Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

L'elettrofisiologia è comunemente usata per studiare l'attività dei canali ionici dipendenti a voltaggio ricombinante in cellule renali embrionali umane in coltura. Una registrazione di successo richiede che le cellule esprimano canali a livelli sufficienti sulla membrana cellulare per il rilevamento e che le cellule siano piastrate a una densità cellulare sufficientemente bassa per l'isolamento delle singole cellule. L'esecuzione delle registrazioni cellulari è spesso ostacolata dai lunghi periodi di incubazione a 28 gradi Celsius necessari per tale espressione, dove in genere si verifica una perdita di adesione cellulare e di stabilità della membrana.

Qui, viene dimostrato un metodo ottimizzato per la coltura cellulare e la trasfezione che elude questi problemi. Le cellule vengono trasfettate a una cofluenza moderata, quindi incubate a 28 gradi Celsius fino a raggiungere un'adeguata espressione dei canali ionici. Le cellule trasfettate vengono quindi piastrate su vetrini di vetro a bassa densità e incubate a 37 gradi Celsius per diverse ore per consentire l'adesione delle cellule e la stabilizzazione della membrana.

Una volta opportunamente placcate, le cellule vengono identificate mediante EGFP co-espresso e patch clamp per cellule intere. La registrazione può essere eseguita o le cellule possono essere nuovamente incubate a 28 gradi Celsius. Per aumentare ulteriormente l'espressione della superficie del canale, i risultati della registrazione di esperimenti su cellule trasfettate con canali del calcio voltaggio-dipendenti come L CAV uno, L CAV due o L cav tre indicano che i canali sono stati trasfettati ed espressi con successo dalle cellule.

Sebbene nel nostro laboratorio siano stati mostrati solo risultati rappresentativi per L CAV tre, abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l'espressione di geni dei canali ionici scarsamente espressi per la registrazione del patch clamp in linee cellulari umane. Ora l'approccio convenzionale consiste nel dividere prima le cellule sui vetrini coprioggetti e trasfettarle con CDNA plasmatici contenenti i geni dei canali ionici, quindi incubare per molti giorni a 28 gradi Celsius al fine di ottenere un'espressione dei canali ionici altamente efficiente prima della registrazione elettrofisiologica. Il nostro nuovo approccio riduce notevolmente il tempo di incubazione richiesto a 28 gradi Celsius prima della registrazione.

Ora, diminuendo il tempo di incubazione di 28 gradi, scopriamo che le membrane cellulari sono molto più stabili e le cellule trasfettate aderiscono molto di più ai vetrini. Ciò aumenta il numero di celle registrabili e rende significativamente più efficiente la sperimentazione. Prima della trasfezione, dividere un pallone completamente confluente di cellule HEK 2, 9, 3 T, da una a quattro in un nuovo pallone quadrato di 25 centimetri e posizionare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica.

Lasciare che le cellule si attacchino per tre o quattro ore dopo quattro ore, esaminare le cellule mediante contrasto di interferenza differenziale per verificare l'attaccamento. Si noti che le celle non hanno più un aspetto rotondo e si appiattiscono. Sono visibili estensioni o pseudopodi.

Meno celle di confluenza avrebbero lo stesso aspetto ma sarebbero più distanziate tra loro. Una volta che le cellule si sono attaccate, combinare i reagenti necessari per eseguire una trasfezione standard di fosfato di calcio. Preparare un totale di 12 microgrammi di DNA in 600 microlitri di soluzione di trasfezione per matraccia.

Qui i CDNA provenienti da vari canali ionici vengono clonati nel plasmide P-I-R-E-S a due EGFP Trasfezione di questo vettore di espressione in una linea cellulare di mammifero. Si traduce nella produzione di una proteina fluorescente verde potenziata dallo stesso mRNA dell'inserto clonato attraverso la traduzione avviata in un sito di ingresso del ribosoma interno appena a valle della sequenza di rivestimento del canale ionico e a monte della sequenza di rivestimento EGFP. Ciò consente di identificare le cellule trasfettate positivamente senza possibili interferenze nella funzione della proteina che possono essere causate dalla fusione diretta della proteina EGFP con la proteina di interesse.

Pipettare la soluzione di trasfezione sulle cellule goccia a goccia, quindi agitare delicatamente il pallone e metterlo nell'incubatore a 37 gradi Celsius per una notte del giorno successivo. Verificare l'efficienza della trasfezione osservando le cellule al microscopio a fluorescenza. Le cellule trasfettate positivamente dovrebbero apparire verdi in tutta la cellula.

Una volta verificata la trasfezione, pipettare con cura da quattro a cinque millilitri di terreno caldo nel pallone capovolto. Lavare le celle capovolgendo lentamente il matraccio in modo che la superficie della cella sia rivolta verso il basso e facendo oscillare il pallone in modo che la soluzione di lavaggio si muova delicatamente su di esse. Rimuovere il mezzo e ripetere questo lavaggio.

Passaggio altre due volte. Quindi aggiungere sei millilitri di terreno al pallone e incubare a 37 gradi Celsius per due ore. L'espressione dei canali ionici degli invertebrati presenta alcune sfide.

In primo luogo, sono spesso di grandi dimensioni e possono quindi richiedere molto tempo per tradursi nel reticolo endoplasmatico. Inoltre, potrebbero non essere mirati in modo efficiente alla membrana cellulare in una linea cellulare di mammifero. Infine, poiché specie diverse mostrano diverse frequenze di utilizzo dei codoni, i CDNA eterologhi possono ospitare alte frequenze di codoni che non sono comuni nelle cellule di mammifero come HEK 2 9 3 T per superare alcune di queste difficoltà.

Dopo l'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius dopo il lavaggio del trasfetto, trasferire i flaconi in un incubatore a 28 gradi Celsius per due-sei giorni per prolungare il periodo di espressione. Il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente per ogni tipo di canale ionico espresso. Poiché l'incubazione a 28 gradi Celsius per periodi di tempo prolungati porta al distacco delle cellule e alla scarsa stabilità della membrana.

È necessaria un'ulteriore preparazione delle cellule prima di eseguire studi elettrofisiologici. In primo luogo, rimuovere il terreno dalle cellule trasfettate mediante pipetta per aspirazione un millilitro di soluzione di tripsina a 37 gradi Celsius in un pallone capovolto. Quindi riportare delicatamente il pallone sulla superficie cellulare in posizione rivolta verso il basso per consentire alla tripsina di scorrere delicatamente sulle cellule.

Capovolgere il matraccio e rimuovere la tripsina. Quindi aggiungere 250 microlitri di tripsina calda direttamente sulle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti fino a quando le cellule non si staccano. Nel frattempo, posizionare da tre a otto vetrini di copertura rivestiti di poli-L in un piatto di coltura da 60 millimetri e aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura caldo.

Una volta che le cellule si sono staccate, sospenderle in quattro millilitri di terreno caldo pipettandole su e giù circa sei volte Successivamente, utilizzando la punta della micropipetta, spingere verso il basso i vetrini coprioggetti per assicurarsi che si trovino sul fondo della piastra. Quindi aggiungere da 250 a 500 microlitri di cellule risospese. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre ore per consentire loro di aderire ai vetrini.

Lasciare le cellule troppo a lungo a 37 gradi provocherà la divisione cellulare e la diluizione dei plasmidi trasfettati. Le celle trasfettate devono essere piastrate a una densità sufficientemente bassa in modo da essere isolate l'una dall'altra, come mostrato qui. Ciò faciliterà la registrazione elettrofisiologica.

Per le cellule che richiedono subunità accessorie, è spesso necessario trasferire le cellule a 28 gradi Celsius e incubarle per altri tre o quattro giorni prima dell'elettrofisiologia. La registrazione viene eseguita per le celle che non richiedono sottounità accessorie. La registrazione può essere eseguita immediatamente dopo questa incubazione.

L'impianto di elettrofisiologia utilizzato qui include un amplificatore, manipolatori a doppia pipetta motorizzati, microscopio a epifluorescenza e sistemi di perfusione. L'apparecchiatura è stata montata su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni e randagia. Il rumore elettrico è limitato da un tipo di gabbia Ferrett alta 40 pollici con due sistemi di controllo elettronico che include un PC dotato di un dato numerico 1440, un'interfaccia convertitore analogico-digitale in combinazione con il software P clamp 10.1.

L'amplificatore del monitor del computer, il manipolatore motorizzato e un sistema di controllo della profusione del collegamento della valvola sono tutti montati all'esterno della gabbia di Faraday. Su un rack elettrico metallico indipendente da 19 pollici, tutte le apparecchiature elettriche sono collegate a terra a un distributore di rame e collegate a un trasformatore di isolamento di grado medico, che fornisce isolamento della linea, una messa a terra costante e soppressione delle sovratensioni. Preparatevi agli esperimenti montando micropipette lucidate a fuoco con una resistenza da due a cinque mega ohm sul supporto per micropipette sul tavolino principale.

Le pipette per cerotti vengono riempite con una soluzione interna per rimuovere le bolle d'aria e infine montate sullo stadio principale. Successivamente, utilizzando una pinza, trasferire un vetrino coprioggetto con celle placcate in una piastra di Petri di plastica da 35 millimetri contenente tre millilitri di soluzione di registrazione esterna a temperatura ambiente. Il volume della soluzione di registrazione deve essere misurato accuratamente quando si eseguono esperimenti farmacologici durante i quali quantità note di farmaco vengono aggiunte al piatto con una micropipetta, posizionare il piatto sul tavolino del microscopio.

Quindi riempire una semicella portamicroelettrodo con tre molari di cloruro di cesio. Quindi inserire l'elettrodo di riferimento nella semicella e posizionare l'elettrodo di terra nel bagno utilizzando il manipolatore microm, abbassare la pipetta patch nella soluzione del bagno. Visualizzare le cellule in modalità fluorescenza e centrare una cellula verde aderente isolata trasfettata positivamente al centro del campo visivo.

In modalità bagno, portare la pipetta a cerotti nelle immediate vicinanze della cella. Azzerare la traccia d'onda quadra osservata sullo schermo del computer. Regolare la posizione della pipetta patch in modo che tocchi appena la cella e la traccia di corrente quadrata sullo schermo inizi a fluttuare.

Applicare un'aspirazione delicata con una siringa collegata fino a formare una tenuta giga ohm. Una volta raggiunta una tenuta giga ohm, passare il programma alla modalità patch. Applicare un rapido impulso di aspirazione con la siringa per sfondare la membrana cellulare.

Quindi passare alla modalità cella e utilizzare i parametri dell'intera cella sull'amplificatore. Per compensare il transitorio capacitivo, è necessario equilibrare il cerotto in modo che la soluzione di registrazione intracellulare si dializzi nella cella patchata. Inserire qui i protocolli di clamp di tensione scritti per questo esperimento.

Lo sperimentatore ha progettato un protocollo per misurare le correnti ioniche attraverso canali ionici voltaggio-dipendenti che si verificano quando la tensione attraverso la membrana cellulare viene modulata. In questo caso, stiamo guardando un protocollo IV che specifica che il software mantiene la cella a meno 110 millivolt e poi SEP a meno 70 millivolt per 250 millisecondi. Quindi torna indietro a meno 110 millivolt mantenendo il potenziale ogni volta che il passo aumenta di 10 millivolt in modo che i passi siano a meno 70 millivolt, meno 60 millivolt, eccetera, fino a quando l'ultimo passo è a più 20 millivolt.

Filtrare le correnti registrate a 10 kilohertz utilizzando un filtro passa-basso di Bessel sull'amplificatore e digitalizzarle a una frequenza di campionamento di due kilohertz utilizzando il software clamp X 10.1 utilizzare solo registrazioni con perdita minima inferiore al 10%Per l'analisi, sono state coltivate e trasfettate con L Cav 2 93 cellule T. Tre canali del calcio come mostrato qui. Il successo della trasfezione dei CDNA eterologhi dei canali ionici è stato indicato dalla fluorescenza generata dal vettore P-I-R-E-S a due eeg FP.

Qui mostriamo l'espressione di successo di un canale del calcio a tre voltaggi cav invertebrato. Quando le cellule non vengono trasfettate, non possono essere suscitate correnti di calcio. Mentre le celle trasfettate generano correnti elevate quando vengono applicati protocolli di blocco di tensione dell'intera cella.

Gli sperimentatori possono utilizzare varie condizioni elettrofisiologiche e regimi di analisi dei dati a seconda delle loro esigenze. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di usare il proprio giudizio per quanto riguarda i tempi degli esperimenti. Poiché canali diversi si esprimono con efficienze diverse sulla membrana cellulare, spetta a te determinare la strategia ottimale da utilizzare per aumentare la vitalità delle cellule e massimizzare l'espressione superficiale dei canali che ti interessano.

Dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia acquisito una buona comprensione di come coltivare e mantenere una linea cellulare umana, nonché di come trasfettare i CDNA dei canali ionici eterologhi e i CDNA delle subunità in queste cellule. Per la registrazione elettrofisiologica.