In tempo reale immagini di leucotriene B ₄ Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

Il leucotriene B quattro è una molecola pro-infiammatoria che media le proprie azioni attraverso i recettori accoppiati a proteine G, BT uno e BT due, su diverse cellule infiammatorie. È stato dimostrato che la via LTB quattro B LT uno svolge un ruolo fondamentale in numerose malattie infiammatorie, tra cui asma, artrite e aterosclerosi. I recettori accoppiati a proteine G, o GPCR, mediano la trasduzione di segnali extracellulari che inducono risposte intracellulari come chemotassi, rilascio di calcio intracellulare e regolazione genica.

Il legame del ligando extracellulare induce una serie di cambiamenti conformazionali che portano all'attivazione delle proteine G eterotrimeriche. Le proteine G modulano quindi i livelli di messaggeri secondari, come l'adenosina monofosfato ciclica, un acetil tri fosfato e il digliceride, per monitorare in tempo reale la migrazione cellulare mediata dal leucotriene B4 in cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, o BMDC, che vengono osservate mentre il ligando viene rilasciato mediante flusso controllato da una micropipetta. Viene effettuata un'acquisizione temporizzata per valutare la migrazione.

Utilizzando queste tecniche di imaging in tempo reale su cellule vive, il nostro laboratorio ha scoperto che il recettore BT1 della famiglia dei leucotrieni B4 è espressato funzionalmente sulle cellule dendritiche. Abbiamo inoltre identificato i meccanismi di fosforilazione e di internalizzazione dipendenti dalla beta-arrestina per BT1. La dottoressa Jla, ricercatrice e professoressa associata nel nostro laboratorio, che ha sviluppato molte di queste tecniche, dimostrerà sia la migrazione delle cellule vive che l’internalizzazione del recettore. Per preparare le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC) per i saggi di migrazione cellulare, piastrare 0,5 milioni di cellule in mezzo di coltura RPMI 1640 contenente siero FBS, G-M-CSF ricombinante e FLT3 ricombinante su una piastra da 35 mm con fondo in vetro.

Dopo aver seminato, incubare le cellule per 16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Aggiungere tre millilitri di PBS quindi aspirare. Ripetere questo lavaggio almeno altre due volte; dopo l'ultima aspirazione, aggiungere due millilitri di PBS alla piastra.

Le cellule sono ora pronte per l'esperimento e devono essere mantenute a 37 gradi Celsius. Fino a quel momento, il sistema di imaging utilizzato per gli esperimenti in questo video è costituito da un sistema epifluorescente A-T-E-F-M collegato a un microscopio invertito Nikon Eclipse TE 300, dotato di un palco riscaldato e una fotocamera digitale CCD in bianco e nero Cool SNAP hq.

Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sono controllate mediante ruote portafiltri e da un controllore per ruote portafiltri Lambda 10 dash two. Il controllo dell'hardware e l'acquisizione delle immagini sono gestiti dal software MetaMorph. Due micromanipolatori sono collegati alla piastra del microscopio per tenere le pipette, che possono essere realizzate seguendo le istruzioni nel testo allegato oppure acquistate pronte.

Trasferire 1,5 millilitri di una soluzione madre di 100 nanomolar della molecola infiammatoria leucotriene B quattro o LTB quattro in un tubo da 1,5 millilitri. Riempire il micropipetto arretrando l’aspirazione, posizionando la punta del micropipetto nella soluzione e permettendo al liquido di entrare; questo metodo di caricamento eviterà la formazione di bolle d’aria alla fine del micropipetto. Successivamente, caricare una siringa tubercolinica da un centimetro cubo collegata a un ago microfill con un millilitro di LTB quattro.

Quindi utilizzarla per riempire lentamente una micropipetta dall'alto, collegando un tubicino alla micropipetta riempita LTB quattro. Successivamente, collegare la micropipetta e il tubicino a un ago da 21 gauge lungo un pollice e mezzo, fissato a una siringa da un millilitro, anch'essa riempita di ligando. A questo punto, fissare con attenzione la micropipetta riempita di ligando a uno dei micromanipolatori presenti sul tavolo del microscopio per eseguire l'immagine in tempo reale di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo.

In risposta all'applicazione del ligando LTB quattro, rimuovere le b MDC immatura piastrata dall'incubatore e posizionarla sul palchetto riscaldato del microscopio. Mettere a fuoco le cellule utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 60x. Individuare un'area in cui le cellule non siano troppo affollate, in modo che la migrazione possa essere adeguatamente monitorata.

Rimuovere il coperchio dalla piastra fluorimetrica. Quindi, utilizzando il manipolatore manuale grosso, abbassare con attenzione la pipetta caricata con il ligando e avvicinarla. Avvicinarsi alle cellule utilizzando il micromanipolatore fine idraulico.

Mettere a fuoco la pipetta. Applicare una piccola pressione dalla siringa per iniziare il rilascio lento del ligando LTB4 dalla punta; il ligando deve diffondere lentamente nel mezzo per diffusione. Successivamente, utilizzando il software MetaMorph, impostare i parametri di acquisizione delle immagini per acquisire un'immagine in campo chiaro ogni 15 secondi per due ore.

Continuare a monitorare ogni cinque minuti il progresso della migrazione verso il ligando. Il metodo descritto in questo protocollo è stato utilizzato per determinare la migrazione delle cellule dendritiche verso il leucotriene B quattro. Qui, la migrazione delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo del topo verso 100.

Nan Animale o LTB quattro è visto in questo video di imaging a intervalli temporali che mostra la migrazione cellulare in tempo reale di B MDC verso ltb. Quattro metodi simili possono essere applicati per determinare la risposta chemiotattica di molti tipi cellulari a una varietà di chemiotrattanti. Questo tipo di imaging, in combinazione con molecole marcate con proteine fluorescenti, può essere utilizzato per tracciare movimenti e interazioni di molecole in tempo reale in cellule vive.

Qui dimostriamo in tempo reale le interazioni tra il recettore uno del leucotriene B quattro marcato con un fluorocromo e l'arrestina beta. RBL due H tre è una linea cellulare di leucemia basofila del ratto isolata da ratti Wistar, disponibile presso l'A TCC. Queste cellule non esprimono molti recettori per chemochine, ma possiedono i componenti cellulari necessari per mediare vie di segnalazione dipendenti dalle chemochine.

Per valutare in tempo reale l'internalizzazione indotta dal ligando di BT one, le cellule RBL two H three vengono trasfettate con BT one RFP e beta arrestina GFP. Durante l'acquisizione di immagini in time-lapse, il ligando viene aggiunto alla piastra. I cambiamenti nella localizzazione di queste proteine possono essere valutati mediante analisi delle immagini.

Per studiare l'internalizzazione del recettore G PCR R in tempo reale, trasfettare B LT one RFP e beta arrestina GFP nelle cellule RBL two H three seguendo le istruzioni riportate nel testo allegato. Successivamente, trasferire 300 microlitri della miscela di cellule elettroporate e mezzo di crescita normale in piatti fluoro da 35 millimetri contenenti due millilitri di mezzo di crescita normale. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata composta da 95% di aria e 5% di anidride carbonica, per consentire loro di aderire al fondo del piatto.

Dopo un'ora, sostituire il mezzo di trasfezione con il mezzo di crescita normale e riposizionare le cellule nell'incubatore per ulteriori 18-24 ore. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due o tre volte aggiungendo due millilitri di RPMI privo di fenolo rosso e riscaldato, contenente 10 millimoli di hippies, direttamente nella piastra ed aspirando i mezzi. Quindi aggiungere altri 1,8 millilitri.

Successivamente, posizionare la piastra di coltura sul palchetto riscaldato del microscopio. Acquisire immagini a un ingrandimento di 600x utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 60x. Quindi passare al filtro di fluorescenza appropriato.

Scegliere una cellula sana che esprima HBL BT one RFP sulla superficie cellulare e catturare qui l'immagine. Passando dal filtro RFP al filtro GFP, verificare che beta arrestina e GFP siano espresse nel citoplasma e acquisire l'immagine. Quindi esaminare le immagini pseudocolorate sovrapposte per assicurarsi che non vi sia bleed-through di fluorescenza, che può verificarsi a causa di errori.

Il targeting dei recettori non avviene tra RFP e GFP. Successivamente, inserire qui i parametri per l'acquisizione temporale. Le immagini a 16 bit vengono acquisite con l'impostazione di binning della camera impostata su uno a uno.

Le immagini della fluorescenza rossa e verde vengono acquisite sequenzialmente utilizzando filtri per fluorocromi RFP e GFP tramite uno splitter di fascio R-F-P-G-F-P. Impostare il software in modo da acquisire immagini a intervalli di tempo trentaduesimi per un'ora. Regolare i tempi di esposizione della fotocamera in modo da ottenere intervalli dinamici simili.

Per l'intensità di fluorescenza di RFP e GFP, acquisire le immagini per un minuto, quindi a t uguale a zero aggiungere direttamente nella piastra i 200 microlitri del ligando senza disturbare il campione.

Continuare a raccogliere immagini di fluorescenza per 60 minuti. Dopo l'aggiunta del ligando, mentre le immagini vengono acquisite, verranno memorizzate automaticamente come file TIFF con nomi sequenziali. I file possono quindi essere visualizzati come immagini singole o combinate utilizzando il software.

Infine, dopo aver acquisito tutte le immagini cellulari, acquisire immagini con il mezzo privo di cellule utilizzando le stesse impostazioni. Salvare i file per utilizzarli come immagini di sfondo per analizzare le immagini. Utilizzare la funzione di sottrazione dell'immagine in Metamorph per sottrarre lo sfondo dalle immagini dei dati effettivi ottenute in precedenza.

Questo terrà conto di qualsiasi fondo o autofluorescenza proveniente dal mezzo. Successivamente, dal menu file, aprire l'opzione del file stack generato finale e aprire gli stack individuali delle immagini. Quindi, nelle misurazioni delle regioni, selezionare la traccia regionale dell'eclissi e disegnare le regioni di interesse, selezionando le regioni superficiali e citosoliche per misurare l'intensità di fluorescenza di RFP e GFP corrispondenti alla traslocazione di BLT uno e beta-arrestina.

Utilizzando l'opzione di registrazione dati, che si collega automaticamente a Excel, riportare la quantità di intensità di fluorescenza in funzione del tempo. Questo grafico fornirà informazioni sulla cinetica della traslocazione di una determinata molecola. L'analisi dell'immagine può rivelare la localizzazione di G PCR R, delle proteine citosoliche e del nucleo.

Qui si osserva l'espressione di BT one RFP sulla superficie di una cellula RBL two H three. Questa immagine mostra la localizzazione di beta rest e GFP nel citosol della stessa cellula e qui p nuke CFP è visibile nel nucleo. L'immagine a colori combinata mostrata qui indica la distinta localizzazione cellulare di ciascun fluorocromo; l'interazione indotta dal ligando tra GPCR di superficie e proteine citosoliche può essere valutata anche in questo caso.

Traslocazione indotta da ligando del recettore BLT1 e della beta-arrestina. Questo video mostra l'immagine in tempo reale di una cellula che esprime BLT1-RFP e beta-arrestina-GFP. Dopo l'aggiunta di un micromolare di LTB4, i modelli di traslocazione possono essere quantificati utilizzando il software Metamorph.

Una scansione lineare delle intensità di fluorescenza in una cellula rappresentativa è mostrata a T uguale a zero. BT1 RFP è visibile sulla membrana e beta-arrestina GFP è visibile nel citosol. Dopo l'aggiunta del ligando, si osserva un sovrapposizione delle linee RFP e GFP, suggerendo una codistribuzione del recettore e della beta-arrestina.

Inoltre, qui è possibile determinare la cinetica del movimento delle proteine. La cinetica dell'internalizzazione del recettore e della traslocazione della beta arrestina è stata esaminata dopo l'aggiunta di un micromolare di LTB4.

Le intensità di fluorescenza sono state misurate in funzione del tempo in corrispondenza delle localizzazioni della membrana e del citosol della cellula. L'aggiunta del ligando LTB4 a cellule RRB2H3 trasfettate con BT1-RFP e beta-arrestina1-GFP induce il translocazione di beta-arrestina1-GFP dal citosol alla membrana, osservabile come la formazione di un anello giallo entro un minuto. A seguito dell'interazione con beta-arrestina1-GFP, BT1-RFP forma un complesso recettore-beta-arrestina1-GFP che si transloca attraverso il citosol sotto forma di endosomi, come evidenziato dalla comparsa di punti gialli entro cinque minuti. Utilizzando questi metodi, è possibile determinare lo stato di attivazione del recettore dipendente dal ligando e i motivi o processi critici coinvolti nell'attivazione del recettore.

La cosa più importante nell'esperimento è controllare attentamente il tampone nella piastra durante l'operazione. Mentre l'esperimento prosegue per oltre un'ora dopo il suo avvio. Questa tecnica è apparsa ai ricercatori nel campo delle chemochine e dei recettori per esplorare la migrazione degli ocat e le interazioni tra recettori e ligandi in vari tipi cellulari di mammiferi.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare esperimenti di imaging in tempo reale che coinvolgono chemochine e i loro recettori, nonché le loro interazioni con proteine citosoliche come le beta arrestine.