Costruire un Mosquito migliore: l'identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

Sono George Dimopoulos. Sono professore assistente presso il Dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia della Johns Hopkins School of Public Health, all'interno dell'Istituto di Ricerca sulla Malaria. Il mio gruppo di ricerca lavora sulle zanzare del complesso Gambiae che trasmettono la malaria, e studiamo la biologia molecolare della zanzara con un particolare interesse per il sistema immunitario innato della zanzara, che è coinvolto nell'uccisione dei parassiti malarici.

Vogliamo comprendere come funziona questo sistema immunitario e quali geni e molecole sono importanti per uccidere il parassita. Crediamo che comprendendo la biologia di questo sistema, saremo in grado di utilizzare queste conoscenze per sviluppare strategie di controllo della Malaria in futuro. La Malaria è una delle malattie più gravi al mondo.

È stato presente nell'umanità per sempre, in realtà, ed è vergognoso che ce l'abbiamo ancora. La malaria infetta 400 milioni di persone ogni anno e uccide 2 milioni di persone, principalmente nella regione dell'Africa subsahariana, ma la si riscontra anche in altri paesi in via di sviluppo dell'America del Sud e dell'Asia. La malaria è causata da un parassita protozoo del genere Plasmodium, e esistono quattro specie di Plasmodium in grado di provocare la malaria umana.

Il più importante di questi è Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum viene trasmesso principalmente da zanzare appartenenti al genere Anopheles, e le zanzare vettore più importanti per la trasmissione della malaria nell'Africa subsahariana appartengono al complesso di specie Anopheles gambiae, ed sono principalmente distribuite nella regione subsahariana dell'Africa. Il virus della dengue è un virus a RNA, ed è trasmesso principalmente dalla zanzara Aedes aegypti.

La sua distribuzione geografica è molto simile a quella della malaria. La riscontriamo nelle Americhe, in Asia sud-orientale e in Africa. Il virus della dengue causa febbre emorragica.

Circa 2,5 miliardi di persone sono a rischio a causa del virus della dengue, e il virus provoca febbre emorragica in milioni di persone ogni anno. Negli ultimi 10 anni, la febbre emorragica da dengue si è affermata come una delle malattie trasmesse da vettori più gravi. Il parassita della malaria ha invece un ciclo vitale complesso sia nel vettore zanzara, che trasmette il parassita tra l'ospite umano, sia nell'ospite umano.

Il mio gruppo di ricerca sta studiando la biologia della trasmissione della malaria nel morso del zanzara. Quando una zanzara ingerisce un pasto di sangue infetto, ingerisce anche i parassiti Plasmodium falciparum. I gametociti del parassita si fecondano nell'intestino medio e producono un oociste o chinetociste circa tra le 18 e le 35 ore successive all'ingestione del sangue.

Questi stadi di Orkin invaderanno l'epitelio intestinale delle zanzare. La maggior parte degli stadi di Orkin viene eliminata dal sistema immunitario della zanzara a questo stadio, ed è proprio su questo processo che concentriamo i nostri studi. Questa è anche un'immagine di microscopia confocale dell'or kinina: l'or kinina che riesce a superare l'intestino medio formerà un cisto sul lato basale qui, e all'interno di questo cisto si svilupperanno migliaia di parassiti allo stadio di sporozoiti, che poi migreranno; circa 15 giorni dopo che la zanzara ha ingerito il pasto ematico, essi raggiungeranno le ghiandole salivari e, dalle ghiandole salivari, gli sporozoiti possono essere trasmessi a un nuovo ospite. Anche il sistema immunitario della zanzara partecipa all'eliminazione degli sporozoiti a questo stadio, quando vengono rilasciati nell'emolinfa della zanzara.

Il genoma delle zanzare è stato recentemente sequenziato nel 2002, e ciò ci ha permesso di sviluppare nuovi strumenti di biologia molecolare e genomica per studiare l'espressione genica di tutte le zanzare, circa 14.000 geni, in diverse condizioni di infezione mediante microarray. Questo microarray, sviluppato alcuni anni fa, contiene l'intero trascrittoma delle zanzare, tutti i geni della zanzara noti a quel tempo, nonché i geni del parassita plasmodio. In questo modo possiamo analizzare l'attività dei geni sia della zanzara che del parassita simultaneamente durante l'infezione.

Una volta identificati i geni che vengono attivati quando il morso è infettato da parassiti di plasmodio, dobbiamo verificare se questi geni sono coinvolti nell'uccisione del parassita, e lo facciamo mediante un metodo chiamato silenziamento genico tramite interferenza dell'RNA. Fondamentalmente, iniettiamo RNA per i geni che vogliamo bersagliare, e questo RNA a doppio filamento degraderà gli mRNA dei geni nel morso che stiamo mirando, impedendo così la produzione di proteine da parte di questi geni. Successivamente, infetteremo il morso con un parassita.

Ora, se abbiamo silenziato o inattivato un certo gene nella zanzara e, a seguito di questo silenziamento, il parassita riesce a stabilire un'infezione più elevata rispetto al normale nelle zanzare non trattate, ciò suggerirebbe che questo gene è in qualche modo coinvolto nell'uccisione dei parassiti della malaria. E questo è davvero il metodo principale che utilizziamo per verificare se i geni sono coinvolti nell'eliminazione dei parassiti nella zanzara.

La maggior parte dei parassiti plasmodiali viene eliminata nella zanzara, e disponiamo di solide evidenze che indicano come il sistema immunitario innato della zanzara sia principalmente responsabile di questa eliminazione. Il nostro laboratorio e i laboratori dei nostri collaboratori hanno identificato diverse geni coinvolti in questo processo. Esistono inoltre ceppi di zanzare selezionati geneticamente che non trasmettono la malaria perché uccidono tutti i parassiti nell'intestino medio attraverso meccanismi di difesa immunitaria innata.

Sembra che la zanzara possieda una varietà di componenti e meccanismi diversi per contrastare il parassita, e la sfida maggiore attualmente è comprendere come queste funzioni operino e come possiamo manipolarle per sviluppare zanzare resistenti. La zanzara GTI utilizza meccanismi differenti per controllare l'infezione da virus dengue rispetto a quelli che Anopheles gambiae utilizza per controllare l'infezione da plasmodio. La zanzara aegypti, come tutti gli eucarioti, possiede un meccanismo di difesa dipendente dall'RNA chiamato interferenza dell'RNA.

È fondamentalmente un meccanismo di difesa in grado di prendere di mira l'RNA virale degradato e, in questo modo, proteggersi dall'infezione virale. Stiamo cercando di comprendere questo meccanismo di difesa e come possiamo manipolarlo per generare zanzare resistenti al virus. Negli ultimi 10 anni, la biologia molecolare ha registrato progressi davvero notevoli, principalmente avanzamenti metodologici che hanno notevolmente accelerato la nostra ricerca.

Uno dei principali progressi riguarda le tecnologie di sequenziamento che hanno permesso il sequenziamento ad alto rendimento di interi genomi. Grazie a queste tecnologie, ora disponiamo dei genomi di *Gambia* e di *A*, questo zanzara anofele completamente sequenziati. Ciò ci consente di identificare i geni coinvolti nel controllo delle infezioni in modo molto più semplice rispetto al passato.

Un altro progresso molto importante nel campo della genomica funzionale è l'analisi dell'espressione genica ad alto rendimento mediante microarray. I microarray sono piccole lamelle di vetro su cui sono stati immobilizzati migliaia di frammenti di DNA, e possiamo utilizzare questi cosiddetti chip di DNA per monitorare l'espressione genica di un numero molto elevato di geni. Un altro progresso fondamentale nel settore è la metodologia di silenziamento genico mediante interferenza dell'RNA, che ci permette di mirare specifici geni e inattivarli nella zanzara, consentendoci così di adottare un approccio cosiddetto di genetica inversa per studiare la funzione genica e il ruolo dei nostri geni di interesse nell'uccisione del parassita.

I zanzare su cui noi e i nostri collaboratori abbiamo condotto la maggior parte di questi studi provengono da colonie di zanzare mantenute in condizioni di laboratorio per un periodo fino a 30 anni. Attualmente, queste zanzare si sono differenziate notevolmente rispetto alle zanzare che troviamo in natura. Le zanzare in natura sono soggette a una pressione selettiva continua da parte dei diversi microrganismi e di altri parametri che variano notevolmente sul campo, a differenza delle condizioni relativamente stabili che abbiamo in laboratorio.

Pertanto, si potrebbe sostenere che i nostri studi sarebbero probabilmente molto più informativi se fossero effettuati direttamente su zanzare raccolte in natura. Sfortunatamente, però, ciò non è altrettanto semplice. Come detto, non disponiamo dell'infrastruttura necessaria sul campo e, inoltre, è molto complesso raccogliere zanzare in natura ed allevarne colonie a partire da questi esemplari.

Pertanto, i migliori modelli biologici disponibili oggi sono i modelli di laboratorio, ma ovviamente a un certo punto dovremo recarci sul campo per verificare e confermare i principali risultati emersi dalle nostre scoperte con le zanzare di laboratorio. Sappiamo che i sistemi di difesa delle zanzare sono coinvolti nell'uccisione dei patogeni umani che questi insetti trasmettono. Ora, se riusciremo a comprendere come avviene questa eliminazione, quali geni e quali meccanismi sono coinvolti, potremmo potenzialmente manipolarli e utilizzare tale manipolazione per sviluppare zanzare geneticamente modificate incapaci di trasmettere il patogeno.

Una volta sviluppati questi zanzare geneticamente modificate, possiamo iniziare a pensare a come introdurle effettivamente nell'ambiente e renderle una specie dominante rispetto alle zanzare suscettibili. Una strategia ampiamente discussa per raggiungere questo obiettivo consiste essenzialmente nella diffusione di geni di resistenza nelle popolazioni naturali, geni che renderebbero le zanzare resistenti ai patogeni, e ciò deve essere ottenuto attraverso meccanismi di trasmissione genetica detta "genetic drive". Attualmente, molte ricerche si concentrano sullo sviluppo di tali meccanismi di genetic drive.

Certamente, vi sono molte considerazioni etiche da affrontare riguardo al rilascio in natura di qualsiasi tipo di organismo geneticamente modificato. È importante ricordare che la modifica genetica avviene naturalmente in continuazione in natura. Per quanto riguarda le tre mutazioni, vi è scarsa ragione di ritenere che si possa ottenere una zanzara più efficiente nella trasmissione di un patogeno o dotata di altre caratteristiche non desiderabili.

La cosa peggiore che potrebbe accadere è che l'agente patogeno sviluppi resistenza a questa zanzara transgenica in un determinato momento, e ovviamente dovremmo effettuare molti test sul campo e numerosi test in laboratorio prima di prendere in considerazione il rilascio di una zanzara geneticamente modificata nell'ambiente. Dovremmo inoltre informare la popolazione riguardo a queste strategie controllate e assicurarci che tutti si sentano a proprio agio e siano favorevoli a questo tipo di approccio. Esistono ancora molti ostacoli da superare per realizzare una strategia di controllo delle malattie basata sul blocco dell'agente patogeno nel vettore zanzara.

Alcuni di questi ostacoli riguardano problemi tecnici e sperimentali che dobbiamo risolvere. Uno degli ostacoli è, ad esempio, lo sviluppo di meccanismi di trasmissione genetica, meccanismi che permetterebbero in modo efficiente la diffusione di questi geni di resistenza nelle popolazioni. Il settore scientifico della biologia dei vettori di malattie ha conosciuto un progresso traumatico negli ultimi 10-15 anni, soprattutto a causa della consapevolezza che la comprensione della biologia dell'interazione tra insetti e patogeni potrebbe effettivamente aiutarci a sviluppare strategie di controllo.

E questo riconoscimento ha portato a un aumento dei finanziamenti destinati alla ricerca in questo campo. È estremamente importante che tali finanziamenti e l'impegno vengano mantenuti, in modo da conservare l'impulso raggiunto e portare a termine la nostra missione, comprendendo la biologia dell'interazione vettore-patogeno e come possiamo utilizzare questa conoscenza biologica per sviluppare strategie di controllo delle malattie.