Name: In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Scopri l'imaging in tempo reale della migrazione cellulare mediata da leucotriene B4 e le interazioni BLT1 con β-arrestina. Questo metodo utilizza cellule dendritiche derivate da midollo osseo per studiare i meccanismi di chemotassi e segnalazione intracellulare.

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La ricerca è sostenuta dal National Institutes of concede Salute AI-52381, CA138623 e Kentucky consiglio Lung Cancer Research e il sostegno istituzionale di James Graham Brown Cancer Center.

Metodologia Descrizione del microscopio Dal vivo gli esperimenti di imaging cellulare eseguita utilizzando TE-FM Epi-Fluorescenza sistema collegato al microscopio invertito Nikon Eclipse TE300. Il microscopio dotato fase di riscaldamento. Un fresco scatto HQ digitale B / N CCD (Roper scientifico) della fotocamera e LAMDA 10-2 filtro ottico changer (società strumento Sutter) è collegata al microscopio. Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono controllati con ruote filtro e controllato da Lamba 10-2 regolatore ruota portafiltri, Sutter Instruments Co. 500 ms Tempo di esposizione dovrebbe essere sufficiente per visualizzare RFP o GFP in cellule vive. Controllo hardware e acquisizione delle immagini sono controllati da software Metamorph. La scelta dei filtri per il presente studio sono, set di filtri S480/20x, S525/40m e S565/25x, S620/60m per la GFP e RFP, rispettivamente; EGFP / DsRed dual dicroiche, Tecnologia Chroma. Questa ruota filtro in grado di ospitare fino a sei set di filtri. Microscopio è collegato con regolatore Prima tappa Proscan con bastone Gioia. Tutti questi allegati hardware può essere controllato da un software Metamorph. Il microscopio è inoltre collegato con Micromanipolatori per tenere la micropipette. A. Misurazione leucotrienici B 4 migrazione Regia cellule dendritiche Utilizzando l'impostazione sopra descritta microscopio, abbiamo sviluppato metodi per seguire ligando la migrazione delle cellule dendritiche diretto in tempo reale. Due micromanipolatori (Narishige) sono collegati al microscopio. La chemiotassi di midollo osseo dei topi cellule dendritiche derivate (BMDCs) verso LTB 4 gradiente è stato registrato. Qui, descriviamo i metodi per preparare il micro-pipette con micro-pipetta estrattore, il caricamento del ligando in micro-pipetta e di iniziare l'esperimento chemiotassi sul palco riscaldato del microscopio di monitorare la migrazione direzionale delle cellule. Questo metodo può essere applicato a testare l'efficacia di diversi fattori chemiotattici nell'indurre la migrazione così come effetto degli inibitori della chemiotassi in cellule vive. L'isolamento di BMDCs 21 da topo è stato descritto in diverse pubblicazioni tra cui JOVE 22. 1. Preparazione del BMDCs <ol><li> Targhetta del BMDCs (dopo coltura per 10 giorni) al piatto copertura Fluoro fondo antiscivolo e permettere loro di crescere per 16 ore prima dell'esperimento. </li><li> Lavare le cellule con 3 ml di PBS 1X almeno 2 volte (con l'aggiunta di 3 ml di PBS 1X alla piastra ed aspirando il fuori buffer). </li><li> Aggiungere 2 ml di 1XPBS al piatto. Le cellule sono ora pronti per l'esperimento. Mantenere le cellule in incubatore a 37 ° C prima di sperimentare. </li></ol> Preparazione del ligando caricata micro pipetta: <ol start="4"><li> Fissare i tubi di vetro capillari (vetro di serie, 0,75 mm x 0,4 mm, 6 ", Cat # 625500, AM Systems, INC) sulla verticale micropipetta estrattore (Narishige International USA, Inc). </li><li> Mantenere la temperatura a 52 ° C e permettono di fondere il vetro e tirare fuori per formare punte spigolo vivo. </li><li> Fissare la pipetta sulla micro-pipetta titolare. </li><li> Smussare i bordi grezzi di micro pipetta con Micro forgiare M-900 (Narishige International USA, Inc), osservando al microscopio. </li><li> Preparare almeno il 10-20 pipette per ciascun esperimento. Nota: Il micropipette possono anche essere acquistati da Strumenti di precisione mondiale (TIP μ, T1801TW1F). </li><li> Prendere concentrazione desiderata (500 l di 100 nM LTB 4 in l'esperimento in corso) di legante in 1 ml di tubo effendorf e mantenere la punta micro pipetta nella soluzione e lasciare che la soluzione per entrare nel micro pipetta (il riempimento). </li><li> Prendere 1 ml di legante e nella siringa (1 cc siringa da tubercolina) e lentamente riempire il ligando tramite Micro-Fill ago (28G MF-5, strumenti di precisione mondiale) nella pipetta micro dall'alto. </li><li> Collegare il tubo, che si adatta perfettamente alla pipetta pipette e tubo per l'ago (21 G 11 / 2) collegato al siringa da 1 ml, che è pieno di legante. </li><li> Ora, muovere con cautela il ligando riempito micro-pipetta alla fase microscopio e fissare su micro-manipolatori. </li><li> Applicare una pressione poco da siringa per fare ligando che si sta lentamente liberando dalla punta. </li><li> Portare il BMDCs placcato immaturo al microscopio e tenerli sul piatto riscaldato (37 ° C) palco. </li><li> Togliere il coperchio del piatto fluoro. </li><li> Concentrare le cellule utilizzando immersione 60X olio lente dell'obiettivo. </li><li> Attenzione, far cadere il ligando caricata pipetta usando 'grossolana Manuale Manipolatore MN-188NE' per la vicinanza delle cellule. </li><li> Messa a fuoco con la pipetta 'Micromanipolatore idraulico Belle MN-188 NE'. </li><li> Applicare una pressione poco da siringa per assicurarsi che ligando sta rilasciando in piatto. </li><li> Impostare i parametri di acquisizione di immagini per l'acquisizione in brillanti depositato (10 esposizione ms) in ogni 15 secondi, per 2 ore utilizzando il software Metamorph. </li><li> Continuare a monitorare ogni 30 min per progression di migrazione verso ligando. </li><li> Se le cellule sono affollate di punta della pipetta, modificare la posizione della punta della piastra per continuare la migrazione di esperimento. </li></ol> B. Misurazione GPCR (BLT1) e proteina citoplasmatica (β-arrestina) Interazioni, traslocazione in cellule vive 1. Preparazione di costrutti di DNA plasmidi I dettagli dei costrutti di DNA plasmidico sono state descritte in Jala et al. (2005) 18. 2. Trasfezione di Human BLT1-RFP e β-arrestina-GFP in cellule RBL-2H3 <ol><li> Mantenere la Rat basofili Leukomia (RBL-2H3) Cells (60 al 70% confluenza) a 37 ° C in atmosfera umidificata del 95% di aria, 5% di CO 2 come colture monostrato in terreni di coltura (DMEM integrato con 15% FBS, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina) nel T75 fiaschi. </li><li> Staccare le cellule dal piatto / fiaschi utilizzando 6 mL di tripsina-EDTA (0,05% tripsina, 0,53 mM EDTA) ed incubare per 5 minuti a 37 ° C in atmosfera umidificata del 95% di aria, 5% di CO 2. Agitare delicatamente i flaconi di monitorare l'entità del distacco delle cellule. </li><li> Aggiungere 6 ml di terreni di crescita a pallone contenente 6 ml di tripsina-EDTA e raccogliere le cellule mescolandoli pipettando su e giù più volte. Trasferire le cellule in 15 ml tubi falco. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e prendere 4 x 10 6 cellule in provette 15 ml centrifuga e centrifugare a 480g per 3 giri min e risospendere in 200 ml di mezzi di trasfezione (DMEM, 20% FBS, 50 HEPES mM). Se si prevede di effettuare 3 trasfezioni, preparare le cellule e dei media tranfection di conseguenza dal numero di cellulare e aumentando il volume del mezzo di trasfezione. </li><li> Preparare i plasmidi da transfettate alle concentrazioni di almeno 1,5 mg / mL. Prepariamo il DNA plasmidico utilizzando DNA Maxi QIAGEN kit plasmide. Aggiungere l'individuo o sia la codifica plasmide DNA umano per BLT1-RFP (25 mcg) e β-arrestin1-GFP (15 mcg) per elettroforesi cuvette sterili, (Bio-Rad # 16552088), che ha distanza tra gli elettrodi 0,4 cm. </li><li> Prendete 200 ml di cellule sopra risospeso e metterli in provette contenenti sia hBLT1-RFP o β-arrestin1-GFP o entrambe insieme e mescolare delicatamente con pipetta da 1 ml sterile. </li><li> Lasciare la cuvette sopra a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Electroporate le cellule in Gene Pulser II con tensione a 250 V e capacità di 500 uF. </li><li> Dopo l'elettroporazione permettere alle cellule rimanere a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Prendere 1 ml di mezzo di crescita regolare e mescolarlo con le cellule elettroporate nella cuvette. </li><li> Distribuire 300 ml di questa miscela in 35 millimetri piatti fondo fibra di vetro cultura (piatto Fluoro, strumenti di precisione Mondiale) contenente 2 ml di terreni di crescita regolare e incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera umidificata del 95% di aria, 5% CO 2. Permettono alle cellule di aderire al fondo del piatto. </li><li> Sostituire i media dopo 1 ora di incubazione con i media una crescita regolare e permettere loro crescere a 37 ° C in atmosfera umidificata al 95% di aria, 5% CO 2 incubatore per 18-24 ore. </li></ol> 3. Cellulare Imaging in diretta Acquisizione di immagini <ol><li> Dopo 18-24 ore, lavare le cellule 2 o 3 volte con 2 ml di caldo rosso fenolo libero RPMI contenente 10 HEPES mM, pH 7,55 (Aggiungere 2 ml di mezzi di comunicazione calda direttamente alla piastra e media aspirare. Ripetere 2 o 3 volte). Aggiungere 1,8 ml di caldo rosso fenolo libero RPMI contenente 10 mM HEPES. </li><li> Posto 30 millimetri di vetro coprioggetto fondo piatti di coltura contenente RBL-2H3 cellule, transfettate con hBLT1-RFP e β-arrestin1-GFP sul palco microscopio riscaldata (37 ° C). </li><li> Raccogliere le immagini delle cellule con ingrandimento 600x con 60 X obiettivo Nikon Piano Apo 60X/1.4 numerica olio apertura dell'obiettivo immersione (disponibile nel nostro sistema microscopio). </li><li> Mettere una goccia di olio sulla lente 60 x obiettivo e mettere a fuoco le cellule con regolare campo chiaro luce trasmessa toccando il fondo della piastra. </li><li> Per monitorare la fluorescenza delle proteine ​​transfettate, passare da campo luminoso (luce trasmessa) a fluorescenza filtro (RFP filtro, se volete vedere dei recettori o GFP, se volete vedere β-arrestin1). </li><li> Scegliere la cella luminoso e sano, che esprime hBLT1-RFP sulla superficie cellulare utilizzando RFP filtro e catturare l'immagine. </li><li> Poi passare alla GFP filtro e fare in modo che β-arrestina-GFP espresso nel citoplasma e catturare l'immagine. Poi il colore pseudo entrambe le immagini, prima che il tempo trascorso catturare immagini cellule vive per assicurarsi che sanguinano attraverso di fluorescenza non sta che si verificano tra GFP e RFP. </li><li> Una volta che la scelta del vostro cellulare fatto, impostare i parametri in base alle proprie finalità utilizzando il software (software Metamorph in questo caso). </li><li> Nella dimostrazione corrente, sedici bit sono le immagini acquisite con il sira impostata binning a 1 X 1 combinato con 60 Piano di X obiettivo Nikon Apo 60X/1.4 numerica olio apertura dell'obiettivo immersione. </li><li> Raccogliere le immagini a fluorescenza per la richiesta di offerta e fluorocromi GFP simultaneamente a 30 sec intervallo di tempo (se le interazioni traslocazione / sono troppo veloce, si possono ridurre gli intervalli di tempo) di queste ruote con filtro controllato dal software Metamorph. </li><li> I tempi di esposizione della fotocamera impostata a 1000 msec per la GFP e RFP. (Impostare i tempi di esposizione specifici a seconda dell'intensità di fluorescenza GFP e RFP). </li><li> In primo luogo il ritiro delle immagini per 1 minuto, senza l'aggiunta di ligando, che serve come punto 0 tempo. </li><li> Aggiungere i 200 ml di legante (dal magazzino di 10 micron ad una concentrazione finale di 1 mM) dopo 1 min senza disturbare la piastra / o la posizione della cella. </li><li> Le immagini a fluorescenza sono raccolti per 60 minuti dopo l'aggiunta del legante e memorizzati come immagini TIFF con ordine crescente dei nomi dei file. </li><li> Tutti questi file possono essere effettuate come file stack con immagini di fluorescenza singoli / combinati con data e ora utilizzando il software. </li></ol> Processo di immagini e quantificazione della fluorescenza di proteine ​​e localizzazione <ol><li> Acquisire le immagini con i media pianura (senza cellule) con filtri RFP e fluorescente GFP e salvarli come immagini di sfondo. Usare queste immagini per sottrarre le immagini reali dati ottenuti in precedenza. </li><li> Preparare la pila di immagini singolarmente per le immagini GFP e RFP. </li><li> Selezionare / definire le diverse regioni (superficie vs citosolico) per misurare l'intensità di fluorescenza di GFP e RFP (BLT1 e β-arrestina traslocazione) </li><li> Tracciare la fluorescenza importo come la funzione del tempo. Questo grafico fornirà le informazioni relative cinetica di traslocazione di data molecola. </li></ol> Rappresentante Risultati A. Misurazione leucotrienici B 4 migrazione Regia cellule dendritiche Il metodo descritto in questo protocollo è stato utilizzato per determinare la migrazione delle cellule dendritiche verso leucotriene B 4 (Figura 1 e video allegato 1) 21. Siamo in grado di applicare la metodologia simile a determinare la capacità chemiotattica di cellule di un ligando particolare in cellule vive. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Midollo osseo del mouse delle cellule dendritiche derivate migrazione verso il 100 nM LTB 4. Video 1. Dal vivo la migrazione delle cellule di BMDCs verso LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Boddulrui_Video1.AVI">Clicca qui per vedere il video</a> . B. Misurazione GPCR (BLT1) e proteina citoplasmatica (β-arrestina) Interazioni, traslocazione in cellule vive Al termine di questa procedura, si possono ottenere le seguenti informazioni in eventi GPCR segnalazione. <ol class="lroman"><li> La localizzazione dei GPCR e proteine ​​citosoliche e nucleo (Figura 2). </li><li> Interazione ligando indotta di superficie GPCR (BLT1 in questo caso) con la proteina citoplasmatica (β-arrestina in questo caso) (Fig. 3). </li><li> Cinetica di internalizzazione recettoriale e β-arrestina traslocazione alla membrana seguita da internalizzazione insieme con i recettori (Figura 4) (Jala et al. 2005) 18. </li><li> Si può determinare la dipendenza ligando stato di attivazione dei recettori in cellule vive (in allegato il video 2) e determinare motivi critici o processi coinvolti nella attivazione del recettore (Jala et al. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Espressione di BLT1-RFP (A), β-arrestina-GFP (B), pNuc-CFP (C) in cellule RBL-2H3. Colore immagine combinata mostrato nel pannello D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Traslocazione ligando del recettore indotta e β-arrestina. Scansione linea di intensità fluorescente nelle cellule sono mostrati. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Cinetica di internalizzazione recettoriale e β-arrestina traslocazione dopo l'aggiunta di 1 mM LTB 4. L'intensità di fluorescenza è stata misurata in funzione del tempo a membrana e luoghi citosolico della cellula. Video 2 immagini dal vivo di cellule che esprimono BLT1-RFP e β-arrestina-GFP sul aggiunta di 1 mM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Bodduluri_Video2.AVI">Clicca qui per guardare il video</a>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;imaging cellulare Live è un potente strumento per dimostrare la funzione e le interazioni delle proteine ​​specifiche che si verificano in tempo reale. I metodi descritti in questo manoscritto mostrano chiaramente che LTB 4 può provocare una rapida migrazione delle cellule dendritiche. Questi metodi non solo ampliare gli aspetti della funzione di LTB 4 tipi di cellule diverse, consentono metodi simili da applicare ad una varietà di altre chemochine e prova la loro efficacia come agenti chemio...

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare di leucemia basofila del ratto (RBL-2H3) o cellule HEK293.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>Delbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI o DMEM senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4Na, liquida</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Pietrine di vetro sterili da 35 mm con fondo in coprivetrino (spessore 0,17 mm) (Fluoro dishes, WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta sterile per Gene Pulser (intervallo tra elettrodi di 0,4 cm) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II elettroporatore </td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema TE-FM ad epi-fluorescenza collegato al microscopio invertito Nikon Eclipse TE300</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Immagini universali</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatrice verticale per trazione</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore idraulico MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore manuale grosso, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Costrutti di cDNA:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA del recettore accoppiato a proteina G marcato con proteina fluorescente rossa in posizione C-terminale (hBLT1-RFP)</td><td>Jala et al. 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td> cDNA della proteina citosolica marcata con GFP&amp;#946;-arrestina1-GFP nello studio attuale).</td><td>Jala et al. 2005</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in tempo reale immagini di leucotriene b 4 migrazione cellulare mediata e blt1 interazioni con β-arrestina

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) appartengono alla famiglia delle sette proteine ​​transmembrana e mediare la trasduzione di segnali extracellulari alle risposte intracellulari. GPCR controllo diverse funzioni biologiche come la chemiotassi, rilascio del calcio intracellulare, regolazione genica in modo ligando dipendente tramite eterotrimeriche proteine ​​G 1-2. Di legame induce una serie di cambiamenti conformazionali che portano all&#39;attivazione di eterotrimeriche G-proteine ​​che modulano i livelli di secondi messaggeri come adenosina monofosfato ciclico (cAMP), inositolo trifosfato (IP3) e glicerolo diacyl (DG). In concomitanza con l&#39;attivazione del legame con il ligando del recettore avvia anche una serie di eventi per attenuare il recettore di segnalazione tramite desensibilizzazione, sequestro e / o internalizzazione. Il processo di desensibilizzazione dei GPCR avviene attraverso la fosforilazione del recettore per G-proteina chinasi del recettore (GRKs) e vincolante successiva β-arrestine 3. β-arrestine sono proteine ​​citosoliche e traslocare a membrana su attivazione GPCR, legandosi ai recettori fosforilati (la maggior parte dei casi) ci internalizzazione del recettore, facilitando 4-6. Leucotriene B 4 (LTB 4) è un pro-infiammatorie molecola lipidica derivati ​​dal percorso di acido arachidonico e media tramite le sue azioni GPCR, LTB 4 recettore 1 (BLT1, un recettore ad alta affinità) e LTB 4 recettore 2 (BLT2, un recettore a bassa affinità ) 7-9. Il 4-BLT1 LTB percorso ha dimostrato di essere critici in diverse malattie infiammatorie tra cui, l&#39;asma, l&#39;artrite e l&#39;aterosclerosi 10-17. Nel documento descrive le metodologie sviluppate per il monitoraggio LTB4-indotto migrazione dei leucociti e le interazioni di BLT1 con β-arrestina e traslocazione dei recettori in cellule vive utilizzando tecniche di imaging microscopia 18-19. Il midollo osseo le cellule dendritiche derivate da C57BL / 6 topi sono state isolate e coltivate come descritto in precedenza 20-21. Queste cellule sono state testate dal vivo nei metodi di imaging cellulare per dimostrare LTB 4 migrazione cellulare indotta. Il BLT1 umano è stato taggati con rosso proteina fluorescente (BLT1-RFP) a C-terminale e β-arrestin1 taggati con proteina fluorescente verde (β-arr-GFP) e transfettate entrambi i plasmidi in Rat basofili Leukomia (RBL-2H3) linee cellulari 18-19. La cinetica di interazione tra queste proteine ​​e localizzazione sono stati monitorati utilizzando vivere videomicroscopia cellulare. Le metodologie nel documento corrente descrivono l&#39;uso di tecniche microscopiche per studiare le risposte funzionali di G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule vive. Nel documento descrive inoltre l&#39;utilizzo di software Metamorph per quantificare l&#39;intensità di fluorescenza per determinare la cinetica dei recettori e le interazioni proteina citoplasmatica.

Questo documento descrive la metodologia per determinare la risposta chemiotattica dei leucociti ai ligandi specifici e identificare le interazioni tra recettori di superficie della cellula e le proteine ​​citosoliche utilizzando vivere tecniche di imaging cellulare.

In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) appartengono alla famiglia delle proteine a sette domini transmembrana e mediano la trasduzione di segnali extracellulari verso...

Il leucotriene B quattro è una molecola pro-infiammatoria che media le proprie azioni attraverso i recettori accoppiati a proteine G, BT uno e BT due, su diverse cellule infiammatorie. È stato dimostrato che la via LTB quattro B LT uno svolge un ruolo fondamentale in numerose malattie infiammatorie, tra cui asma, artrite e aterosclerosi. I recettori accoppiati a proteine G, o GPCR, mediano la trasduzione di segnali extracellulari che inducono risposte intracellulari come chemotassi, rilascio di calcio intracellulare e regolazione genica.Il legame del ligando extracellulare induce una serie di cambiamenti conformazionali che portano all'attivazione delle proteine G eterotrimeriche. Le proteine G modulano quindi i livelli di messaggeri secondari, come l'adenosina monofosfato ciclica, un acetil tri fosfato e il digliceride, per monitorare in tempo reale la migrazione cellulare mediata dal leucotriene B4 in cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, o BMDC, che vengono osservate mentre il ligando viene rilasciato mediante flusso controllato da una micropipetta. Viene effettuata un'acquisizione temporizzata per valutare la migrazione.Utilizzando queste tecniche di imaging in tempo

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.

Microscopia di luce-foglio per visualizzazione tridimensionale delle cellule immuni umane

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia a contrasto temporale e a contrasto di fase per immagini di macrofagi peritoneici residenti nel gradiente C5a di complemento chemiotattico. I protocolli possono essere estesi ad altre cellule immunitarie.

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

L'imaging in vivo delle articolazioni è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA).

In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

Scopri l'imaging in tempo reale della migrazione cellulare mediata da leucotriene B4 e le interazioni BLT1 con β-arrestina. Questo metodo utilizza cellule dendritiche derivate da midollo osseo per studiare i meccanismi di chemotassi e segnalazione intracellulare.

In tempo reale immagini di leucotriene B₄ Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

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