Name: Ricapitolazione di una curva Ion Canale IV Uso dei componenti di frequenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Scopri una tecnica innovativa per caratterizzare la risposta in frequenza dei canali ionici nell'elettrofisiologia. Questo metodo consente di misurare simultaneamente più tipi di canali senza agenti farmacologici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of numero Salute concedere R21-HL094828-01 assegnato al Dr. Poelzing.

1. Preparare funzione del rumore e del segnale di ingresso <ol><li> Creare una funzione rumore contenente le componenti di frequenza desiderata. Questo può essere fatto descrivendo i componenti frequenza desiderata nel dominio della frequenza e quindi il calcolo della inversa trasformata rapida di Fourier. In questo studio, 1 - 15 kHz è stato utilizzato. Tutte le trasformate di Fourier e trasformate di Fourier inversa descritto in questo studio sono stati calcolati utilizzando Matlab FFT e funzioni IFFT. </li><li> Scala l'ampiezza della funzione di rumore in modo appropriato. In questo studio la funzione di rumore è stato scalato in modo tale che lo zero a picco di ampiezza della funzione di rumore era 50 o 100 mV. </li><li> Creare un file stimolo con metodi adeguati per il software di acquisizione in uso. Per CLAMPEX 8, prima creare un file di testo con l'intestazione appropriata. Sotto l'intestazione, inserire gli incrementi di tempo per una sola passata nella prima colonna. Gli incrementi di tempo deve avere la stessa spaziatura temporale come l'intervallo di campionamento utilizzato nelle misure. Per ogni spazzare nel protocollo fase di tensione inserire la tensione esatta desiderato ad ogni passo. Questo dovrebbe includere la funzione del rumore. </li></ol> 2. Effettuare misurazioni con la pinza di tensione <ol><li> Creare un protocollo di misura all'interno del software di acquisizione che è compatibile con il file stimolo generato in precedenza. In CLAMPEX, c'è un menu che consente all'utente di associare un file di stimolo con il protocollo corrente. </li><li> Allegare un modello (o biologico) delle cellule alle apparecchiature di misura. </li><li> Eseguire l'esperimento come programmato. A fini di controllo, assicurarsi di includere le misurazioni periodiche che non prevedono alcuna funzione del rumore. </li></ol> 3. Messaggio Esperimento Analisi <ol><li> Calcolare la curva IV per una registrazione individuale. Se la registrazione è a stato stazionario quando la funzione di rumore viene applicata, la curva IV possono essere creati utilizzando una parte allo stato stazionario della registrazione temporalmente al di fuori della gamma della funzione del rumore. Se la registrazione non era in stato stazionario, la funzione di rumore può interferire con il calcolo della curva IV, per cui una seconda registrazione deve essere fatta senza la funzione di rumore presente. </li><li> Per ogni fase di tensione in una registrazione calcolare la trasformata rapida di Fourier della porzione della registrazione in cui è stata inserita la funzione di rumore. Combina la trasformata di Fourier per ogni step di tensione in amxn matrice, dove m è il numero di frequenze in FFT, e n è il numero di passi di tensione. In questa configurazione, ogni riga della matrice rappresenta l'ampiezza di una singola frequenza a tutte le fasi di tensione durante l'esperimento. </li><li> Per ogni frequenza (cioè ogni riga della matrice sopra) correlare la riga con la curva IV generata in 3.1 e registrare il coefficiente di correlazione. </li><li> Tracciare il coefficiente di correlazione vs frequenza per visualizzare frequenze che altamente correlati con la curva IV. Poiché la componente DC è contenuta all'interno la prima frequenza della FFT, il coefficiente di correlazione per questa frequenza dovrebbe sempre essere&gt; 0,99. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Le misurazioni rappresentative morsetto di tensione sono mostrate per una cella modello senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) una funzione di disturbo inseriti nel protocollo fase di tensione. La curva IV è stato calcolato per il modello di cellulare (Figura 1C). Per ogni sweep, nelle registrazioni dalla Figura 1, la FFT è stato calcolato nel periodo di tempo in cui è stata inserita la funzione di rumore (vedi riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolato per le registrazioni Figura 1A e 1B, rispettivamente. Su ispezione visiva, la componente DC (evidenziati in rosso) sembra imitare la forma della curva IV. Senza la funzione di rumore, tutte le frequenze sopra DC sembrano avere ampiezze vicino allo zero (Figura 2A). Quando la funzione rumore viene inserito, frequenze comprese tra 1 e 15 kHz hanno ampiezze visivamente evidente (Figura 2B). La figura 3 mostra il risultato di correlare ampiezze di frequenza individuale su tutta la gamma di gradini di tensione contro la curva IV. Figura 3A-C mostra i coefficienti di correlazione, quando l'esperimento è stato fatto in condizioni di controllo (nessuna funzione rumore) e con ampiezze di rumore di 50 e 100 mV, rispettivamente. Si noti in tutti i casi, la componente DC sembra essere correlata quasi perfettamente con la curva IV. Infatti, per tutte le registrazioni, il coefficiente di correlazione per questa frequenza è stata superiore a 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± deviazione standard). Quando guardiamo figura 3A (condizioni di controllo), non ci sono frequenze oltre alla componente continua la cui ampiezza è correlata in modo significativo con la curva IV. In particolare, nessuna di queste frequenze hanno coefficienti di correlazione superiore a 0,5. Al momento l'inserimento della funzione di ampiezza minore rumorosità (50 mV), queste stesse frequenze ancora coefficienti di correlazione inferiore a 0,5. I coefficienti di correlazione per l'frequenze anche se non sono diventati superiori a 0,5 quando l'ampiezza del rumore è stato aumentato a 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 Modello di Registrazioni Cell: registrazioni morsetto di tensione sono indicati per una cella modello senza (1A) e con (1B) una funzione di rumore compresi nel protocollo fase di tensione. Per i primi e ultimi 20 ms di ogni scansione, il potenziale è stato mantenuto al potenziale tenendo (0 mV). Ogni passo tensione era lungo 80 ms, e la funzione di rumore è stato inserito 40 ms dopo l'inizio del passo. La funzione del disturbo ha una durata di 30 ms e contenuti frequenze comprese tra 1 e 15 kHz. Tensione è stato un passo indietro, -150 a +50 mV con incrementi di 5 mV. Una curva IV per la cella modello è inoltre mostrato (1C). Per rendere le registrazioni più facili da leggere, solo ogni spazzare quinto è stato incluso nella 1A e 1B, ma tutto spazza sono stati inclusi nella 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 FFT delle registrazioni:. La FFT è stato calcolato per la quota di 30 ms di ciascuna scansione in cui la funzione di rumore è da inserire (l'area delimitata dal riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolata senza e con la funzione di rumore, rispettivamente. Ancora una volta, per chiarezza, solo la FFT da ogni scansione quinto è incluso nella figura, ma tutto spazza sono stati utilizzati nei calcoli futuri. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Correlazioni Frequenza IV: I risultati delle correlazioni tra la curva IV di una registrazione e l'ampiezza delle singole frequenze sopra la gamma di gradini di tensione è mostrato. Figure 1A - 1C mostrano il coefficiente di correlazione per frequenze da 0 a 20 kHz in condizioni di controllo, e in presenza di 50 o 100 funzioni di disturbo mV, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Ri-Creazione della Curva IV:. La curva IV della cella modello (lo stesso di Figura 1C) e la grandezza di due frequenze sono stati sovrapposti. La prima frequenza è stata la componente DC (R = 0,995), e il secondo è stato una frequenza scelta a caso con una bassa correlazione (R = 0,3212). Le ampiezze di frequenza sono stati scalati a circa la stessa ampiezza della curva IV.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono ostacoli tecnici che attualmente impediscono ai ricercatori di misurare più tipi di canali ionici in contemporanea con l&#39;intento poi di determinare la quantità di corrente deve essere attribuito a ciascun tipo di canale. A causa di questa limitazione, i canali ionici sono solitamente studiati singolarmente utilizzando tecniche come la tensione, corrente, e l&#39;azione morsetto potenziale. 1 Per studiare i singoli tipi di canali, sistemi di espressione eterologa sono spesso utilizzati. 2 Quando si lavora con le cellule isolate dal tessuto, come cardiomiociti , altri mezzi devono essere utilizzati per bloccare i canali ionici diversi. Per esempio, i canali del sodio può essere inattivato da una rampa lenta di tensione depolarizzanti, 3 canali di potassio verso l&#39;interno rettificazione può essere bloccato con extracellulare BaCl2, 4 e canali del calcio possono essere bloccati con verapamil 5. Un metodo usato che supera in parte questa limitazione è quella di misurare il flusso di corrente attraverso due tipi di canali contemporaneamente, quindi ripetere la misurazione dopo bloccando selettivamente un tipo di canale con un agente adeguato. Sottrazione delle due misurazioni possono quindi essere utilizzate per stimare la quantità di corrente riconducibile al tipo di canale che è stato bloccato. 6 Tuttavia, ci sono due limitazioni principali di questa tecnica. In primo luogo, gli agenti chimici non sono stati identificati in grado di bloccare selettivamente ogni canale ionico, e alcuni farmaci ampiamente utilizzati sono non-specifici interazioni con altri tipi di canale. 5,7 secondo luogo, non può essere determinato da questa tecnica se un canale è modulata da un altro canale. Per esempio, l&#39;espressione eterogenea di Nav 1.5 e Kir 2.1 è stato mostrato in India ventricoli di maiale, ed è stato suggerito che un rapporto sinergico esistente tra i due canali, in modo che più Kir 2,1 espressione nel ventricolo destro deprime velocità di conduzione. Attualmente 8 , questo non può essere verificata. In questo studio, si consiglia di spettroscopia di impedenza può essere un utile strumento per lo studio di più tipi di canali ionici misurate simultaneamente. Anche se il metodo presentato non è mai stato utilizzato per distinguere le correnti da due tipi di canali di misura contemporaneamente, spettroscopia di impedenza è stata utilizzata per studiare una serie di altri aspetti della funzione di canale ionico. Goodman e Art ha dimostrato utilizzando tartaruga cellule ciliate uditive che i protocolli di pinza di corrente può essere modificato per sintonizzare una cella a diverse frequenze, e le oscillazioni del potenziale transmembrana è dovuto ad un interazione tra un interno rettificare K + canale e un canale di Ca 2 +. 9 Han e Frazier ha dimostrato che l&#39;impedenza può essere misurata in una singola cella in un ampio range di frequenze (100 Hz a 5 MHz), e l&#39;aumento di impedenza osservata quando K + o Ca 2 + canali sono stati bloccati potrebbe essere un mezzo semplice per rilevare blocco dei canali in schermi ad alta velocità di droga 10. Hayashi e Fishman hanno usato conduttanza complessi per studiare le proprietà cinetiche di un interno rettificare K + canale. 11 Altri gruppi hanno inserito una singola frequenza nel protocollo morsetto tensione di diversi tipi di canale e ha mostrato che il risposta in frequenza osservata d&#39;accordo con la risposta attesa per alcune frequenze, ma non altri. 12,13 Millonas e Hanck suggerito la ragione per alcune frequenze non ha prodotto la risposta attesa è la presenza di costanti di velocità più nel modello di Markov. 12 Studi come questi, così come altri, hanno dimostrato che vi sono casi in cui le correnti ioniche misurate dai canali ionici, mentre utilizzando la spettroscopia di impedenza non sono d&#39;accordo con la risposta in frequenza teorica. Questo non è un problema in questo studio perché lo scopo del metodo in questo studio è quello di identificare le frequenze che correlano con l&#39;ampiezza indipendente corrente degli assunti alla base del circuito elettrico della membrana. Furtheremore, l&#39;ampiezza della corrente viene calcolata dalle parti di registrazioni che non hanno funzioni di disturbo inseriti al loro interno. Un certo numero di altri studi, anche attuali modelli di canali ionici numerosi espositori numerosi stati condurre e non di conduzione, tutte con le loro costanti ritmo. 14,15,16 Thompson et al ha mostrato che il filtro di selettività del canale KcsA ha diversi siti di legame per il Na +, Li + e K +, ed i costi energetici di spostarsi da un sito di legame a un altro come si muove ioni attraverso il filtro di selettività è ciò che rende il canale preferenziale condotta K + ioni attraverso i suoi pori. 17 In questo lavoro abbiamo inserito una gamma di frequenze (funzione rumore) in un protocollo fase di tensione e cercato le frequenze la cui ampiezza altamente correlato con l&#39;ampiezza di corrente globale. Dal forte evidenza è stato presentato suggerendo costanti di velocità più svolgere un ruolo nella conduzione degli ioni attraverso different canali, l&#39;introduzione delle frequenze associate a questi costanti di velocità può causare certe frequenze di risonanza o altamente correlato con l&#39;ampiezza della corrente, che non sarebbe altrimenti. La tecnica ha dimostrato in questo studio viene eseguita su un modello di cellulare, che è un circuito parallelo RC che di solito è utilizzato per testare i circuiti di tensione morsetto e apparecchiature di acquisizione. Non è previsto che tutte le frequenze oltre DC sarebbe correlato con l&#39;entità attuale, e questo è dimostrato nei nostri dati. Mostriamo anche che l&#39;aggiunta della funzione di rumore non ha causato alcuna frequenza di correlare fortemente con l&#39;ampiezza della corrente. Questi due risultati sono fondamentali perché dimostrano che le apparecchiature di misura e la funzione del rumore per sé, non causa alcun frequenze di correlare con l&#39;ampiezza della corrente. Quando gli studi futuri effettuare la misurazione in membrane contenenti i canali ionici, si prevede che, a seconda del canale utilizzato, le frequenze che corrispondono alle costanti di velocità nel filtro di selettività o, eventualmente, il poro influenzano la risposta in frequenza del canale e influenzano le frequenze che hanno un elevato o bassa correlazione con l&#39;ampiezza della corrente. Poiché questo metodo è una nuova tecnica per lo studio dei canali ionici, ci sono una serie di direzioni studi futuri potrebbero seguire. In primo luogo, la tecnica deve essere utilizzata per caratterizzare la risposta in frequenza di specifici canali isolati. Lavoro in più ha anche bisogno di essere fatto per calibrare le ampiezze di frequenza per le ampiezze di corrente. Una volta di più canali sono caratterizzati individualmente, tipi di canali multipli devono essere misurate simultaneamente. La tecnica potrebbe anche essere adattati per l&#39;uso in morsa del potenziale d&#39;azione, pinza elettrica, e studi di stimolazione del campo. Mentre questa è una nuova tecnica, mostra quello che potrebbe essere un potente strumento per effettuare misurazioni elettrofisiologiche che non erano precedentemente possibili e fornire preziose intuizioni nuove informazioni sul ruolo fisiologico dei canali ionici.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Amplificatore per patch clamp con integrazione</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Testa di lettura</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati a 16 bit</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Cellula modello</td><td>Molecular Devices</td><td>Patch 1 Model Cell</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

ricapitolazione di una curva ion canale iv uso dei componenti di frequenza

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUZIONE: Attualmente, non esistono metodi consolidati per misurare più tipi di canali ionici contemporaneamente e decomporre la corrente misurata in porzioni attribuibile a ciascun tipo di canale. Questo studio dimostra come spettroscopia di impedenza può essere utilizzato per identificare frequenze specifiche che altamente correlato con l&#39;ampiezza stato stazionario corrente misurata durante gli esperimenti clamp di tensione. Il metodo prevede l&#39;inserimento di una funzione di rumore contenenti frequenze specifiche nel protocollo fase di tensione. Nel lavoro presentato, una cellula modello è usato per dimostrare che non elevate correlazioni sono introdotti dal circuito di clamp di tensione, e anche che la funzione di disturbo per sé non introduce alcuna correlazione elevata in assenza di canali ionici sono presenti. La convalida è necessario prima che la tecnica può essere applicata a preparati contenenti canali ionici. Lo scopo del protocollo presentato è quello di dimostrare come caratterizzare la risposta in frequenza di un unico tipo di canale ionico a una funzione di rumore. Una volta frequenze specifiche sono state identificate in un tipo di canale individuale, possono essere utilizzati per riprodurre il costante stato di tensione (IV) della curva. Frequenze che altamente correlati con un tipo di canale e minimamente correlato con altri tipi di canali possono poi essere utilizzate per stimare il contributo attuale di tipi di canali più misurati simultaneamente. METODI: misurazioni con la pinza di tensione sono stati eseguiti su una cella modello utilizzando un protocollo standard passo tensione (-150 a +50 mV, 5mV gradini). Funzioni di disturbo contenenti grandezze uguali di 1-15 kHz frequenze (da zero a ampiezze di picco: 50 o 100 mV) sono stati inseriti in ogni fase di tensione. La componente reale della trasformata rapida di Fourier (FFT) del segnale di uscita è stato calcolato con e senza rumore per ciascun potenziale passo. La grandezza di ogni frequenza in funzione della fase di tensione è stata correlata con l&#39;ampiezza della corrente a tensioni corrispondenti. RISULTATI E CONCLUSIONI: In assenza di rumore (controllo), grandezze di tutte le frequenze eccetto la componente DC scarsamente correlati (| R | &lt;0.5) con la curva IV, mentre la componente DC aveva un coefficiente di correlazione superiore a 0,999 in tutte le misure. La qualità della correlazione tra singole frequenze e la curva IV non cambia quando una funzione di disturbo è stato aggiunto al protocollo fase di tensione. Allo stesso modo, aumentando l&#39;ampiezza della funzione di rumore, inoltre, non ha aumentato la correlazione. Misure di controllo dimostrino che i circuiti morsetto tensione di per sé non causa alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare fortemente con la steady-state della curva IV. Allo stesso modo, le misure in presenza della funzione di rumore dimostrare che la funzione di rumore non provoca alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare con la steady-state curva IV in assenza di canali ionici sono presenti. Sulla base di questa verifica, il metodo può ora essere applicato ai preparati contenenti un singolo tipo di canale ionico con l&#39;intento di identificare le cui frequenze ampiezze correlare specifically con quel tipo di canale.

Ci sono ostacoli tecnici per la misurazione del flusso di corrente attraverso i canali ionici contemporaneamente, e poi discernere quale porzione della corrente transmembrana è dovuto a ogni tipo di canale. Per rispondere a questa esigenza, questo metodo presenta un modo per generare la curva IV di tipo singolo canale utilizzando componenti di frequenza specifica.

Ricapitolazione di una curva Ion Canale IV Uso dei componenti di frequenza

INTRODUZIONE: Attualmente non esistono metodi consolidati per misurare simultaneamente molteplici tipi di canali ionici e scomporre la corrente misurata in...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una tecnica per caratterizzare la risposta in frequenza dei canali ionici al fine di misurare il flusso di corrente attraverso diversi tipi di canali simultaneamente. Questo risultato si ottiene innanzitutto creando la funzione di rumore che verrà inclusa nel protocollo di passo di tensione e integrandola in un file di stimolo, necessario per utilizzare forme d'onda personalizzate con il software clamp X. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'applicare il protocollo di passo di tensione appena creato a una cellula modello utilizzando tecniche standard di voltage clamp in configurazione whole cell e registrare la corrente risultante. Il terzo passaggio della procedura è calcolare la curva I-V della cellula e la FFT della porzione di ciascuna rampa che contiene la funzione di rumore.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel correlare singolarmente l'ampiezza di ciascuna frequenza a tutti i passi di tensione con la curva IV di quella cellula. I risultati mostrano che nessuna frequenza presenta una forte correlazione con la curva IV della cellula modello. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il voltage clamping standard su cellula intera, è che potrebbe fornire un mezzo per misurare contemporaneamente più di un tipo di canale ionico senza l'uso di agenti bloccanti farmacologici o protocolli di inattivazione mediante tensione.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia dei canali ionici, ad esempio quale effetto abbia il livello di espressione di un tipo di canale ionico sull'attività di altri tipi di canali ionici nello stesso tessuto. Il primo passaggio del protocollo consiste nel creare una funzione di rumore contenente le componenti di frequenza desiderate. Per fare ciò, innanzitutto descrivere le componenti di frequenza desiderate nel dominio della frequenza.In questo studio vengono utilizzate componenti di frequenza comprese tra uno e 15 chilohertz. Quindi, calcolare l'inversa veloce della trasformata di Fourier mediante la funzione IFFT di MATLAB per trasformare le frequenze selezionate nel dominio del tempo; successivamente, scalare opportunamente l'ampiezza della funzione di rumore.In questo studio, la funzione di rumore viene scalata due volte: una prima volta in modo che l'ampiezza da zero al picco della funzione di rumore sia di 50 millivolt e una seconda volta in modo che l'ampiezza da zero al picco sia di 100 millivolt. Il passo successivo consiste nel creare un file di stimolo utilizzando un programma come matlab. Un file di stimolo è semplicemente un file di testo con un'intestazione che indica al software di acquisizione clamp X eight esattamente quale tensione utilizzare in ogni istante.Per creare il file di stimolo, inizialmente creare un file di testo con l'intestazione appropriata; sotto l'intestazione, inserire gli incrementi temporali per una singola scansione nella prima colonna. Gli incrementi temporali devono avere lo stesso intervallo temporale dell'intervallo di campionamento utilizzato nelle misurazioni. Questo protocollo utilizza una frequenza di campionamento di 200 kilohertz. Per ogni scansione, inserire le tensioni esatte desiderate a ogni passo temporale.Ogni colonna è considerata una scansione separata, quindi per un protocollo che passa da meno 150 millivolt a più 50 millivolt a incrementi di cinque millivolt, devono essere aggiunte 41 colonne dopo la colonna del tempo. Le tensioni specificate devono includere la funzione di rumore in clamp X. Deve essere creato un protocollo distinto per ogni esperimento; il passaggio successivo consiste quindi nel creare un protocollo di misura compatibile con un file di stimolo generato in precedenza. In clamp X, selezionare l'opzione di menu acquirer edit protocol wave zero, che consente di associare un file di stimolo al protocollo corrente.Il passo successivo consiste nell'applicare lo stimolo definito alla cellula. Questo protocollo utilizza una cellula modello dotata di un circuito RC in parallelo. Collegare la cellula modello all'apparecchiatura di misura, fare clic sul pulsante di registrazione e applicare il clampaggio X da eseguire.L'esperimento è pianificato a scopi di controllo. Assicurarsi di includere misurazioni periodiche che non comprendano alcuna funzione di rumore; dopo aver raccolto i dati, il passo successivo consiste nel generare le curve IV ed eseguire le trasformate rapide di Fourier. Per calcolare la curva IV per una singola registrazione, utilizzare una porzione in stato stazionario della registrazione temporale al di fuori dell'intervallo della funzione di rumore per misurare l'ampiezza della corrente.Se la registrazione non è in stato stazionario quando viene applicata la funzione di rumore, tale funzione potrebbe interferire con il calcolo della curva IV, nel qual caso si dovrebbe utilizzare la registrazione di controllo. Per calcolare invece la curva IV per ogni passo di tensione in una registrazione, calcolare la FFT della porzione della registrazione in cui è stata inserita la funzione di rumore. Combinare la trasformata di Fourier per ogni passo di tensione in una matrice M per N, dove M è il numero di frequenze nella FFT e N è il numero di passi di tensione in questa configurazione.Ogni riga della matrice rappresenta l'ampiezza FFT di una singola frequenza in tutti i passaggi di tensione dell'esperimento. Il passo successivo consiste nel calcolare i coefficienti di correlazione per ciascuna frequenza, correlando la riga con la curva IV generata in precedenza. Registrare il coefficiente di correlazione.Generare successivamente un grafico del coefficiente di correlazione in funzione della frequenza per visualizzare le frequenze che presentano una forte correlazione con la curva IV. Qui vengono mostrati i risultati delle misurazioni con clamp di tensione effettuate senza l'inserimento di una funzione di rumore. Nei primi e negli ultimi 20 millisecondi di ogni sweep, il potenziale è stato mantenuto al potenziale di holding di zero millivolt.La tensione è stata aumentata a passi da meno 150 millivolt a più 50 millivolt, con incrementi di cinque millivolt. Ogni passo di tensione aveva una durata di 80 millisecondi; per rendere la figura più facile da leggere, è stato incluso solo ogni quinto tracciato. Il riquadro rosso indica il momento in cui sarebbe stata applicata la funzione di rumore, qualora fosse stata presente una funzione di rumore in questi tracciati.Questa figura è simile alla precedente, ma con la funzione di rumore inserita nel protocollo di passo di tensione 40 millisecondi dopo l'inizio del passo di tensione; il riquadro rosso indica il punto in cui è stata inserita la funzione di rumore. La funzione di rumore aveva una durata di 30 millisecondi e conteneva frequenze comprese tra 1 e 15 chilohertz. Questa figura mostra la curva IV calcolata per la cellula modello.Questa curva IV è lineare, come previsto, poiché la cellula modello è un semplice circuito RC in parallelo. Questa figura mostra il risultato della FFT senza la funzione di rumore per ogni sweep. Nei tracciati della cellula modello, la FFT è stata calcolata nell'intervallo temporale in cui era inserita la funzione di rumore.La componente in continua (DC), evidenziata in rosso, sembra riprodurre la forma della curva IV. Tutte le frequenze al di sopra della DC sembrano avere ampiezze prossime a zero; per chiarezza, nel grafico è inclusa solo la FFT di ogni quinta scansione. Quando la FFT viene calcolata per le registrazioni con la funzione di rumore inserita, le frequenze comprese tra 1 e 15 chilohertz presentano ampiezze apprezzabili. La presenza di queste frequenze più elevate, che normalmente non sono presenti negli esperimenti di voltage clamp, pone il quesito se l'ampiezza di una di queste frequenze cambi in proporzione all'ampiezza della corrente.Queste tre figure successive mostrano il coefficiente di correlazione tra l'ampiezza della singola frequenza e la curva IV della registrazione. Nella prima figura, non viene utilizzata alcuna funzione di rumore. Nella seconda figura, la funzione di rumore aveva un'ampiezza di picco di 50 millivolt, mentre nella terza figura la funzione di rumore aveva un'ampiezza di picco di 100 millivolt.Si noti che in tutti i casi la componente continua, in altre parole la risposta a zero hertz, presenta un coefficiente di correlazione superiore a 0,99 e appare quindi correlata quasi perfettamente con la curva IV. Inoltre, si osservi che in tutte e tre le figure nessuna delle altre frequenze presenta coefficienti di correlazione superiori a 0,5. In aggiunta, l'inserimento della funzione di rumore con ampiezza di 50 o 100 millivolt non ha modificato questo andamento.Questi risultati indicano che la circuitazione del voltage clamp e la funzione di rumore stessa non introducono elevate correlazioni nella curva I-V. Questa verifica è importante per applicare questa tecnica a preparati contenenti canali ionici. Questa figura riproduce la curva I-V per mostrare la correlazione o la mancanza di essa in due insiemi di dati di frequenza.La curva IV per la cellula modello indicata come IV reale in questa figura è la linea tratteggiata che sembra sovrapporsi alla linea rossa tratteggiata. La linea rossa tratteggiata mostra la componente continua, che presenta un coefficiente di correlazione di 0,995 rispetto alla linea IV reale. La terza curva, rappresentata dalla linea irregolare, mostra una frequenza scelta casualmente di 4,399 kilohertz con bassa correlazione.Il coefficiente di correlazione tra questa linea e la curva IV è 0,3212. Questi risultati indicano che l'apparato di misura e la funzione di rumore non causano di per sé alcuna correlazione tra frequenze e ampiezza della corrente. Sulla base di questa verifica, il metodo qui presentato, che prevede l'inserimento di una funzione di rumore nei passi di tensione durante esperimenti di voltage clamp, può essere applicato inizialmente a preparati di membrana contenenti un singolo tipo di canale ionico e successivamente a preparati contenenti più tipi di canali. I risultati ottenuti negli esperimenti con singolo canale ionico possono essere analizzati mediante FFT e analisi di correlazione come proposto in questo studio.Questa analisi può essere utilizzata per identificare le frequenze le cui ampiezze correlano specificamente con quel particolare tipo di canale. Sono state presentate solide evidenze che suggeriscono come diverse costanti di velocità svolgano un ruolo nella conduzione degli ioni attraverso canali diversi. Pertanto, una volta identificate le frequenze, queste correlano fortemente con un tipo di canale e minimamente con altri tipi di canali.Queste frequenze possono quindi essere utilizzate per stimare contemporaneamente il contributo attuale di più tipi di canali misurati seguendo questa procedura. Altri metodi, come il blocco farmacologico e i preimpulsi, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come si comporta la risposta in frequenza dei canali quando un canale ionico si trova in una conformazione bloccata o inattiva.

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