 batteri e semina NGM piastre Petri P. Pacifico è coltivate in laboratorio per l'alimentazione del ceppo E.coli OP50. OP50 ha una crescita limitata su piastre NGM, formando così un prato sottile che facilita la visualizzazione dei worm 1. Per crescere una cultura di OP50, utilizzare LB-brodo: <ol><li> Aggiungere 5 g bactotryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl ad una bottiglia da 500 ml con tappo a vite, portare al volume di 500 ml con acqua distillata e autoclave. </li><li> Inoculare il brodo con una singola colonia di OP50 dalla piastra di coltura in condizioni di sterilità e lasciarlo crescere overnight a 37 ° C. </li><li> LB-OP50 è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi se la sterilità è mantenuta. Ogni volta che le piastre devono essere testa di serie, versare una piccola quantità di brodo in un bicchiere piccolo sterile e questo aiuterà a prevenire la contaminazione della coltura madre. </li><li> A piastre semi, dispensare 100-120 microlitri della OP50 sul diametro 60 mm NGM Petri e scuotere per diffonderla. </li><li> Incubare le piastre seminate durante la notte a temperatura ambiente per il prato a crescere. Queste piastre seminate ora può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 3 settimane. Memorizzandoli in una posizione invertita aiuta a prevenire la rapida essiccazione. </li></ol> Parte 3: Esecuzione di un pick In questa sezione viene descritto come fare un pick per i vermi. Il prelievo è utilizzato per trasferire i vermi da una posizione all'altra. Il prelievo è composto da 30 calibro 90% filo di platino iridio 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni di metallo leggermente diversa: <ol><li> Tagliare circa 3-4 cm di filo, posto 0,5 cm dentro la punta di una pipetta Pasteur (la cui punta era rotto a una lunghezza più piccola), e poi sigillare nel bicchiere sopra un becco Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm, ma può variare a seconda delle preferenze individuali. </li><li> Appiattire la fine del filo che è sporgente con un martello o una pinza. Poi piegare verso l'alto parte appiattito a formare uno scoop. </li><li> Levigare gli spigoli del pick con una carta vetrata per evitare di danneggiare il verme o l'agar. </li></ol> Parte 4: vermi Picking <ol><li> Per scegliere i vermi, sterilizzare il filo di platino a fuoco e trascinare la punta appiattita del pick lungo il prato batterica a cappotto con la punta spessa batteri appiccicoso, facendo attenzione a non forare o danneggiare la superficie agar. </li><li> Utilizzando lo stereomicroscopio, molto leggermente pennello la punta appiccicosa contro i vermi verme / essere ritirati fino al worm attacca al batteri sulla scelta. </li><li> Una volta che il worm è sulla punta del plettro, trasferirlo immediatamente alla nuova piastra toccando o scorrere la punta del plettro contro il prato batterica della nuova piastra, e il worm dovrebbe strisciare fuori. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la superficie di agar sul piatto altrimenti i vermi strisciare nei fori rendendo difficile recuperarli. Se il worm rimane sul prendere per troppo tempo, potrebbe essiccare. </li></ol> Parte 5: EMS mutagenesi Solfonato metano etile (EMS) induce un ampio spettro di mutazioni nel genoma del 2. Mutanti possono essere identificati da difetti, come la deposizione delle uova, dei difetti muscolaris, la determinazione del sesso, la formazione dauer, il comportamento e la formazione delle gonadi. Il protocollo per EMS mutagenesi è simile a quello descritto per C. elegans 1. <ol><li> Preparare 500 ml (o più) di NaOH 1N. </li><li> Prendere 4-5, 6 cm di diametro piastre Petri pieno di vermi, contenente poche centinaia di vermi al terzo larvale giovanile (J3) stadio e lavare via i vermi utilizzando 2-3 ml di M9 sterile per piastra. </li><li> Raccogliere tutti i vermi in un contenitore sterile, monouso 15 ml di tubo di centrifuga. Centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. </li><li> Aspirare il liquido e l'uso 2 ml di M9 per risospendere i vermi. Aggiungere 20 l EMS in una provetta contenente 2 ml di M9 e agitare per dissolverlo. Aggiungere questa soluzione EMS al 2 ml di sospensione a vite senza fine e miscelare delicatamente. La concentrazione finale di EMS sarà 47 mm. Attenzione: EMS è un agente mutageno molto forte e devono essere trattati in una cappa aspirante. Tutto il materiale (guanti, pipette, puntali) che entrano in contatto con questo mutagene devono essere trattati con NaOH 1N a inattivo SME. Indossare i guanti doppio durante l'intera procedura di mutagenesi EMS. Smaltire i rifiuti pericolosi secondo le direttive del tuo istituto. </li><li> Posizionare la provetta e coprire il tappo con parafilm; posto orizzontalmente nella cappa e lasciare che il worm incubare per 3,5 ore. Il tubo può essere posizionato su una sedia a dondolo a bassa velocità. </li><li> Ruotare il tubo e coprire il tappo con parafilm, posto in posizione verticale e incubare fino al lavandino vermi. </li><li> Aspirare il supernatante ed eliminarlo in un bicchiere / pallone contenente NaOH 1N. Questo inattivare la SME. </li><li> Aggiungere 5 ml M9 per i vermi, invertire il tubo di 25-30 volte per lavare i vermi, centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. Aspirare il supernatante ed eliminarlo nel becher NaOH 1N. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio almeno 3 volte. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il worm pellet in quantità minima (~ 500 microlitri) di M9 e pipetta fuori su piastre NGM contenente un prato di OP50 batteri. A questo punto non hai più bisogno di lavorare nella cappa chimica. </li><li> Lasciate asciugare il liquido per qualche minuto e poi raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale secondo le linee guida rifiuti pericolosi del tuo istituto. </li><li> Lasciate l'auto mutagenizzate vermi fertilizzare. Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per mutanti recessivi di interesse. </li></ol> Parte 6: Psoralen mutagenesi In questa sezione sono descritte le procedure per mutagenesi utilizzando TMP in collaborazione con lunghezza d'onda ultraviolette (UV). TMP / UV metodo di mutagenesi è ampiamente usato per indurre mutazioni per delezione all'interno di un genoma 3. <ol><li> Raccogliere i vermi 4-5, 6 piastre di Petri cm di diametro in una provetta da 15 ml per centrifuga, come descritto nella procedura precedente. </li><li> Aggiungere 10 ml di M9, capovolgere 20 volte per lavare i vermi, e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante e ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte. Aspirare il liquido e risospendere i vermi in circa 10 volte il loro volume di M9 contenente 30 mg / ml di TMP. Pipettare 20 ml di TMP (3 mg / ml) in 2 ml di M9. Come lo SME, TMP è un potente cancerogeno e devono essere trattati adottando misure di sicurezza adeguate. Per prevenire dal rischio potenziale della giusta luce UV occhio indossa dovrebbe essere usato. Il monouso devono essere eliminati in sacchetti di corretta rischio biologico. </li><li> Incubare la provetta al buio per 15 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità (40 UPM). La camera d'aria verticalmente coperto per 10 minuti per consentire tutte le lavandino vermi. </li><li> Togliere i vermi dal fondo della provetta con una pipetta Pasteur e trasferirli su un piatto NGM testa di serie. Scartare il sopranatante seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Mantenere la piastra nel buio fino a quando la TMP in eccesso viene assorbito nel piatto. </li><li> Utilizzando un misuratore di raggi UV di intensità, impostare la distanza tra la sorgente di raggi UV onda lunga e la piastra in modo tale che l'intensità sul piatto è di 500 μW / cm 2 4. Togliere il coperchio in alluminio e il coperchio e coprire ed esporre la piastra contenente i vermi TMP trattati per le radiazioni UV a onda lunga per 50 secondi. </li><li> Coprire e lasciare i vermi al buio per 5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per la mutazione di interesse. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante Alcuni dei P. pacificus fenotipi mutanti derivanti dalla mutagenesi (sia da EMS o TMP / UV) sono mostrati in figura 1. Ogni mutante ha un fenotipo caratteristica che è facilmente distinguibile dal tipo di animale selvatico. Dal wormche sono stati trattati con il mutageno, 30 J3/J4 larve della generazione dei genitori (P0) sono stati collocati in piatti separati e il permesso di deporre le uova, che sono la generazione F1. Dalle piastre che ha mostrato sana progenie F1, per un totale di 1000 F1S sono stati trasferiti su piatti individuali e la progenie F2 è stato proiettato per i fenotipi. Gli animali con Dumpy 5,6, 6 e non coordinate trasformatore 7 fenotipi sono stati trovati. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvatici e animali mutanti. A. wt ermafrodita B. peso maschile C. DPY mutante D. unc mutante E. TRA mutante. Prime due pannelli che mostrano selvatici tipo ermafrodita (a sinistra) e maschile (a destra) gli animali da confrontare con i mutanti differenti nei pannelli rimanenti.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi è una tecnica ampiamente utilizzata per gli studi genetici in diversi organismi modello sperimentale. Esperimenti di mutagenesi sono spesso utilizzati per identificare la funzione di un gene 2. Le procedure di mutagenesi qui descritto può essere utilizzato non solo per P. Pacifico, ma anche per la C. elegans ed altre specie di nematodi correlati. Qui si descrivono due metodi, EMS e TMP / UV mutagenesi. EMS è una sostanza chimica che induce mutazioni pu...

introduzione al laboratorio worm: da worms coltura a mutagenesi

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Questo protocollo descrive le procedure per mantenere nematodi in laboratorio e come mutagenize utilizzando due metodi alternativi: metano solfonato etilico (EMS) e 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen combinata con la luce ultravioletta (TMP / UV). I nematodi sono potenti sistemi biologici per gli studi di genetica a causa del loro piano di corpo semplice e il sistema di accoppiamento, che è composto di auto-fertilizzazione ermafroditi e maschi in grado di generare centinaia di progenie per animale. I nematodi sono mantenuti in piastre di agar contenente un prato di batteri e può essere facilmente trasferito da un piatto all&#39;altro con un plettro. EMS è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni puntiformi e piccole delezioni, mentre TMP / UV induce soprattutto le eliminazioni. A seconda della specie di nematode usato, le concentrazioni di EMS e TMP dovrà essere ottimizzato. Per isolare mutazioni recessive del pacificus nematode Pristionchus, gli animali della generazione F2 erano visivamente sottoposti a screening per fenotipi. Per illustrare questi metodi, abbiamo mutagenizzate worm e cercato non coordinate (Unc), Dumpy (DPY) e trasformatore (Tra) mutanti.

Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) In laboratorio e mostrano due differenti metodi di mutagenesi, EMS e TMP / UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

Questo protocollo descrive le procedure per il mantenimento dei nematodi in laboratorio e come mutagenizzarli utilizzando due metodi alternativi: l'etilsolfato di metile...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire due protocolli di mutagenesi comunemente utilizzati per generare mutanti e nematodi, come ceno, hepatitis elegance e prisca. La mutagenesi con Pacificus è uno strumento potente per svelare la funzione dei geni. Questo viene realizzato preparando innanzitutto colture con un elevato numero di vermi all'ultimo stadio larvale precedente all'età adulta, sulle quali verrà effettuata la mutagenesi.Il passo successivo consiste nel mutare i vermi utilizzando due procedure alternative: il trattamento con etil metano solfonato oppure la mutagenesi combinata con radiazione ultravioletta. Il terzo passo della procedura prevede il trasferimento dei vermi dall'aspetto sano su piastre di agar, appena seminate con batteri, che costituiscono la fonte alimentare. L'ultimo passo della procedura consiste nell'analizzare la presenza di fenotipi mutanti di interesse nella prima, seconda o terza generazione.Ciao, sono Jore del laboratorio del Dottor Andre Perez, Silva, del Dipartimento di Biologia dell'Università del Texas ad Arlington. Le procedure di mutagenesi TMPUV e EMS aiutano a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca genetica, come ad esempio quali geni sono coinvolti in processi biologici che svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo. Ciao, mi chiamo Manish Phar; sebbene i metodi di mutagenesi qui dimostrati siano rivolti a Pristi Onca S Pacificus, possono essere comunemente impiegati anche in altri modelli sperimentali come il nematode Caenorhabditis elegans, e persino in vertebrati come il pesce zebra.Iniziamo. Il nostro strumento per trasferire i vermi da un punto all'altro è realizzato in filo di platino al 90% e iridio al 10% di calibro 30. Sebbene alcuni ricercatori possano preferire composizioni metalliche leggermente diverse, per tenere lo strumento si utilizza anche una pipetta da pascolo.Iniziare spezzando la punta allungata della pipetta Pasteur a una lunghezza richiesta. Tagliare circa tre-quattro centimetri di filo e inserire 0,5 centimetri di esso all'interno della punta della pipetta Pasteur, sigillando il filo nel vetro sopra un becco Bunsen.La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa tre a tre centimetri e mezzo, ma può variare in base alle preferenze individuali. Appiattire l'estremità del filo sporgente utilizzando delle pinze. Successivamente, piegare la parte appiattita verso l'alto per formare una paletta.Infine, levigare i bordi taglienti del pick con della carta vetrata per evitare di danneggiare il verme o l'agar. Per prelevare i vermi, sterilizzare il filo del pick sulla fiamma e quindi trascinare delicatamente la punta appiattita lungo un tappeto batterico su una piastra NGMP per ricoprire la punta con batteri densi e appiccicosi. Fare attenzione a non perforare o danneggiare la superficie dell'agar, utilizzando un microscopio stereoscopico con molta delicatezza.Appoggiare la punta appiccicosa sul verme da prelevare finché il verme aderisce ai batteri presenti sulla punta. Una volta che il verme è sulla punta della pipetta, trasferirlo immediatamente sulla nuova piastra toccando o facendo scivolare la punta della pipetta sul prato batterico della nuova piastra. È necessario fare attenzione a non danneggiare la superficie agarica della piastra, dove i vermi potrebbero penetrare nei fori e diventare difficili da recuperare.Il verme dovrebbe strisciare fuori dal cimino quando si tocca o si fa scorrere la punta del cimino contro il prato batterico. Il verme non dovrebbe rimanere sul cimino troppo a lungo, altrimenti potrebbe disidratarsi. Illustreremo la mutagenesi con EMS su quattro o cinque piastre di Petri di sei centimetri di diametro contenenti vermi di prisca pacificus allo stadio larvale giovanile terzo.Lavare i vermi da ogni piastra utilizzando due o tre millilitri di M nine sterile per piastra. Dovrebbero esserci alcune centinaia di vermi. Raccogliere i vermi in un tubo da centrifuga sterile monouso da 15 millilitri.Centrifugare a 1500 G per cinque a sette minuti o fino a quando i vermi formano un pellet. Aspirare il liquido e utilizzare due millilitri di M nine per risospendere i vermi, indossando guanti doppi e lavorando in una cappa a flusso laminare; aggiungere 20 microlitri di EMS a un tubo contenente due millilitri di M nine e agitare per scioglierlo. Quindi aggiungere questa soluzione a due millilitri di sospensione di vermi e mescolare delicatamente con movimenti rotatori.La concentrazione finale di EMS sarà di 47 millimoli. Posizionare il tubo da centrifuga con il paraform su un agitatore lento all'interno della cappa e lasciare incubare i vermi per tre ore e mezza. Al termine dell'incubazione di tre ore e mezza, posizionare il tubo in posizione verticale e lasciare incubare fino a quando i vermi affonderanno; quindi aspirare il sopranatante e smaltirlo in un becher contenente idrossido di sodio 1 N per inattivare l'EMS nel sopranatante.Ogni volta prima di togliere le mani dalla cappa, assicurarsi di risciacquarle anche nella soluzione di idrossido di sodio uno normale. Per inattivare l'EMS, aggiungere cinque millilitri di M nine ai vermi. Capovolgere il tubo da 25 a 30 volte per lavare i vermi e centrifugare a 1500 G per cinque-sette minuti o fino a quando i vermi formano un pellet dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e smaltirlo nel becker contenente idrossido di sodio uno normale.Ripetere almeno tre volte questa fase di lavaggio aggiungendo M nine, centrifugando e rimuovendo il soprannatante. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet di vermi in una quantità minima di M nine, trasferire la sospensione di vermi su piastre NGM contenenti un prato batterico di OP 50. Dopo aver lasciato asciugare il liquido per alcuni minuti, selezionare e trasferire larve J quattro dall'aspetto sano su piastre appena seminate.Lasciare che i vermi mutagenizzati si autofecondino; circa otto-dieci giorni dopo, utilizzare un microscopio stereoscopico per analizzare i fenotipi della generazione F2 alla ricerca di mutanti eccessivi di interesse. Questa procedura di mutagenesi verrà dimostrata su vermi ppac pacificus provenienti da piastre di Petri di diametro compreso tra quattro e cinque-sei centimetri, raccolti in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di M nine al pellet di vermi.Rovesciare 20 volte per lavare i vermi e centrifugare a 1500 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante. Ripetere il lavaggio dei vermi con M nine per un totale di tre volte; dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il liquido e risospendere i vermi in un volume di M nine pari a circa 10 volte il loro volume.Quindi aggiungere 4 5 8 trimetil SOREIN o TMP da una soluzione madre di tre milligrammi per millilitro per ottenere una concentrazione finale di 30 microgrammi per millilitro. Incubare il tubo al buio a temperatura ambiente su un agitatore lento per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, posizionare il tubo in verticale per 10 minuti per permettere a tutti i vermi di affondare. Per questo video, il tubo è mostrato scoperto, ma la soluzione di TMP non deve essere esposta alla luce.Poiché questo composto chimico è sensibile alla luce, utilizzare una pipetta pasteur per prelevare i vermi dal fondo del tubo e trasferirli su una piastra NGM non seminata. Mantenere la piastra al buio fino a quando l'eccesso di TMP non viene assorbito nella piastra. Una volta che il TMP è stato assorbito nella piastra, i vermi possono essere trattati con luce ultravioletta.Uno dei passaggi più critici nella procedura di neurogenesi TMP UV consiste nel mantenere la giusta distanza tra la sorgente UV a onde lunghe e la piastra. Pertanto, dobbiamo regolare la distanza più volte per ottenere l'intensità corretta di luce UV che incide sulla piastra. L'intensità deve essere registrata dal misuratore di intensità e deve corrispondere a 500 micro watt per centimetro quadrato.Indossare occhiali protettivi durante questo passaggio a causa del rischio potenziale derivante dalla luce UV. Utilizzando un misuratore di intensità UV, determinare la distanza dalla sorgente UV ad onda lunga che corrisponda a un'intensità di 500 micro watt per centimetro quadrato.Successivamente, rimuovere la pellicola di alluminio e il coperchio e posizionare la piastra contenente i vermi trattati con TMP a una distanza dalla lampada tale che l'intensità sulla piastra sia di 500 micro watt per centimetro quadrato. Esporre la piastra alla radiazione UV ad onda lunga per 50 secondi, quindi lasciare i vermi al buio per cinque ore a temperatura ambiente. Trascorse cinque ore, selezionare e trasferire larve J4 dall'aspetto sano su piastre fresche con semina.Infine, analizzare le generazioni F1, F2 o F3 alla ricerca di fenotipi di interesse utilizzando un microscopio stereoscopico. Qui sono mostrati alcuni dei fenotipi mutanti di ppac pacificus identificati nella generazione F2 dopo mutagenesi con EMS o T-M-P-U-V. I due pannelli superiori in queste immagini rappresentano esempi di un ermafrodita di tipo selvatico e di un maschio di tipo selvatico.Ogni mutante presenta un fenotipo caratteristico facilmente distinguibile da quello dell'animale di tipo selvatico. Il pannello C mostra un esempio di un mutante dumpy. Il pannello D illustra un mutante uncoordinated e il pannello E rappresenta un mutante transformer. Una volta acquisita padronanza, la mutagenesi con EMS può essere completata in quattro ore e mezza, mentre la mutagenesi con TMP uuv può essere eseguita in cinque ore e mezza se effettuata correttamente.Questo periodo comprende anche il tempo di incubazione. Non dimenticare che EMS e TMP sono estremamente pericolosi e che, durante il loro utilizzo, è sempre necessario adottare precauzioni come indossare un grembiule, usare guanti doppi, lavorare sotto cappa chimica e indossare occhiali di sicurezza. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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