Name: Costruire un Mosquito migliore: lidentificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: Scopri i meccanismi immunitari di Anopheles gambiae e Aedes aegypti contro Plasmodium falciparum e il virus dengue. Questo studio identifica geni di resistenza per sviluppare zanzare transgeniche e strategie innovative di controllo delle malattie.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

costruire un mosquito migliore: l&#39;identificazione dei geni abilitazione malaria e febbre dengue resistenza in a. gambiae e a. aegypti zanzare

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In questa intervista, George Dimopoulos si concentra sui meccanismi fisiologici utilizzato dalle zanzare per combattere Plasmodium falciparum e infezioni da virus dengue. Spiegazione è data per come i geni chiave refrattari, quei geni che conferiscono resistenza agli agenti patogeni vettore, sono identificati nella zanzara e come questa conoscenza può essere utilizzata per generare le zanzare transgeniche che sono in grado di trasportare il parassita della malaria o il virus dengue.

Costruire un Mosquito migliore: l&#39;identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

In questa intervista, George Dimopoulos si concentra sui meccanismi fisiologici utilizzati dalle zanzare per contrastare il Plasmodium falciparum e il virus della dengue...

Sono George Dimopoulos. Sono professore assistente presso il Dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia della Johns Hopkins School of Public Health, all'interno dell'Istituto di Ricerca sulla Malaria. Il mio gruppo di ricerca lavora sulle zanzare del complesso Gambiae che trasmettono la malaria, e studiamo la biologia molecolare della zanzara con un particolare interesse per il sistema immunitario innato della zanzara, che è coinvolto nell'uccisione dei parassiti malarici.Vogliamo comprendere come funziona questo sistema immunitario e quali geni e molecole sono importanti per uccidere il parassita. Crediamo che comprendendo la biologia di questo sistema, saremo in grado di utilizzare queste conoscenze per sviluppare strategie di controllo della Malaria in futuro. La Malaria è una delle malattie più gravi al mondo.È stato presente nell'umanità per sempre, in realtà, ed è vergognoso che ce l'abbiamo ancora. La malaria infetta 400 milioni di persone ogni anno e uccide 2 milioni di persone, principalmente nella regione dell'Africa subsahariana, ma la si riscontra anche in altri paesi in via di sviluppo dell'America del Sud e dell'Asia. La malaria è causata da un parassita protozoo del genere Plasmodium, e esistono quattro specie di Plasmodium in grado di provocare la malaria umana.Il più importante di questi è Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum viene trasmesso principalmente da zanzare appartenenti al genere Anopheles, e le zanzare vettore più importanti per la trasmissione della malaria nell'Africa subsahariana appartengono al complesso di specie Anopheles gambiae, ed sono principalmente distribuite nella regione subsahariana dell'Africa. Il virus della dengue è un virus a RNA, ed è trasmesso principalmente dalla zanzara Aedes aegypti.La sua distribuzione geografica è molto simile a quella della malaria. La riscontriamo nelle Americhe, in Asia sud-orientale e in Africa. Il virus della dengue causa febbre emorragica.Circa 2,5 miliardi di persone sono a rischio a causa del virus della dengue, e il virus provoca febbre emorragica in milioni di persone ogni anno. Negli ultimi 10 anni, la febbre emorragica da dengue si è affermata come una delle malattie trasmesse da vettori più gravi. Il parassita della malaria ha invece un ciclo vitale complesso sia nel vettore zanzara, che trasmette il parassita tra l'ospite umano, sia nell'ospite umano.Il mio gruppo di ricerca sta studiando la biologia della trasmissione della malaria nel morso del zanzara. Quando una zanzara ingerisce un pasto di sangue infetto, ingerisce anche i parassiti Plasmodium falciparum. I gametociti del parassita si fecondano nell'intestino medio e producono un oociste o chinetociste circa tra le 18 e le 35 ore successive all'ingestione del sangue.Questi stadi di Orkin invaderanno l'epitelio intestinale delle zanzare. La maggior parte degli stadi di Orkin viene eliminata dal sistema immunitario della zanzara a questo stadio, ed è proprio su questo processo che concentriamo i nostri studi. Questa è anche un'immagine di microscopia confocale dell'or kinina: l'or kinina che riesce a superare l'intestino medio formerà un cisto sul lato basale qui, e all'interno di questo cisto si svilupperanno migliaia di parassiti allo stadio di sporozoiti, che poi migreranno; circa 15 giorni dopo che la zanzara ha ingerito il pasto ematico, essi raggiungeranno le ghiandole salivari e, dalle ghiandole salivari, gli sporozoiti possono essere trasmessi a un nuovo ospite. Anche il sistema immunitario della zanzara partecipa all'eliminazione degli sporozoiti a questo stadio, quando vengono rilasciati nell'emolinfa della zanzara.Il genoma delle zanzare è stato recentemente sequenziato nel 2002, e ciò ci ha permesso di sviluppare nuovi strumenti di biologia molecolare e genomica per studiare l'espressione genica di tutte le zanzare, circa 14.000 geni, in diverse condizioni di infezione mediante microarray. Questo microarray, sviluppato alcuni anni fa, contiene l'intero trascrittoma delle zanzare, tutti i geni della zanzara noti a quel tempo, nonché i geni del parassita plasmodio. In questo modo possiamo analizzare l'attività dei geni sia della zanzara che del parassita simultaneamente durante l'infezione.Una volta identificati i geni che vengono attivati quando il morso è infettato da parassiti di plasmodio, dobbiamo verificare se questi geni sono coinvolti nell'uccisione del parassita, e lo facciamo mediante un metodo chiamato silenziamento genico tramite interferenza dell'RNA. Fondamentalmente, iniettiamo RNA per i geni che vogliamo bersagliare, e questo RNA a doppio filamento degraderà gli mRNA dei geni nel morso che stiamo mirando, impedendo così la produzione di proteine da parte di questi geni. Successivamente, infetteremo il morso con un parassita.Ora, se abbiamo silenziato o inattivato un certo gene nella zanzara e, a seguito di questo silenziamento, il parassita riesce a stabilire un'infezione più elevata rispetto al normale nelle zanzare non trattate, ciò suggerirebbe che questo gene è in qualche modo coinvolto nell'uccisione dei parassiti della malaria. E questo è davvero il metodo principale che utilizziamo per verificare se i geni sono coinvolti nell'eliminazione dei parassiti nella zanzara.La maggior parte dei parassiti plasmodiali viene eliminata nella zanzara, e disponiamo di solide evidenze che indicano come il sistema immunitario innato della zanzara sia principalmente responsabile di questa eliminazione. Il nostro laboratorio e i laboratori dei nostri collaboratori hanno identificato diverse geni coinvolti in questo processo. Esistono inoltre ceppi di zanzare selezionati geneticamente che non trasmettono la malaria perché uccidono tutti i parassiti nell'intestino medio attraverso meccanismi di difesa immunitaria innata.Sembra che la zanzara possieda una varietà di componenti e meccanismi diversi per contrastare il parassita, e la sfida maggiore attualmente è comprendere come queste funzioni operino e come possiamo manipolarle per sviluppare zanzare resistenti. La zanzara GTI utilizza meccanismi differenti per controllare l'infezione da virus dengue rispetto a quelli che Anopheles gambiae utilizza per controllare l'infezione da plasmodio. La zanzara aegypti, come tutti gli eucarioti, possiede un meccanismo di difesa dipendente dall'RNA chiamato interferenza dell'RNA.È fondamentalmente un meccanismo di difesa in grado di prendere di mira l'RNA virale degradato e, in questo modo, proteggersi dall'infezione virale. Stiamo cercando di comprendere questo meccanismo di difesa e come possiamo manipolarlo per generare zanzare resistenti al virus. Negli ultimi 10 anni, la biologia molecolare ha registrato progressi davvero notevoli, principalmente avanzamenti metodologici che hanno notevolmente accelerato la nostra ricerca.Uno dei principali progressi riguarda le tecnologie di sequenziamento che hanno permesso il sequenziamento ad alto rendimento di interi genomi. Grazie a queste tecnologie, ora disponiamo dei genomi di *Gambia* e di *A*, questo zanzara anofele completamente sequenziati. Ciò ci consente di identificare i geni coinvolti nel controllo delle infezioni in modo molto più semplice rispetto al passato.Un altro progresso molto importante nel campo della genomica funzionale è l'analisi dell'espressione genica ad alto rendimento mediante microarray. I microarray sono piccole lamelle di vetro su cui sono stati immobilizzati migliaia di frammenti di DNA, e possiamo utilizzare questi cosiddetti chip di DNA per monitorare l'espressione genica di un numero molto elevato di geni. Un altro progresso fondamentale nel settore è la metodologia di silenziamento genico mediante interferenza dell'RNA, che ci permette di mirare specifici geni e inattivarli nella zanzara, consentendoci così di adottare un approccio cosiddetto di genetica inversa per studiare la funzione genica e il ruolo dei nostri geni di interesse nell'uccisione del parassita.I zanzare su cui noi e i nostri collaboratori abbiamo condotto la maggior parte di questi studi provengono da colonie di zanzare mantenute in condizioni di laboratorio per un periodo fino a 30 anni. Attualmente, queste zanzare si sono differenziate notevolmente rispetto alle zanzare che troviamo in natura. Le zanzare in natura sono soggette a una pressione selettiva continua da parte dei diversi microrganismi e di altri parametri che variano notevolmente sul campo, a differenza delle condizioni relativamente stabili che abbiamo in laboratorio.Pertanto, si potrebbe sostenere che i nostri studi sarebbero probabilmente molto più informativi se fossero effettuati direttamente su zanzare raccolte in natura. Sfortunatamente, però, ciò non è altrettanto semplice. Come detto, non disponiamo dell'infrastruttura necessaria sul campo e, inoltre, è molto complesso raccogliere zanzare in natura ed allevarne colonie a partire da questi esemplari.Pertanto, i migliori modelli biologici disponibili oggi sono i modelli di laboratorio, ma ovviamente a un certo punto dovremo recarci sul campo per verificare e confermare i principali risultati emersi dalle nostre scoperte con le zanzare di laboratorio. Sappiamo che i sistemi di difesa delle zanzare sono coinvolti nell'uccisione dei patogeni umani che questi insetti trasmettono. Ora, se riusciremo a comprendere come avviene questa eliminazione, quali geni e quali meccanismi sono coinvolti, potremmo potenzialmente manipolarli e utilizzare tale manipolazione per sviluppare zanzare geneticamente modificate incapaci di trasmettere il patogeno.Una volta sviluppati questi zanzare geneticamente modificate, possiamo iniziare a pensare a come introdurle effettivamente nell'ambiente e renderle una specie dominante rispetto alle zanzare suscettibili. Una strategia ampiamente discussa per raggiungere questo obiettivo consiste essenzialmente nella diffusione di geni di resistenza nelle popolazioni naturali, geni che renderebbero le zanzare resistenti ai patogeni, e ciò deve essere ottenuto attraverso meccanismi di trasmissione genetica detta "genetic drive". Attualmente, molte ricerche si concentrano sullo sviluppo di tali meccanismi di genetic drive.Certamente, vi sono molte considerazioni etiche da affrontare riguardo al rilascio in natura di qualsiasi tipo di organismo geneticamente modificato. È importante ricordare che la modifica genetica avviene naturalmente in continuazione in natura. Per quanto riguarda le tre mutazioni, vi è scarsa ragione di ritenere che si possa ottenere una zanzara più efficiente nella trasmissione di un patogeno o dotata di altre caratteristiche non desiderabili.La cosa peggiore che potrebbe accadere è che l'agente patogeno sviluppi resistenza a questa zanzara transgenica in un determinato momento, e ovviamente dovremmo effettuare molti test sul campo e numerosi test in laboratorio prima di prendere in considerazione il rilascio di una zanzara geneticamente modificata nell'ambiente. Dovremmo inoltre informare la popolazione riguardo a queste strategie controllate e assicurarci che tutti si sentano a proprio agio e siano favorevoli a questo tipo di approccio. Esistono ancora molti ostacoli da superare per realizzare una strategia di controllo delle malattie basata sul blocco dell'agente patogeno nel vettore zanzara.Alcuni di questi ostacoli riguardano problemi tecnici e sperimentali che dobbiamo risolvere. Uno degli ostacoli è, ad esempio, lo sviluppo di meccanismi di trasmissione genetica, meccanismi che permetterebbero in modo efficiente la diffusione di questi geni di resistenza nelle popolazioni. Il settore scientifico della biologia dei vettori di malattie ha conosciuto un progresso traumatico negli ultimi 10-15 anni, soprattutto a causa della consapevolezza che la comprensione della biologia dell'interazione tra insetti e patogeni potrebbe effettivamente aiutarci a sviluppare strategie di controllo.E questo riconoscimento ha portato a un aumento dei finanziamenti destinati alla ricerca in questo campo. È estremamente importante che tali finanziamenti e l'impegno vengano mantenuti, in modo da conservare l'impulso raggiunto e portare a termine la nostra missione, comprendendo la biologia dell'interazione vettore-patogeno e come possiamo utilizzare questa conoscenza biologica per sviluppare strategie di controllo delle malattie.

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Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per il virus della dengue, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni virali all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come il grado di dengue di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per crescere il virus in coltura, l'alimentazione a membrana zanzare sangue umano, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

In questa intervista candida, Anthony A. James spiega come la genetica delle zanzare può essere sfruttato per controllare la malaria e la dengue trasmissione. Sostituzione strategia di popolazione, l'idea che le zanzare transgeniche possono essere rimessi in libertà per controllare la trasmissione della malattia, viene introdotto anche il concetto di unità genetica e il criterio di progettazione di un sistema efficace di unità genetiche. Le considerazioni etiche di rilasciare organismi...

Prevenire la diffusione della malaria e la dengue utilizzo Zanzare geneticamente modificate

Oligonucleotidi possono essere utilizzati per il sito specifico sostituire un singolo nucleotide dei geni bersaglio transfettate in entrambe...

Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi

Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile per la modifica dell'espressione genica in modo spaziotemporale controllato che consente l'analisi genetica funzionale in Anopheles gambiae. Le procedure descritte per l'utilizzo di questo sistema sono una strategia di clonazione semi-standardizzata, sexing e screening delle pupe per marcatori proteici fluorescenti e fissazione dell'embrione.

Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

I protocolli qui riportati illustrano tre modi alternativi per valutare le prestazioni delle zanzare geneticamente modificate destinate al controllo dei vettori in studi in piccole gabbie contenute in laboratorio. Ogni protocollo è adattato alla modifica specifica che il ceppo di zanzara porta (gene drive o non gene drive) e ai tipi di parametri misurati.

Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofelino geneticamente modificate

Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

La ghiandola salivare della zanzara adulta (SG) è necessaria per la trasmissione di tutti gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare ai loro ospiti umani, inclusi virus e parassiti. Questo video dimostra l'efficiente isolamento degli SG dalle zanzare Anopheles gambiae allo stadio larvale (L4) e la preparazione degli SG L4 per ulteriori analisi.

Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae

Data la loro semplice anatomia, i testicoli Anopheles offrono un buon modello citologico per lo studio della spermatogenesi. Questo protocollo descrive l'ibridazione in situ a fluorescenza intera , una tecnica utilizzata per studiare questo processo biologico, nonché il fenotipo di ceppi transgenici che ospitano mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di spermatozoi.

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Scopri i meccanismi immunitari di Anopheles gambiae e Aedes aegypti contro Plasmodium falciparum e il virus dengue. Questo studio identifica geni di resistenza per sviluppare zanzare transgeniche e strategie innovative di controllo delle malattie.

Costruire un Mosquito migliore: lidentificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare (Video) | JoVE Journal

Costruire un Mosquito migliore: l'identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

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