Name: Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Impara un metodo ottimizzato di transfezione per l'espressione e la registrazione elettrofisiologica di canali ionici ricombinanti in cellule HEK-293T. Questo protocollo migliora l'adesione cellulare e la stabilità della membrana.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento Discovery per JDS dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) del Canada, un NSERC Alexander Graham Bell Canada Borse di studio Laurea (dottorato) (di A. Senatore) e la Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Essere in grado di registrare a cellula intera correnti utilizzando i protocolli descritti e soluzioni indica che la trasfezione ha avuto successo e che la tensione desiderata-canali ionici o complessi di canali ionici sono presenti con quantità significative a livello della membrana cellulare. Dovrebbe essere positivamente le cellule transfettate (cioè fluorescente verde) ma non sono le correnti registrabili, tempo supplementare a 28 ° C può essere necessario per consentire la proteina canale che deve essere adeguatame...

<table><tbody><tr><td>Plasmide pIRES2-EGFP</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti circolari in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>Cerchi n. 1 - spessore da 0,13 a 0,17 mm, dimensione: 12 mm</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B o Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Software di elettrofisiologia</td><td>Axon Instruments</td><td>pClamp10.1</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatori per pipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MPC-385-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito a epifluorescenza</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Testa amplificatrice (headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>Portaelettrodi per testa amplificatrice</td><td>Axon Instruments</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>Portaelettrodi micr&amp;#8211;per elettrodo di terra</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3RF 15</td><td></td></tr><tr><td>Capillari per elettrofisiologia</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF-150-86-15</td><td>Vetro borosilicato con filamento, diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 0,86 mm, lunghezza 15 cm</td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Lucidatore a fiamma per micropipette</td><td>Narishige International</td><td>Micro Forge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione microfarmacologica</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>SmartSquirt8 Valvelink8.2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione farmacologica</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>Valvelink8.2 con valvole in Teflon</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule hek-293t

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

L&#39;espressione in vitro e la registrazione elettrofisiologica di ricombinante voltaggio-dipendenti canali ionici in colture di cellule renali umane embrionali (HEK-293T) è una strategia di ricerca onnipresente. HEK-293T cellule devono essere placcato sulla coverslips vetro a bassa densità sufficiente in modo che non siano in contatto tra loro al fine di consentire la registrazione elettrofisiologica senza effetti confondenti dovuti al contatto con le cellule adiacenti. Canali transfettate deve anche esprimere ad alta efficienza a livello della membrana plasmatica per la cellula intera registrazione patch clamp delle correnti rilevabili di sopra dei livelli di rumore. Canali ionici eterologa spesso richiedono lunghi periodi di incubazione a 28 ° C dopo trasfezione al fine di raggiungere un&#39;adeguata espressione di membrana, ma ci sono sempre perdite di cellule coprioggetto adesione e la stabilità della membrana a questa temperatura. Per aggirare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia ottimizzata per trasfezione e piastra HEK-293T cellule. Questo metodo richiede che le cellule sono transfettate in una confluenza relativamente alto, e incubate a 28 ° C per diversi periodi di incubazione post-trasfezione per consentire un&#39;adeguata espressione della proteina del canale ionico. Cellule transfettate vengono placcati su coprioggetto di vetro e incubate a 37 ° C per diverse ore, che permette di attaccamento cellula rigida per i coprioggetti e ristabilizzazione della membrana. Le celle possono essere registrate subito dopo placcatura, o possono essere trasferiti a 28 ° C per l&#39;incubazione ulteriormente. Troviamo che l&#39;incubazione iniziale a 28 ° C, dopo trasfezione ma prima di placcatura, è la chiave per l&#39;espressione efficace dei canali ionici eterologa che normalmente non esprimono bene a livello della membrana plasmatica. Positivamente transfettate, cellule in coltura sono identificati da co-espressi eGFP o eGFP espresso da un vettore bicistronic (ad esempio pIRES2-EGFP) contenente il canale ionico del DNA ricombinante appena a monte di un sito interno ingresso ribosoma e una sequenza eGFP codifica. Whole-cell patch clamp registrazione richiede attrezzature specializzate, oltre alla lavorazione di elettrodi di registrazione e lucido a forma di L elettrodi di massa in vetro borosilicato. Somministrazione di farmaci per studiare la farmacologia dei canali ionici può essere ottenuto direttamente micropipetting droga nel piatto di registrazione, oppure utilizzando microperfusione o sistemi di flusso di gravità che producono flussi ininterrotti di soluzione farmaco sulle cellule registrate.

Metodo affidabile per l&#39;alta efficienza<em&gt; In vitro</em&gt; Espressione e la successiva registrazione elettrofisiologica di ricombinante voltaggio-dipendenti canali ionici in colture di cellule renali umane embrionali (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

L'espressione in vitro e la registrazione elettrofisiologica di canali ionici voltaggio-dipendenti ricombinanti in cellule coltivate di rene embrionale umano (HEK-293T) ...

La elettrofisiologia è comunemente utilizzata per studiare l'attività di canali ionici voltaggio-dipendenti ricombinanti in cellule renali embrionali umane coltivate. Per ottenere registrazioni di successo, è necessario che le cellule esprimano i canali a livelli sufficienti sulla membrana cellulare per consentirne la rilevazione e che vengano seminate a una densità cellulare sufficientemente bassa da permettere l'isolamento di cellule singole. La realizzazione di registrazioni cellulari è spesso ostacolata dai lunghi periodi di incubazione a 28 gradi Celsius necessari per tale espressione, durante i quali si verifica tipicamente una perdita di adesione cellulare e di stabilità della membrana.Qui viene dimostrato un metodo ottimizzato per la coltura cellulare e la trasfezione che aggira questi problemi. Le cellule vengono trasfettate a una densità moderata, quindi incubate a 28 gradi Celsius finché non si raggiunge un'espressione adeguata dei canali ionici. Le cellule trasfettate vengono quindi seminate su coprioggetti di vetro a bassa densità e incubate a 37 gradi Celsius per diverse ore per consentire l'adesione cellulare e la stabilizzazione della membrana.Una volta piastrati in

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Impara un metodo ottimizzato di transfezione per l'espressione e la registrazione elettrofisiologica di canali ionici ricombinanti in cellule HEK-293T. Questo protocollo migliora l'adesione cellulare e la stabilità della membrana.

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T (Video) | JoVE Journal

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

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