In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di embrioni di ratto E16

Ciao, mi chiamo William Ti. Sono del laboratorio Arnold Creek Stein. Oggi, io e gli altri vi mostreremo l'iniezione intrauterina di embrioni di ratto E16. Ciao, mi chiamo Laura Elias.

Oggi vi mostrerò come preparare le pipette per microiniezione e come caricarle per le iniezioni intraventricolari e l'elettroporazione che eseguiremo oggi. Vi mostrerò inoltre come effettuare le iniezioni intraventricolari e l'elettroporazione in embrioni di ratto E16. Le iniezioni e l'elettroporazione in utero sono particolarmente utili nel ratto perché questo sistema non consente facilmente manipolazioni genetiche.

Ok, quindi esiste una serie di strumenti chirurgici che utilizziamo per questa procedura. Utilizziamo un freer, un paio di pinze adiniche, un paio con superficie zigrinata e un altro paio con un piccolo dente all'estremità. Utilizziamo anche un paio di emostatici.

Questo è un paio di forbici, e poi utilizziamo questi due sparachiodi. Questo è quello più grande, che usiamo per i ratti. Questo è quello più piccolo che usiamo per i topi, che impiega chiodi di misura sette, e questo utilizza chiodi di misura nove ed è semplicemente a molla.

Alcune delle cose che utilizziamo qui per assistere durante gli interventi chirurgici includono una semplice sorgente luminosa a fibra ottica con doppia testa. Usiamo un tappetino riscaldato che circola acqua calda al suo interno per mantenere il calore. Come superficie di lavoro, utilizziamo questo sistema di elettroporazione elettiva prodotto da BTX.

Abbiamo diverse misure di spatole che utilizziamo in base alle dimensioni degli embrioni. Il lato blu è il lato positivo. Ora procederemo a smussare le nostre pipette per iniezione.

E questo è molto importante affinché la tua pipetta abbia un'apertura sufficientemente ampia da permettere il caricamento del DNA, ma anche un'estremità molto, molto affilata in modo da non danneggiare l'embrione durante l'iniezione. E se danneggi l'embrione durante l'iniezione, avrai un tasso di mortalità molto più elevato. E quindi questo non va bene.

Questo è quindi effettivamente un processo molto importante in questo tipo di intervento chirurgico. Per prima cosa, verseremo un po' d'acqua su questa pietra smussatrice che ruota qui. Successivamente prenderemo, vediamo un po', solo un bastoncino.

E posizioneremo la nostra pipetta, appena preparata, su questo supporto utilizzando del nastro adesivo. Useremo uno di questi micromanipolatori per tenere la pipetta sul piano inclinato e consentirne l'affilatura. Posizioneremo semplicemente questo dispositivo e utilizzeremo un microscopio per visualizzare la punta della pipetta.

E posizioniamolo semplicemente nell'acqua, sopra la smussatura creata in precedenza, in modo da esercitare una leggera pressione. Come potete vedere, la punta preme contro la pietra qui. Lasciate proseguire la smussatura per un certo periodo, almeno, diciamo, 15 minuti.

Preferisco lasciarli anche per, diciamo, un'ora. A volte diventano davvero, davvero appuntiti, ma dipende sicuramente da persona a persona per quanto tempo smussino le loro pipette. Bene, qui abbiamo, potete vedere in alto una pipetta che è stata tirata ma che non è ancora stata smussata.

Quindi, anche se è appuntita, non presenta alcuna apertura attraverso cui poter caricare il vostro, il vostro DNA. Ora, la pipetta inferiore è stata smussata, e potete vedere questa bella apertura angolata che vi permetterà di caricare il vostro DNA; tuttavia, mantiene comunque una punta affilata, in modo da poter effettuare l'iniezione senza causare danni. Bene, ora riempiremo le nostre pipette di iniezione con il DNA.

Pertanto, è importante che tu prepari il tuo DNA in modo privo di endotossine, in modo da non iniettare alcun lipopolisaccaride insieme al DNA. Prenderemo quindi il nostro DNA e, proprio qui, prepareremo il nostro paraform. Dovrai quindi preparare il tuo paraform e raccogliere il tuo DNA, posizionandolo semplicemente come un piccolo punto su questo param.

E poi prenderemo, di solito prendo, per ogni 10 microlitri del mio DNA, che uso generalmente a una concentrazione di circa 1,5-1,7 microgrammi per microlitro, circa un microlitro di questo colorante fast cream. Questo serve semplicemente per aiutarci a localizzare l'iniezione e assicurarci di aver iniettato con successo nel ventricolo.

Quindi mescolerò rapidamente questo colorante verde con il mio DNA. Poi prenderete l'elettrodo di iniezione e riempiremo la pipetta tirando indietro lo stantuffo. E qui potete vedere che, se la pipetta è corretta e ha un'apertura sufficientemente ampia, il DNA dovrebbe caricarsi abbastanza facilmente.

A volte è necessario spostare avanti e indietro lo stantuffo per favorire un corretto caricamento. In questo modo è possibile caricare la pipetta come mostrato. Abbiamo quindi caricato completamente il DNA in questa pipetta ed è pronta per l'iniezione.

Ok, quindi anestetizzerò l'animale. Utilizziamo questi coni per decapitazione. Arrotolo leggermente il bordo per renderlo più facile da tenere.

Iniziamo. Di solito lo posiziono semplicemente sul bordo della gabbia per creare un piccolo tunnel in cui possa entrare così. Ok, questo animale sembra essere tranquillo.

Procederemo eseguendo una compressione del dito del piede per confermarlo e dovremo semplicemente afferrare il dito, comprimendolo con fermezza. Non troppo forte. Non si vuole ferire l'animale, ma solo accertarsi che sia incosciente.

E questo animale è decisamente in difficoltà. Quindi procederò a rasare il suo addome. Voglio solo evitare il tetano, in modo da non tagliare le estremità.

Ritengo che potrebbe essere molto doloroso per l'animale. Quindi si rade l'animale. Ora lo porterò nella cappa.

La puliremo e inizieremo la procedura. Ok, abbiamo confermato nuovamente che l'animale è incosciente e siamo pronti per pulirla. Voglio applicare un po' di pomata oculare, semplicemente per evitare che gli occhi si secchino.

E poi procederemo alternando lavaggi con dischetti di alcol e dischetti di iodio. Eseguiamo questa operazione tre volte, per un totale di tre passaggi alternati. Dobbiamo essere molto delicati per non danneggiare gli embrioni durante la procedura.

Quindi vuoi semplicemente passare dritto verso il basso, aspettando di tornare indietro. Questo è il numero uno. Devo solo inumidirla bene prima di poter effettuare le pulizie. Bene.

Questo è due e questo è tre. Ok, abbiamo messo questo coperchio per favorire la sterilità e ora procederò ad aprire l'animale. Dunque, iniziamo a tagliare.

Bene, la prima cosa che devo fare è indossare la sterilità. Indossiamo i guanti sterili e siamo pronti per iniziare qui. È sempre necessario verificare che l'animale sia ancora sotto anestesia.

Quindi eseguirò un altro pizzicotto al dito del piede e continueremo a farlo durante tutta la procedura. Di solito procedo pizzicando leggermente un po' di tessuto. Effettuo un'incisione rapida, lo afferro nella parte superiore e taglio verso il basso, prendo l'altra pinza, tengo il tessuto separato.

Quindi si afferra il muscolo desiderato e si taglia lungo la linea mediana in modo da non recidere vasi o nervi. Prestare attenzione a non afferrare troppo. Sembra che in questo caso abbiamo un buon rendimento.

Voglio assicurarmi di mantenerlo ben lubrificato in modo che non si disidrati. E ne farò un altro campione solo per essere sicuro che vada tutto bene e sembra che vada tutto bene. Quindi posiziono sempre questi per Laura, e quello che di solito faccio, o meglio quello che faccio sempre, è posizionare la testa in modo che la testa dell'embrione si trovi sul lato destro della ratto madre, semplicemente per uniformità.

E ora inizierò. Qui possiamo vedere l'embrione. Possiamo osservare la coda e la lente posteriore qui, e la testa più in alto.

Qui stiamo osservando la testa di questo embrione. È possibile vedere la linea mediana rappresentata da questa linea scura. Si distinguono l'emisfero sinistro e l'emisfero destro, oltre al cervelletto.

Ora procederò mirando all'emisfero sinistro durante l'iniezione. Pipettare e iniettare, risalire leggermente ed iniettare il colorante. Ora potete vedere che si sta diffondendo nel ventricolo laterale sinistro.

E quindi sembra un'iniezione riuscita. Bene, ora vediamo che i ventricoli si sono riempiti correttamente. Il colorante è effettivamente passato dal ventricolo sinistro a quello destro.

Quindi abbiamo D e DNA in entrambi i ventricoli. A questo punto, prenderò gli elettrodi per elettroporazione e li posizionerò attraverso il cervello, con un elettrodo positivo sul lato sinistro. In questo modo, il DNA entrerà nei progenitori e nella parete corticale dell'emisfero sinistro.

Ora sto facendo passare la corrente. Quando iniziamo a far passare la corrente elettrica, si osserva della schiuma all'estremità negativa dell'elettrodo. Questo è rassicurante e indica che i contatti sono stati effettuati correttamente.

Ok, ora che abbiamo eseguito l'elettroporazione su questi embrioni, procederò a reinserirli e a suturare l'apertura. Ora le somministrerò 10 ml di antibiotico come sutura chirurgica. Preferisco utilizzare punti a blocco.

Dopodiché, fisseremo la pelle con un agraffatrice cutanea. Va bene? Bene. Le ho somministrato una dose di buprenorfina per assicurarmi che non provi alcun dolore al risveglio. Ora la metterò nell'incubatrice, che la manterrà al caldo mentre riprende conoscenza, in modo da evitare qualsiasi rischio di ipotermia.

Ok, abbiamo appena mostrato come eseguire iniezioni intraventricolari elettroporazione in utero. Nel ratto, è possibile iniettare diverse sostanze. Si può semplicemente iniettare un virus, inclusi lentivirus o retrovirus, direttamente nel ventricolo.

E in questo caso, non sarà necessario eseguire l'elettroporazione perché il virus si integrerà nelle cellule. Se si iniettano plasmidi di DNA, come abbiamo fatto oggi, sarà necessario eseguire l'elettroporazione per far entrare i plasmidi nelle cellule che rivestono il ventricolo. Quindi, è possibile utilizzare questi vettori per diverse possibilità.

È possibile utilizzarli semplicemente per seguire le cellule ed esprimere GFP, permettendo così di osservare la divisione e la migrazione di questi progenitori. È inoltre possibile utilizzare questi vettori per manipolare le cellule. Ad esempio, si possono esprimere hairpin di S-H-R-N-A, e quindi silenziare geni specifici.

È inoltre possibile sovraesprimere geni specifici e, in questo modo, manipolare le cellule che sono state elettroporate o infettate con il virus. Questa tecnica può rivelarsi molto efficace per studiare il ruolo di proteine specifiche nel processo di interesse. Ciò è particolarmente importante per gli studi nel ratto, poiché non è possibile effettuare manipolazioni genetiche nel ratto con la stessa facilità con cui possono essere realizzate nel topo.