Name: Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Impara la cultura di sezioni organotipiche di cervello di ratto E18 per studiare lo sviluppo corticale e la migrazione neuronale. Questa tecnica consente di mantenere il tessuto cerebrale in vitro per esperimenti di neuroscienza.

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slice cultura organotipica di e18 cervello dei topi

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Culture fetta organotipica dal cervello di roditori embrionali sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello. Mentre ci sono spesso i vantaggi di un sistema in vivo, le culture fetta organotipica permettono di eseguire una serie di manipolazioni che non sono attualmente realizzabili in vivo. Ad oggi, organtotypic embrionale culture fetta del cervello sono stati usati per seguire le singole celle utilizzando la microscopia time-lapse, manipolare l&#39;espressione dei geni nel emanances gangliare (una regione che è difficile da bersaglio in utero elettroporazione), così come per farmacologico studi. In questo protocollo video che mostrano come fare le culture fetta organotipica da embrioni di ratto giorno 18 embrioni. Il protocollo prevede la dissezione degli embrioni, includendole nella bassa temperatura di fusione del ghiaccio in agarosio, affettare il cervello incorporato sul vibratome e, infine, placcatura le fette su filtri in capsule di Petri. Questo protocollo è applicabile anche nella sua forma attuale a rendere culture fetta organotipica da diverse età embrionale sia per ratti e topi.

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Le colture di sezioni organotipiche di cervelli embrionali di roditori sono ampiamente utilizzate per studiare lo sviluppo cerebrale. Sebbene i sistemi in vivo presentino spesso dei vantaggi, ...

Il mio nome è Laura Elias. Sono una studentessa laureata in neuroscienze che lavora nel laboratorio di Arnold K. Stein. Siamo presso l'Istituto di Medicina Rigenerativa qui all'UCSF e oggi vi mostrerò come eseguire colture organotipiche di fette di cervello di ratto E18.Questa procedura prevede l'estrazione dei cervelli, il loro inserimento in agarosio a basso punto di fusione, il taglio in sezioni con il viome e l'acquisizione delle sezioni corona, per poi posizionarle nel sistema di coltura di fetta. Esistono alcune attrezzature e reagenti importanti che utilizziamo per questa procedura di coltura di fetta. È necessario un microscopio stereoscopico per l'estrazione dei cervelli.Utilizziamo anche questo V come un vibram VT 1000 S, ed è un buon sistema per tagliare le fette. La colla può essere importante. Usiamo questo tipo di bloccaggio per una colla che fissa molto bene i cervelli, perché a volte, se si utilizza il tipo sbagliato di colla, i cervelli potrebbero staccarsi durante il taglio, il che potrebbe creare problemi.Utilizziamo anche questi filtri milli cell, che sono i filtri sui quali piastriamo le nostre fette durante la coltura, e questa è un'altra fase importante del processo. Bene, quindi prima di iniziare il processo di coltura delle fette, ci sono alcune fasi preliminari che dovrete completare. Per prima cosa, dovete preparare il vostro A CSF e, una volta terminata la preparazione, dovete metterlo sul ghiaccio in modo che si raffreddi e contemporaneamente iniziare a saturarlo con carbogeno.È inoltre necessario preparare l'agarosio al 4%. Per farlo, utilizzare agarosio a basso punto di fusione, scioglierlo in un liquido cefalorachidiano (CSF), riscaldare al microonde e quindi mantenerlo a 50 gradi fino all'inclusione dei cervelli. È inoltre necessario preparare il mezzo per colture di sezioni; dopo averlo preparato, il mezzo va posto a 37 gradi in modo che inizi a scaldarsi, così da trovarsi alla temperatura corretta quando vi si inseriranno le sezioni alla fine.A questo punto, dovresti essere pronto a raccogliere i tuoi strumenti e iniziare il processo di coltura di fettine. Bene, ora prepareremo colture di fettine dai cervelli di embrioni di ratto al diciottesimo giorno embrionale. Per prima cosa, verificherò che la madre sia completamente anestetizzata mediante stimolazione del pizzicamento delle dita dei piedi.Ecco un esempio in cui il ratto presenta ancora un minuscolo riflesso e ritrae leggermente la zampa posteriore quando gli stringo il piede. Dovremo quindi aspettare più a lungo o riaddormentarlo un po', finché non osserviamo alcuna reazione. A questo punto procederò ad aprire l'animale per recuperare gli embrioni.E voglio semplicemente sollevare la pelle in modo da poter effettuare un taglio pulito. Rimuovo alcuni embrioni qui, e li andrò a escindere. Quindi puoi tagliare tra due embrioni e poi procedere con il taglio lungo.Ora possiamo rimuovere questo embrione e staccarlo dalla placenta praticando un'incisione proprio adiacente alla placenta. Ora sposteremo l'embrione nel CSF freddo e rimuoveremo il resto del sacco qui. Sì, questo e tagliamo qui.Ora questo embrione è pronto e procederemo a preparare sezioni cerebrali. Bene, ora abbiamo il nostro embrione e procederò a rimuovere la testa con le forbici. Ok, ora sono pronto per dissezionare il cervello.Prima dobbiamo immobilizzare la testa, e lo facciamo inserendo dei perni attraverso le orbite oculari e anche nel cervelletto. Questo ci aiuta a immobilizzare il cervello nella piastra. Quindi, come vedete qui ora, abbiamo un cervello immobilizzato nella nostra piastra, e inizieremo praticando un'incisione nel cervelletto per poi procedere più anteriormente.Quindi inizierò effettuando un'incisione qui vicino al cervelletto. Inserirò le forbici sotto la pelle e il cranio, quindi sposterò l'incisione verso l'area di Roswell. Poi realizzerò altre due incisioni lateralmente, all'estremità del cervello, vicino al sero meum.Effettuerò un'incisione lateralmente in quella direzione, e poi un'incisione lì. Quindi userò la pinzetta per staccare il cranio in questo modo. Ora abbiamo esposto il cervello, e quindi lo preleverò dalla testa così.Ecco qui il tuo cervello completamente dissezionato. Ora procederemo a incapsulare questi cervelli in agarosio, e io ho preparato in anticipo dell'agarosio al 4% a basso punto di fusione. Preparatelo in un liquido cefalorachidiano, riscaldatelo al microonde e poi mantenete a circa 50 gradi per far sì che rimanga liquido.E ora inizierò il processo di inclusione. Prenderò quindi un po' di questo agaro e lo metterò in queste capsule, riempiendole quasi fino all'orlo, queste qui. Bene, quindi il primo passo consiste nel prendere i cervelli e sciacquarli semplicemente in una capsula contenente agaro.Non si desidera liquido in eccesso sui cervelli perché impedisce loro di incorporarsi e aderire correttamente all'agarosio. Pertanto, se non vengono lavati accuratamente nel primo passaggio, tendono a fuoriuscire dall'agarosio quando si tenta di tagliarli sul viome. Per questo motivo, li agitiamo delicatamente per rimuovere il liquido in eccesso.Quindi trasferiremo questi cervelli in altre piastre contenenti l'agarosio al 4% mostrato qui. Ora stiamo posizionando i cervelli all'interno dell'agarosio. È importante non posizionarli troppo vicino al fondo o al bordo superiore della piastra, in modo che siano completamente circondati da agarosio su tutti i lati.E poi posizioneremo il coperchio su questa piastra, la copriremo, e quindi metteremo la piastra sul ghiaccio in modo che il ris si indurisca e il cervello venga ben incorporato nell'agarosio. L'agarosio dovrebbe indurirsi in circa cinque o dieci minuti. Bene, ora abbiamo i nostri cervelli incorporati nell'agarosio e inizieremo a sezionarli qui sul vibratomo per ottenere sezioni spesse circa 300 micron, che utilizzeremo per la coltura di fette. Eseguiremo questa operazione, così come tutte le altre procedure descritte, in un liquido cerebrospinale freddo (CSF) saturo con carbogeno.E ora siamo pronti per iniziare. Bene, ora inizieremo rimuovendo il cervello dall'agros. Stiamo quindi per togliere la parte superiore qui, e a volte è necessario aiutare a fare in modo che il blocco di agros esca dalla parte superiore.Vediamo qui. Puoi semplicemente posizionarlo nella parte inferiore. Ora abbiamo l'agros, e quello che faremo è tagliare all'interno dell'agros in modo da asportare fondamentalmente il cervello.Quindi farò quattro tagli: uno posteriore, uno all'estremità anteriore e due lungo i lati. In pratica, sto semplicemente asportando il cervello così come l'abbiamo incluso. Ora abbiamo praticato delle incisioni e tagliato il cervello nell'agarosio.E ora dovremmo essere in grado di estrarre semplicemente il nostro cervello dall'agar qui. Quindi il cervello è uscito perfettamente ed è incorporato nell'agar. Ora prenderemo la colla e la posizioneremo su questo piccolo supporto qui. Set.Quindi applicheremo una piccola quantità di colla e posizioneremo il cervello direttamente sopra questa colla. Fondamentalmente, il cervelletto, ovvero il cervello posteriore, sarà rivolto verso la colla, mentre il bulbo olfattivo o l'estremità rostrale sarà orientato verso l'alto. Successivamente, sposteremo il tutto nella camera del vibrotaglio.Ora trasferisco il cervello nel viome, dove verrà sezionato. Ecco fatto. Lo posizioniamo nel Vibram e lo stringiamo in questo modo.Quindi aggiungeremo la CSF gorgogliante fredda che ho qui sul ghiaccio. Questo indurisce ulteriormente la colla, il che è importante. A questo punto, il nostro cervello sarà fissato alla piastra nel vibratomo.Ora siamo pronti per iniziare a sezionare il cervello sul vibratomo. Rimuoverò un po' di questo agar in eccesso. Procederemo quindi effettuando un'incisione e rimuovendo questa parte.Ora abbiamo qui il nostro cervello. Posizionerò la lama sulla testa del vibratome. La lama verrà semplicemente inserita qui e posizionata sul vibratome.E taglierò anche questa piccola pipetta qui, in modo che sia abbastanza grande da raccogliere le sezioni una volta tagliate. Quindi, ecco fatto. E ora siamo pronti per iniziare a tagliare.Come ho detto, ho utilizzato sezioni di 300 micron per questo. Dovremo quindi spostare la nostra lama verso il cervello, alzando la piastra. Ok, quindi innanzitutto stiamo posizionando la lama esattamente prima del tessuto; i primi tagli colpiranno o l'agar o forse le aree più esterne, ma servono semplicemente per posizionare correttamente la lama.Abbiamo la vibrazione a circa sette e la velocità a circa cinque. Stiamo quindi tagliando per ottenere sezioni coronali corticali. Partiamo dall'estremità molto rostrale del cervello e in questo momento siamo appena entrati nel cervello.Quindi stiamo appena iniziando. Questa è la nostra prima sezione, ma è quasi completamente rostrale a questo punto. Continueremo quindi con le mie sezioni manuali.Mentre i tagli escono, li rimuovo con il piede e li colloco in un liquido cefalorachidiano (CSF) a temperatura ambiente e in ebollizione. È anche facoltativo aggiungere del ghiaccio nella camera per mantenere tutto ancora più freddo, soprattutto con questi cervelli embrionali. Prima coltura su ghiaccio.Sembra che sopravvivano perfettamente bene fintanto che il tuo liquido cerebrospinale (A CSF) è ghiacciato. Tuttavia, per altri esperimenti, o se i tuoi cervelli sono leggermente più vecchi, potresti voler mettere del ghiaccio nella camera solo per mantenere tutto estremamente freddo. Ora abbiamo quindi le nostre sezioni nel liquido cerebrospinale (A CSF) aerato.Possono rimanere qui per circa un'ora, ma possiamo anche procedere direttamente inserendoli nel nostro sistema di coltura di tessuto. Ok, ora siamo pronti per preparare le piastre e il sistema di coltura, in modo da poter incubare le sezioni che abbiamo appena preparato. Prendiamo quindi una piastra a sei pozzetti.E ora, in ciascuno di questi pozzetti, aggiungeremo circa un millilitro e mezzo del mezzo di coltura per tessuti che abbiamo preparato in precedenza e riscaldato a 37 gradi, circa un millilitro e mezzo in ciascuna di queste piastre. Quindi prenderò i miei filtri. In effetti, collocheremo le sezioni cerebrali su questi filtri, ma prima dobbiamo posizionare i filtri sul mezzo qui presente.Quindi posizioneremo i filtri sopra il mezzo che si desidera eliminare, spostando almeno le bolle verso il lato. Non si devono avere bolle sotto il filtro. Questi filtri permettono alle sezioni di assorbire i nutrienti dal mezzo restando esposte all'aria, in modo che, in sostanza, non soffochino.Ora abbiamo i nostri filtri nella piastra e siamo pronti a prelevare le nostre sezioni e trasferirle sui filtri. Abbiamo qui le sezioni in questa piastra, dove ho rimosso la maggior parte dell’A CSF. Pertanto, voglio aggiungere rapidamente il mezzo di coltura per sezioni, poiché in pratica è necessario trasferirle dall’A CSF al mezzo di coltura per sezioni.Aggiungerò quindi del mezzo di coltura ai miei preparati. Cercherò di farlo delicatamente per non danneggiare troppo i preparati. Ora i miei preparati sono immersi nel mezzo di coltura e dovrò trasferirli su questi filtri, i tre filtri che ho qui.Prenderò quindi la mia pipetta e aspirerò il taglio, quindi lo posizionerò sul filtro. È possibile posizionare alcuni tagli sullo stesso filtro, oppure, se si preferisce, un solo taglio. Metterò alcuni tagli su questo filtro.Quindi è importante rimuovere qui l'eccesso di mezzo che si è trasferito. In questo caso, sto semplicemente prelevando il mezzo in eccesso che ho trasferito insieme alle fette, poiché non si desidera troppo mezzo in queste piastre, altrimenti le fette verrebbero coperte dal mezzo e non durerebbero a lungo, in quanto tenderebbero a non ricevere abbastanza ossigeno. A questo punto, ho rimosso il mezzo in eccesso e ora le mie fette sono semplicemente posizionate sulla piastra e sono pronte per essere inserite nell'incubatrice.Bene, ora queste fette sono pronte per essere collocate nell'incubatore a 37 °C. Possono essere utilizzate entro cinque-sette giorni. Il mezzo di coltura viene sostituito ogni tre giorni circa, sostituendone metà con mezzo fresco.E così procederò semplicemente a inserire queste colture nell'incubatrice. Bene, questo è tutto. Abbiamo finito.Pertanto, utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare diversi aspetti dello sviluppo corticale, inclusa la divisione dei progenitori e la migrazione neuronale. Questa tecnica può risultare particolarmente utile se abbinata alla microscopia in time-lapse, in modo da poter seguire singole cellule mentre si dividono e migrano nella coltura di tessuto in slice.

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Il organoptypic dell'ippocampo modello cultura fetta è...

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.

Organotipica Culture Slice ippocampale

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

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Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

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Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Questo video mostra un metodo per preparare colture organotipiche di fette di ippocampo dal cervello di un cucciolo di ratto. Delinea le fasi coinvolte nella dissezione dell'ippocampo, nel taglio e nelle condizioni di coltura necessarie per promuovere la vitalità cellulare e la crescita nelle fette dell'ippocampo, generando infine colture di fette organotipiche.

Preparazione di colture organotipiche di fette dall'ippocampo di un cucciolo di ratto

Il video dimostra un metodo per ottenere fette di corteccia rinale-ippocampo dal cervello di un cucciolo di ratto e coltivarle in inserti membranosi all'interno di una piastra multi-pozzetto riempita con terreno per ulteriori analisi.

Preparazione di fette di corteccia rinale-ippocampo da un cervello di cucciolo di ratto

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Descriviamo un protocollo per l'espressione specifica del tipo di cellula del sensore basato su FRET codificato geneticamente ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni organotipiche del prosencefalo del topo. Inoltre, mostriamo come utilizzare questo sensore per l'imaging dinamico dei livelli di ATP cellulare in neuroni e astrociti.

Imaging di ATP intracellulare in fette di tessuto organicino del cervello del topo utilizzando il sensore basato su FRET ATeam1.03YEMK

Qui descriviamo la preparazione di fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. Sotto una graduale e controllata privazione del siero, queste fette raffigurano eventi epilettici in evoluzione e possono essere considerate un modello ex vivo di epileptogenesi. Questo sistema rappresenta un ottimo strumento per monitorare la dinamica dell'attività spontanea, nonché per valutare la progressione delle caratteristiche neuroinfiammatorie durante tutto il corso dell'epileptogenesi.

Un modello di epileptogenesi nelle culture delle fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo

Impara la cultura di sezioni organotipiche di cervello di ratto E18 per studiare lo sviluppo corticale e la migrazione neuronale. Questa tecnica consente di mantenere il tessuto cerebrale in vitro per esperimenti di neuroscienza.

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

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