Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Questo video mostra una procedura per analizzare la morfologia di dendriti e assoni, noti collettivamente come neuriti, utilizzando un programma semi-automatico al fine di osservare i cambiamenti locali. Il software First Neuron J viene utilizzato per tracciare immagini TIFF a otto bit di neuroni per identificare la posizione dei segmenti di neurite. Il software Neuron Studio viene quindi utilizzato per definire le informazioni strutturali sulla connettività tra i neuriti.

Infine, viene eseguito il programma MATLAB per estrarre dati morfologici dalle cellule, inclusa l'analisi dei banchi, nonché il numero di punti di ramificazione dei neuriti e le punte dei neuriti. I risultati mostrano cambiamenti locali nella morfologia dei neuriti in base alle prestazioni dell'analisi dei banchi su sottoregioni del pergolato nevrotico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi manuale delle secche, è che il programma è semiautomatico, il che aumenta notevolmente l'efficienza dell'analisi e consente di controllare i dati in modo da poter verificare l'accuratezza dell'analisi.

A dimostrare la procedura sarà Hirsch, studente universitario AWA che lavorerà nel laboratorio Firestein per l'estate. Per utilizzare il programma bonfire per analizzare le caratteristiche morfologiche del tiff a otto bit di Neurites, è necessario ottenere immagini dei singoli neuroni dopo aver scaricato il programma bonfire. Le impostazioni del programma devono essere regolate in base alla risoluzione dell'immagine delle immagini che si desidera analizzare nella parte dei parametri del falò del programma falò: sostituire il valore corrente per la conversione delle scelte variabili con il valore della risoluzione dell'immagine delle immagini.

Affinché bonfire possa analizzare i dati, i file devono essere organizzati in una struttura specifica, tra cui una cartella master, una cartella bonfire contenente i file bonfire MATLAB M, sottocartelle contenenti ciascuna delle diverse condizioni e i file di immagine delle celle all'interno delle diverse cartelle delle condizioni che iniziano preparando l'immagine per il tracciamento. Per questo esperimento, verranno tracciati solo i dendriti al fine di analizzare i cambiamenti nella morfologia dei dendritici. Inizia preparando l'immagine per il ricalco.

Apri l'immagine selezionando il pulsante Apri sulla barra degli strumenti del neurone J e seleziona l'immagine che desideri tracciare. Ora, ridimensiona l'immagine selezionando il pulsante di ingrandimento per regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine in modo da poter visualizzare tutta l'immagine selezionata da Neurites sulla barra degli strumenti del neurone J, quindi selezionare regola il contrasto della luminosità. Per iniziare il tracciamento, selezionare il pulsante Aggiungi tracce sulla barra degli strumenti del neurone J Traccia attorno al perimetro del corpo cellulare.

Quindi seleziona il pulsante Tracciati etichette sulla barra degli strumenti del neurone J e seleziona N uno dal menu a discesa ID tracciamento, seleziona il tipo zero sei nella finestra degli attributi del neurone J e seleziona OK. Per iniziare a tracciare i neuriti, seleziona il pulsante aggiungi tracce sulla barra degli strumenti del neurone J e aggiungi una traccia lungo ogni ramo di neurite di interesse. È consigliabile che i segmenti disegnati si fermino in corrispondenza di ogni punto di diramazione con ogni punto di diramazione figlio, iniziando da tale punto come nuova traccia.

Seleziona il pulsante Salva tracciati sulla barra degli strumenti Neuron J e salva il tracciato appena creato nella stessa cartella del file immagine originale. Quindi, esporta i file di traccia e i file di identificazione della traccia dal neurone J.Seleziona il pulsante di esportazione della traccia sulla barra degli strumenti del neurone J. Ora seleziona l'opzione file di testo delimitati da schede, file separato per ogni tracciamento, nella finestra di dialogo di esportazione del neurone J e seleziona ok, consenti al neurone J di scegliere i nomi dei file e la posizione di salvataggio.

Selezionare il pulsante Traccia misure sulla barra degli strumenti del neurone J, quindi selezionare l'opzione Visualizza misurazioni tracciati nella finestra Misurazioni neurone J e selezionare Esegui Seleziona file nella finestra Tracciati neurone J, quindi selezionare Salva con nome e salvare il file. Il nome del file deve corrispondere esattamente al nome del file immagine originale, seguito da informazioni di sottolineatura e non deve contenere un'estensione di tre lettere. Verifica che il tuo computer non aggiunga automaticamente un'estensione di file XLS.

In tal caso, l'estensione del file deve essere eliminata manualmente. Innanzitutto, riorganizza le cartelle utilizzando bonfire load aprendo matlab e facendo clic sul pulsante a triplo punto in alto a destra della finestra di comando. Seleziona la cartella del falò nella cartella principale nella finestra Cerca cartella, digita il caricamento del falò nella finestra di comando e premi invio.

Selezionare la cartella delle condizioni che si desidera analizzare nella ricerca della cartella, nella finestra e selezionare. Ok. In questo modo la struttura delle cartelle verrà riorganizzata creando sottocartelle di celle contenenti tutti i dati per ogni singola cella. Ora per creare il nome del file, sottolineatura premium, file swc, digitare bonfire, sottolineatura NDF due s WC nella finestra di comando e premere invio.

Selezionare la stessa cartella delle condizioni che è stata appena riorganizzata con il carico del falò nella finestra Cerca cartella e selezionare. Ok. In questo modo verrà creato un file WC in ogni cartella di celle per la condizione scelta. Ogni cartella di celle conterrà cinque file.

L'immagine TIF originale, il file NDF, le informazioni di sottolineatura, il file di identificazione della traccia, un file TXT e un file swc. Prima di utilizzare Neuron Studio, ti consigliamo di familiarizzare con le funzionalità e le scorciatoie del programma. Hanno un eccellente manuale utente online e conoscere le scorciatoie da tastiera ti farà risparmiare molto tempo.

Per iniziare, apri il programma Neuron Studio e seleziona il file Apri sulla barra degli strumenti di Neuron Studio, trova l'immagine TIF del neurone. Vuoi modificarlo e aprirlo. Selezionare le impostazioni di esecuzione e inserirne una in ciascuna delle tre caselle.

Nella finestra delle dimensioni del voxel, seleziona l'importazione dei file s wc. Selezionare il file WC appropriato che corrisponda al file con cui si desidera lavorare. Il file immagine verrà ora sovrapposto all'immagine di traccia.

Il soma cellulare dovrebbe essere sovrapposto con un cerchio rosso per collegare i neuriti. Usa lo strumento neurite per unire i nodi in modo che ogni punto di diramazione rappresentato da nodi gialli possa creare solo due rami. Tutte le tracce devono essere continue con il soma.

Ora per esportare i dati da Neuron Studio, seleziona il file, salva i neuriti e salva come nome predefinito per verificare la presenza di errori nel tipo di file swc bonfire trace. Accedi alla finestra di comando e premi invio. Selezionare la cartella delle condizioni contenente i dati appena elaborati nella finestra Cerca cartella e selezionare OK se sono presenti errori in una delle immagini nella cartella.

Il programma emetterà immagini che mostrano dove si trova l'errore per estrarre i dati morfologici dai file dot S WC. Digita falò nella finestra di comando e premi invio. Selezionare la cartella delle condizioni che si desidera analizzare nella finestra Cerca cartella e selezionare OK per ciascuno dei neuroni di interesse.

L'analisi del falò genererà un grafico della morfologia neuronale insieme agli anelli delle spalle utilizzati nell'analisi. Inoltre, il comando bonfire genererà il file MAT che contiene tutte le informazioni morfologiche che sono state prese dall'analisi. Per visualizzare i grafici preliminari del tipo di dati bonfire results nella finestra di comando di MATLAB, selezionare la cartella della condizione per la condizione da visualizzare nella finestra di ricerca della cartella e selezionare. Ok.

La finestra Cerca cartella si chiuderà temporaneamente e si riaprirà consentendo la selezione di condizioni aggiuntive. Una volta selezionate le condizioni, selezionare Annulla per uscire dal processo di selezione. Il risultato di Bonfire restituirà grafici riepilogativi che includono i dati dalle cartelle delle condizioni selezionate per esportare i dati morfologici in Excel, tipo bonfire Esporta nella finestra di comando di MATLAB.

Selezionare la cartella delle condizioni contenente i dati che si desidera esportare nella finestra Cerca cartella e selezionare. Ok, bonfire export creerà file Excel dei dati morfologici e li inserirà nella cartella delle condizioni che è stata selezionata. Ora vi mostreremo un esempio dei dati generati dal programma bonfire su un set di dati contenente due condizioni.

Queste sono immagini invertite di esempio di entrambe le condizioni. Da queste immagini si può vedere che la condizione uno contiene più dendriti della condizione due. Questo fenomeno può essere osservato anche in una varietà di grafici generati dal programma del falò.

Poiché il programma del falò esegue la sua analisi sulle sottoregioni dei dendriti, l'aumento dei dendriti nella condizione uno può essere facilmente identificato, tracciando la curva secca dell'albero dendritico totale mostra che ci sono più dendriti distali al corpo cellulare per i neuroni della condizione uno che tracciano il numero medio di punti di ramificazione e punti terminali per cellula mostra che la condizione uno contiene sia più punti di ramificazione che più punti terminali rispetto alla condizione due. Il numero medio di processi per cella è mostrato per i dendriti primari, secondari, terziari o di ordine superiore. Ci sono più dendriti terziari e di ordine superiore per la condizione uno Tracciando il numero medio di processi per cellula per i dendriti radice, intermedia e terminale si vede che la condizione uno ha più processi intermedi o terminali rispetto alla condizione due.

Di seguito sono mostrate le curve di analisi delle secche specifiche per l'identità del segmento in cui i segmenti sono raggruppati come primari, secondari o terziari o maggiori. L'aumento dei dendriti terziari si verifica distalmente al corpo cellulare per i neuroni della prima condizione. Vengono mostrate le curve di analisi della secca specifiche per l'identità del segmento in cui i segmenti sono raggruppati come segmenti radice, segmenti intermedi o segmenti terminali.

L'aumento dei dendriti intermedi e terminali nella condizione uno si verifica distalmente al corpo cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi delle secche utilizzando il programma dei falò per osservare i cambiamenti locali nella neuromorfologia.